siRNA干擾整合素β4的表達(dá)對(duì)MDAMB231乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

HainanMedHainanMedJ，Dec．2013，V01．24,No．23 海南醫(yī)學(xué)2013年12月第24卷第23期doi：10．3969／j．issn．1003—6350．2013．23．1430siRNA干擾整合都4的表達(dá)對(duì)MDA—MB一231乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響曹穎，吳倩，文建力，童英(貴州省人民醫(yī)院病理科，貴州 貴陽(yáng)550002)【摘要】目的采用RNA干擾(SmallinterferenceRNA，siRNA)技術(shù)抑制MDA．MB-231乳腺癌細(xì)胞中整合素觶(integrin／34)基因表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。方法選用MDA．MB-23l乳腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默癌細(xì)胞Integrin／34mRNA的表達(dá)，Real．timePCR和Westernblotting方法分別檢測(cè)未轉(zhuǎn)染integdnfl4siRNA的乳腺癌細(xì)胞組(簡(jiǎn)稱空白對(duì)照組)及轉(zhuǎn)染integfin／34siRNA的乳腺癌細(xì)胞組(簡(jiǎn)稱Integrin／34RNA干擾組)的Integrin／34mRNA和蛋白表達(dá)水平；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞的侵襲及遷移能力。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，Integrin／34RNA干擾組Integrinl34的mRNA及蛋白表達(dá)水平分別降低了86％(P<0．01)和89％(P<0．01)，細(xì)胞侵襲和遷移能力下降(P<O．05)。結(jié)論應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)抑制Integrin_84表達(dá)可使MDA．MB．231細(xì)胞遷移及侵襲能力降低，提示IntegrinB4在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用?！娟P(guān)鍵詞】乳腺癌細(xì)胞；整合素彤；侵襲；遷移【中圖分類號(hào)】R737．9 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】 1003---6350(2013)23—3433—04InfluenceofsiRNAsilencingintegrin盧4expressiontheabilityofinvasionandmigrationinbreastMDA—bib一231cellline．CA0Ying,WUQian,WENJian-li，TONGYing．DepartmentofPathology,GuizhouProvincmlPeople"sHospital,Guiyang550002，Guizhou,CHINA【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofinhibitedintegrin／34bysmallinterferenceRNA(siRNA)ontheabilityofinvasionandmigrationinbreastMDA·MB一231cellline．MethodsThebreastMDA-MB一23lcelltineswereselected．Integrin／34genewassilencedbyRNAinterferencetechnique，theexpressionsofintegrin／34atmRNAandproteinlevelsinMDA—MB——23lcellsnottransfectedwiththeintegrin／34(blankcontrols)andMDA-MB一231cellstransfectedwiththeintegrin／34siRNA(integrinl34siRNA)werestudiedbyreal—timePCRandwesternblotting，respectively．TheabilityofinvasionandmigrationweremeasuredthroughTranswell．ResultComparedwiththeblankcontrols，theexpressionsofintegrin／34atmRNAandproteinlevelsinintegrin／34siRNAweredecreasedby86％(P<0．01)and89％(P<0．O1)，respectively,andtheabilityofinvasionandmigrationwerealsodecreasedfP<O．05)．ConclusionSilencingofintegrinf14impairstheabilityinvasionandmigrationofbreastcell，suggestingthatintegrin／34mayplaykeyroleintheinvasivenessandmetastasisofbreast【Keywords】Breastcell；Integrin／34；Invasion；Migration乳腺癌是嚴(yán)重危害女性身心健康的常見(jiàn)惡性腫 鍵的角色n屯，；其可能參與了調(diào)節(jié)乳腺癌遷移、侵襲的瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率明顯上升。