DB37-T 4044-2020 禽腺病毒4型熒光定量PCR檢測方法-（高清版）

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DB37山 東 省 地 方 標 準DB37/T4044—2020禽腺病毒4型熒光定量PCR檢測方法Real-timePCRassayforthedetectionoffowladenovirusserotype420202020070920200809山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實施。本標準由山東省畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。本標準起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)家禽研究所。本標準主要起草人：孟凱、吳家強、袁小遠、宋敏訓(xùn)、張玉霞、楊金興、艾武、亓麗紅。禽腺病毒4型熒光定量PCR檢測方法范圍（FAdV-4）PCRFAdV-4GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法劇減弱。隨著PCR反應(yīng)的進行，每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。4試劑或材料除非另有說明，在分析中僅使用分析純的試劑，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。10PBS：pH7.2DNA劇減弱。隨著PCR反應(yīng)的進行，每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。4試劑或材料除非另有說明，在分析中僅使用分析純的試劑，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。10PBS：pH7.2DNASYBRGreenIqPCR1.0×105拷貝/μLDEPC5儀器設(shè)備10μL、20μL、100μL、1000μL16000r/min。0.01g。5.4PCR4.0℃～99.95.5-205.6引物P1：5’-GTCTATACCAACACGAGCACC-3’P2：5’-TTTTGTACCCGTCGCAGAG-3’樣品棉拭子，剪刀，鑷子，1.5mL離心管。3（2U/mL2mg/mL）10×PBS（pH7.2）1.5mL（青10000U/mL10mg/mL）PBS待檢禽無菌采集整個肝臟，裝入一次性采樣袋或其他滅菌容器，編號。h-20℃冰箱保存。/15m4500r/min離心10min1.5mL將組織置于滅菌的研缽中，按照質(zhì)量體積比（1：5～10）加入滅菌PBS進行充分研磨，4℃條件下5000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管中，編號備用。8試驗步驟DNA用病毒DNA提取試劑盒，按照說明書步驟提取待檢樣品的DNA。病毒DNA提取成功后置于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR詳見表1。表1熒光定量PCR反應(yīng)體系試劑使用量SYBRGreenIqPCR混合物*10μLPCRForwardPrimer(10μmol/L)1μLPCRReversePrimer(10μmol/L)1μLDNA模板2μLDEPC水6μLTotal20μL每次均應(yīng)設(shè)陰性對照。*內(nèi)含DNA聚合酶，dNTPMixture，Mg2+和熒光染料SYBRGreen。8.3熒光定量PCR反應(yīng)程序設(shè)定詳見表2。表2熒光定量PCR反應(yīng)程序設(shè)定階段1：預(yù)變形階段2：PCR反應(yīng)階段3：溶解曲線分析95℃，1min95℃，5sec95℃，5sec60℃，45sec（收集熒光）65℃，5sec1Cycle40Cycle95℃，5sec9結(jié)果判定9結(jié)果判定閾值設(shè)定原則：根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點為準。Ct（Cp）A.1）Ct（Cp）35，（A.2）陰性無Ct（或Cp）值并且無擴增曲線，表明樣品中無FAdV-4。陽性C（Cp35Tm8FAd4.9.3.3有效原則Ct（或Cp）值＞35的樣品須復(fù)檢，重做結(jié)果無Ct值者為陰性，否則為陽性。附錄A（資料性附錄）/