遷移浸潤(rùn)是癌細(xì) 關(guān)鍵信號(hào)通路p31。為探討Integrin134在乳腺癌浸潤(rùn)胞惡性程度的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，具有高遷移浸潤(rùn) 轉(zhuǎn)移中的作用，本研究采用體外合成的小干擾RNA能力的乳腺癌容易復(fù)發(fā)，預(yù)后不良。腫瘤的侵襲機(jī) (SmallinterferenceRNA，siRNA)抑制MDA-MB一231制極為復(fù)雜，包括腫瘤細(xì)胞的脫離、侵入、附著、侵 乳腺癌細(xì)胞Integrin／34的表達(dá)，觀察其對(duì)癌細(xì)胞侵襲出、血管生成及其生長(zhǎng)。整合素(Integrin)是粘附分 和遷移能力的影響。子中的一類，由a,／3亞單位經(jīng)非共價(jià)鍵連接而成的異 1材料與方法二聚體跨膜糖蛋白。研究顯示，Integrin／34(即Integ— 1．1 主要材料源于人的MDA．MB一231乳腺rinet6／34，簡(jiǎn)稱Integrin／34)可能在腫瘤進(jìn)展中起到關(guān) 癌細(xì)胞株購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室；1640培基金項(xiàng)目：貴州省科技廳科研項(xiàng)目(編號(hào)：黔科合J字[201112121號(hào))；貴陽(yáng)市科技局科研項(xiàng)目(編號(hào)：筑科合同[2011103137號(hào))通訊曹穎。E-mail：caoyin90417@163．corn·3433·萬(wàn)方數(shù)據(jù)海南醫(yī)學(xué)2013年12月第24卷第23期海南醫(yī)學(xué)2013年12月第24卷第23期HainanMedJ，Dee．2013，Vol。24,No．23養(yǎng)基、胎牛血清、0．25％胰酶購(gòu)于HyClone公司；兔 Integrin／34腳．a(chǎn)ctin蛋白表達(dá)。結(jié)果用GDS一8000型抗人多克隆抗體Integrin／34(SC一9090)、辣根過(guò)氧化 uVP凝膠成像系統(tǒng)照像，以Labworks軟件分析結(jié)果物酶(HRP)標(biāo)記的驢抗兔二抗(sc一2313)和驢抗鼠 時(shí)以p．a(chǎn)ctin蛋白條帶作為內(nèi)參照，計(jì)算Integrinfl4蛋二抗(sc一2314)、siRNA(sc一35678)、siRNA陰性對(duì)照 白條帶與屆．a(chǎn)ctin蛋白條帶像素灰度的百分比值作為(SC一37007)、siRNA熒光質(zhì)控(sc一36869)、siRNA轉(zhuǎn)染 蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。試劑(SC一29528)及siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(sc一36868)均購(gòu) 1．2．5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力于SantaCruz公司；鼠抗人口一actin單克隆抗體1．2．5．1Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染同實(shí)驗(yàn)(A-1987)購(gòu)于Sigma公司；SYBPGreenMix購(gòu)自ABI1．2．2，轉(zhuǎn)染48h后，常規(guī)消化細(xì)胞，PBS洗兩遍，用含公司；Real．timePCR引物由上?；倒竞铣?；0．I％FBS的無(wú)血清培養(yǎng)基混懸、稀釋，調(diào)整細(xì)胞密度Transwelld、室購(gòu)于美國(guó)ComingCostar公司；Matrigel至l×105個(gè)／ml。取細(xì)胞懸液200ul加入至已鋪膠購(gòu)于BD公司；結(jié)晶紫溶液購(gòu)于Sigma公司。Matrigel膠的8岬孔徑Transwelldx室上室，將600肛l1．2方法 含5％FBS的1640培養(yǎng)基加入下室，37℃、5％CO：培1．2．1細(xì)胞培養(yǎng)及分組用含10％胎牛血清、 養(yǎng)24h后，取出Transwelldx室，棉簽擦去室內(nèi)未轉(zhuǎn)移1％雙抗(青霉素100U／mL，鏈霉素100U／mL)的1640細(xì)胞，95％酒精固定5min，結(jié)晶紫溶液染色，PBS洗培養(yǎng)液，5％CO：、37℃培養(yǎng)MDA—MB一231細(xì)胞。細(xì)2遍，顯微鏡下觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野，細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)胞分組為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Integrin／34RNA驗(yàn)重復(fù)3次。干擾組。1．2．5．2Transwell遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室不1．2．2 siRNA的轉(zhuǎn)染 生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用 進(jìn)行Matrigel膠包被，其余實(shí)驗(yàn)步驟同Transwell侵襲0．25％胰蛋白酶消化傳人六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其匯實(shí)驗(yàn)。合度達(dá)80％時(shí)按SantaCruz公司轉(zhuǎn)染說(shuō)明書按不同 1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每組所得結(jié)果用均數(shù)-4-標(biāo)準(zhǔn)比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染siRNA熒光質(zhì)控，根據(jù)熒光值摸索和 差(孤)表示，結(jié)果應(yīng)用SPSS15．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因優(yōu)化siRNA的轉(zhuǎn)染條件。再分別轉(zhuǎn)染Integrin／34 素方差分析，組間比較采用g檢驗(yàn)進(jìn)行處理，P<0．05siRNA、siRNA陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染后6h換正常培養(yǎng)基繼 或P<0．01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，并設(shè)未轉(zhuǎn)染組作為空白對(duì)2結(jié)果照，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孑L，重復(fù)3次。2．1轉(zhuǎn)染Integrin膽siRNA后Integrin膽mRNA1．2．3 Real．timePCR方法檢測(cè)Integrin肼mRNA 及蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較，Integrin觶表達(dá)水平Trizol一步法提取各組細(xì)胞總RNA，取RNA干擾組Integfin／34mRNA和蛋白表達(dá)水平分3pgRNA樣品逆轉(zhuǎn)錄eDNA，以cDNA產(chǎn)物為模板 別下降86％(圖1A)和89％(圖1B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行Real．timePCR(SYBRGreenI嵌合熒光法)。 意義(P<0．01)；轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較ABl7300型熒光定量PCR儀采集Integfin／34基因及 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；說(shuō)明已將Integrin／34siRNA轉(zhuǎn)內(nèi)參照屆．a(chǎn)ctin擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號(hào)，以AppliedBio— 入MDA．MB一231細(xì)胞，且抑制了Integrin／34mRNAsystemsSDSl4．0軟件進(jìn)行熒光采集和數(shù)據(jù)分析。 和蛋白水平的表達(dá)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Integrin／34基因沉默SDS14．0軟件分析其ACt值及RQ(Relativequantity) 細(xì)胞構(gòu)建成功。值，RQ=2一ACt。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)以屆一actin為內(nèi)對(duì) 2．2轉(zhuǎn)染Integrin／34siRNA后細(xì)胞侵襲和遷照，計(jì)算Integrin／34mRNA和對(duì)照組的相對(duì)水平。 移能力變化Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陰Real．timePcR引物序列、PCR產(chǎn)物片斷見(jiàn)表l。 性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表1Real—timePCR引物序列及PCR產(chǎn)物片斷 Integrin／34RNA干擾組與其他兩組比較，穿膜細(xì)胞基因 引物序列 擴(kuò)增產(chǎn)物 數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05，圖2A)；Integrin出上游5’TCATCAAGGAGCAAGCCAGA3’ 273bp Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組與空下游3’CCGCAGGAGC論AGTCAAC5。 白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Integrin／34RNA口一actin上游5’ACTGGAACGGTGAAGGTGACA3。60bp干擾組與其他兩組比較，遷移細(xì)胞數(shù)減少，差異具下游3’ATGGCAAGGGACTTCCTGTAAC5’有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05，圖2B)。結(jié)果表明，siRNA1．2．4 WesternBlotting方法檢測(cè)Integfin／34蛋 干擾Integrin肼基因表達(dá)后細(xì)胞的侵襲和遷移能力白表達(dá)水平WesternBlotting方法檢測(cè)各組細(xì)胞下降?！?434·萬(wàn)方數(shù)據(jù)海南醫(yī)學(xué)2013年12月第24卷第23期啪 海南醫(yī)學(xué)2013年12月第24卷第23期啪 O口空白對(duì)照紐{|||| 呂衄 照性哆纖小．4 組W O 口轉(zhuǎn)染例性對(duì)j!{{組奎濤_豈白染昭 衄integrin／34SiRNA㈨ )∞ )∞ )如 )o 丁n㈠㈠㈠U T囫M∽∽川u 樂(lè)曲 )一乏、『長(zhǎng)一L強(qiáng)矗善蓼三 ，．|l_llllllloll，-Ill，}。上 ^∽M∽M幽integrin阻●——，——。fi-Actin崎嚏魚蔓一A B圖1轉(zhuǎn)染Integrinfl4siRNA后Integrinfl4mRNA(A)及蛋白(B)表達(dá)水平壤 針㈨嘲 Ⅻ舊¨如啪一 r---'l空l(shuí)‘I對(duì)_}!{{組四轉(zhuǎn)染陰中i：對(duì)照組∞ ㈣一空輪m自染鋁差；卅．c嘲時(shí)膽照姘紕W 皿皿integrinf；4SiRNA印I_l¨ 鯽_∞_ ∞∞一 一≯二，乓掣磊淫吲 ∞ 一琶}v『，掣熹丟{!一^㈠㈠㈠U一南剴M幽一曷目*贏㈣～?！觃 加。一一A B圖2轉(zhuǎn)染Integrin[34siRNA后細(xì)胞侵襲(A)和遷移能力(B)變化注：+表示與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<O．05)。3討論 于細(xì)胞膜，導(dǎo)致半橋粒結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞骨架重構(gòu)，腫瘤自1992年HynesH1首先提出細(xì)胞表面整合素的變 細(xì)胞脫離基底膜，失去極性。增高、游離的整合素口4化較細(xì)胞外基質(zhì)成分更能反映腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞黏 扮演著重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)附特性及對(duì)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用以來(lái)，整合素表達(dá) 通路，這時(shí)的細(xì)胞往往表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖能力、遷移改變與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系備受重視。大量研 力和侵襲力。究均證明，整合素在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮著 Integrin／34在鱗癌、乳腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、結(jié)重要作用01。目前認(rèn)為，整合索在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中 直腸癌和胃癌中的表達(dá)水平均明顯增高，而且與腫瘤主要起兩個(gè)方面的作用：①整合素介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和細(xì) 細(xì)胞的惡性程度相關(guān)。在乳腺癌中，Integrind邱4與胞外基質(zhì)的粘附，可改變基質(zhì)的成分，調(diào)節(jié)基質(zhì)生物學(xué) 癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但其作用機(jī)制還不清楚。在功能，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。②整合素介 轉(zhuǎn)移性乳腺癌中IntegrinoW、口3高表達(dá)，Integrind6．／3導(dǎo)的異常信息從細(xì)胞外基質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)傳遞，促進(jìn)了腫 4N表達(dá)意味著乳腺癌預(yù)后差口，。我們對(duì)不同分子亞瘤細(xì)胞失控制性生長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞的去分化與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn) 型乳腺癌中Integrin／34表達(dá)研究也顯示：具不良預(yù)后移。目前研究認(rèn)為整合素O／亞單位與基質(zhì)特異性粘附 的三陰性乳腺癌和HER2型乳腺癌Integrin／34呈高表有關(guān)，屆亞單位則可能與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)功能有關(guān)陋，。 達(dá)趨勢(shì)(數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的體外實(shí)Integrin／34亞單位和“6亞單位組成異二聚體，是驗(yàn)研究也顯示：由Integrin／34介導(dǎo)的細(xì)胞間及與細(xì)胞上皮細(xì)胞半橋粒的主要結(jié)構(gòu)分子。半橋粒是上皮細(xì)外基質(zhì)的相互作用等信號(hào)事件在乳腺腫瘤形成、生長(zhǎng)、胞“錨釘”于基質(zhì)上的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其主要作用是將上皮侵襲、轉(zhuǎn)移諸多過(guò)程中起了重要作用。本研究通過(guò)細(xì)胞錨定在基底膜上，防止機(jī)械力造成的細(xì)胞與基底siRNA方法選擇性下調(diào)Integrin觶的表達(dá)，可使高侵襲膜脫離。在多種組織來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞中，整合素性乳腺癌細(xì)胞株MDA—MB一231遷移及侵襲能力降低，口4的表達(dá)水平增高，并且脫離半橋粒結(jié)構(gòu)，游離分布提示Integrin肼在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用?！?435．萬(wàn)方數(shù)據(jù)海南醫(yī)學(xué)2013年12B第24卷第23期 Hainan海南醫(yī)學(xué)2013年12B第24卷第23期 HainanMedJ'Dec．2013，Voi．24,No．23doi：10．3969／j．issn．1003～6350．2013．23．1431 ·論不同劑量鏈脲佐菌素建立妊娠糖尿病小鼠模型穩(wěn)定性比較雷晨1，張婕2，王琦3(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院教學(xué)工作辦公室1、檢驗(yàn)中心2、肝膽外科3，寧夏銀川 750004)【摘要】目的探討鏈脲佐菌素方法建立妊娠糖尿病小鼠模型中不同給藥劑量對(duì)成模率及穩(wěn)定性的影響。方法將40只C57BL／6J孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(10只)和實(shí)驗(yàn)組(鏈脲佐菌素低、中、高劑量組，每組lO只)，對(duì)照組一次性腹腔注射等劑量的檸檬酸緩沖液，實(shí)驗(yàn)組分別予一次性腹腔注射現(xiàn)配鏈脲佐菌素溶液20mg／kg、50mg／kg、100mg／kg，之后均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水。分別于妊娠第3、10、18天測(cè)空腹血糖與體質(zhì)量，并觀察飲水量與尿量變化，比較孕鼠成模情況。結(jié)果20mg／kgSTZ注射組成模率為40％，50mg／kg鏈脲佐菌素組成模率為70％，100mg／kgSTZ注射組成模率為50％?？崭寡桥c對(duì)照組相比較其高血糖狀態(tài)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，且體質(zhì)量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<O．05)。結(jié)論鏈脲佐菌素50mg／kg腹腔注射C57BL／6J孕鼠是建立妊娠糖尿病小鼠模型的最佳劑量，具有較好的穩(wěn)定性?！娟P(guān)鍵詞】鏈脲佐菌素；妊娠糖尿??；小鼠；模型【中圖分類號(hào)】R-332 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】 1003--6350(2013)23—3436_-03Comparisonthestabilityofthemousemodelofgestationaldiabetesestablisbedbydifferentdosesofstreptozotocin．LEIChenl，Zhangfie2．WANGQi3．TeachingOff-zcei．ClinicalLaboratory2。DepartmentofHepatobiliarySurgeryJ，GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004，Ningxia，CHINA【Abstract】0bjeetiveToinvestigatetheeffectofdifferentdosesofstreptozotocin(STZ)onthestabilityofthemousemodelofgestationaldiabetesestablishedbystreptozotocin．MethodsFortyC57BL／6Jpregnantmicewererandomlydividedintothecontrolgroup(10mice)andthestreptozotocingroup(20mg&gSTZgroup，50m眺gSTZgroupand100mg／kgSTZgroup，eachwith10mice)．Themicewereinjectedintraperitoneallywithequaldoseofcitratebuffer,STZsolution20mg／kg，50mg／kg，100mg／kg，respectively,accordingtotheirassignedgroups，and基金項(xiàng)目：寧夏自然科學(xué)基金(編號(hào)：NZl214、NZ07101)；寧夏科技公關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：2009年)通訊雷晨。E—mail：leichen@medmait．tom．ca一般認(rèn)為，Integrin是通過(guò)各種信號(hào)途徑把細(xì)胞 為乳腺癌藥物開(kāi)發(fā)的候選靶點(diǎn)提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。外的信號(hào)傳人細(xì)胞內(nèi)，再通過(guò)激酶鏈(MAPKJJNK)傳 參考文獻(xiàn)人細(xì)胞核，調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)。同 【l】WilhelmsenK，LitjensSH，SonnenbergA．Multiplefunctionsoftheintegrina6f14inepidermalhomeostasisandtumorigenesis[J】．Mol時(shí)細(xì)胞外的信號(hào)傳到細(xì)胞骨架蛋白引起細(xì)胞變形、移CellBiol，2006，26(8)：2877—2886．動(dòng)。信號(hào)傳導(dǎo)有以下途徑：(1)對(duì)黏著斑蛋白激酶(Fo．【2】LipscombEA，SimpsonKJ，LyleSR，eta1．Thealpha6bem4integrincaladhesionkinase，F(xiàn)闌的激活；(2)對(duì)整合素連接蛋maintainsthesurvivalofhumanbreastca