現(xiàn)代微生物遺傳學(xué)第三章質(zhì)粒

第一節(jié)質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)和命名質(zhì)粒：存在于細(xì)菌、真菌等微生物細(xì)胞中、獨(dú)立于染色體外、能進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。對于宿主，一般是非必需的通常是共價(jià)(covalent)、閉合(closed)、環(huán)狀(circular)雙鏈DNA.(但也有例外：線狀DNA，RNA)附加體：整合在染色體上，或游離，并能攜帶宿主的染色體基因。第一頁，共二十八頁。一、質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)F質(zhì)粒(1946年)，第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒20世紀(jì)50-70年代：抗性質(zhì)粒的大量研究，以及其他質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)20世紀(jì)70年代后，質(zhì)粒廣泛應(yīng)用于遺傳工程和分子生物學(xué)研究中。第二頁，共二十八頁。二、質(zhì)粒的命名原則最初發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒由研究者根據(jù)表型、大小等特征自行命名。(F因子、R質(zhì)粒、Col質(zhì)粒等)1976年Novick提出了質(zhì)粒命名原則：質(zhì)粒名稱一般由三個(gè)英文字母及編號組成；第一個(gè)字母一律小寫p表示（plasmid）后兩個(gè)字母要大寫，可以采用發(fā)現(xiàn)者人名、實(shí)驗(yàn)室名稱、表型性狀或其他特征的英文縮寫。編號為阿拉伯?dāng)?shù)字，用于區(qū)分同一類型的不同質(zhì)粒。(pUC18,pUC19等)第三頁，共二十八頁。第二節(jié)質(zhì)粒編碼的遺傳表型大多數(shù)質(zhì)粒均控制著宿主細(xì)胞的一種或幾種特殊性狀，具有一定的表型，質(zhì)?？梢罁?jù)其表型不同可劃分為以下幾類：1.致育質(zhì)粒2.抗藥性質(zhì)粒組成：轉(zhuǎn)移區(qū)和抗性決定子抗藥的機(jī)制：改變抗生素作用的靶點(diǎn)；修飾抗生素；組織抗生素進(jìn)入；產(chǎn)生一種酶能代替宿主細(xì)胞中被抗生素作用的靶點(diǎn)。第四頁，共二十八頁。3.產(chǎn)生抗生素的質(zhì)粒細(xì)菌素：細(xì)菌產(chǎn)生的一般只能抑制或殺死種內(nèi)不同亞種或菌株中敏感細(xì)菌的特殊多肽類代謝產(chǎn)物。Col質(zhì)粒：10種，有非接合型和接合型之分。4.產(chǎn)生毒性的質(zhì)粒(BT)5.降解質(zhì)粒：假單胞菌屬是一類能廣泛利用有機(jī)化合物進(jìn)行生長的細(xì)菌。其體內(nèi)含有大量的降解質(zhì)粒。6.致病性質(zhì)粒：根癌土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒；以及破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌和大腸桿菌等都存在致病性質(zhì)粒。第五頁，共二十八頁。7.共生固氮質(zhì)粒根瘤菌普遍喊有該類質(zhì)粒。包括共生質(zhì)粒和非共生質(zhì)粒，非共生質(zhì)粒對共生作用可有正或負(fù)的調(diào)節(jié)作用。8.隱蔽質(zhì)粒(crypticplasmid)酵母的2m質(zhì)粒（p171）長為2m的6kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子位于酵母細(xì)胞核內(nèi)，50~100拷貝只攜帶與復(fù)制和重組有關(guān)的4個(gè)基因，無遺傳表型質(zhì)粒上有兩個(gè)600bp長的IR，被一個(gè)2.7kb區(qū)域和一個(gè)2.3kb小區(qū)域所間隔兩個(gè)IR上都有一個(gè)專一重組位點(diǎn)(FRT)，經(jīng)過重組，可使質(zhì)?；プ儺悩?gòu)成A型和B型。第六頁，共二十八頁。第三節(jié)質(zhì)粒的檢測檢測質(zhì)粒的方法主要根據(jù)質(zhì)粒的（遺傳學(xué)特性）和（分子結(jié)構(gòu)特性）。遺傳特性：獨(dú)特的表型、轉(zhuǎn)移、人為消除等。分子結(jié)構(gòu)：cccDNA和染色體相比對理化因子有更強(qiáng)的抗性。第七頁，共二十八頁。一、質(zhì)粒消除（理化因子和生物學(xué)方法）理化因子消除法消除劑：吖啶類，EB，某些抗生素，高溫，UV等如何判斷某一遺傳性狀的喪失是質(zhì)粒消除的結(jié)果還是染色體基因突變的結(jié)果呢？回復(fù)突變情況突變率理化因子消除質(zhì)粒的作用機(jī)制：對質(zhì)粒本身的復(fù)制和分離產(chǎn)生抑制作用，在生長中被淘汰選擇性抑制帶有質(zhì)粒的菌的生長。第八頁，共二十八頁。2.原生質(zhì)體消除法使待消除質(zhì)粒的菌株在一定條件下形成原生質(zhì)體，在再生后生長的菌株中可出現(xiàn)高頻率質(zhì)粒消除菌。第九頁，共二十八頁。二、遺傳轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒導(dǎo)入已經(jīng)消除了該質(zhì)粒的原宿主細(xì)胞，比較導(dǎo)入前后表型性狀的差異或恢復(fù)程度。三、分子雜交在初步確定某菌株可能含有質(zhì)粒的情況下，利用已知表型性狀的基因片段作探針進(jìn)行分子雜交，來檢測其菌株是否含有該種質(zhì)粒。第十頁，共二十八頁。四、質(zhì)粒的分離、檢測與純化質(zhì)粒分離方法：堿變性法菌體的培養(yǎng)和收集溶菌堿變性處理離心分離有時(shí)為了快速提取質(zhì)粒DNA，可以在提取液堿變性后，用pH4.8的醋酸鈉高鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH到中性，這時(shí)染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而即使變性的質(zhì)?？梢曰謴?fù)到原來的構(gòu)型，再通過離心，這樣可以縮短提取質(zhì)粒的時(shí)間。第十一頁，共二十八頁。純化和檢測方法瓊脂糖凝膠電泳(質(zhì)粒3種構(gòu)型泳動(dòng)速度不同，瓊脂糖濃度，EB染色，分子量的判斷)氯化銫-EB密度梯度離心電鏡觀察第十二頁，共二十八頁。第四節(jié)質(zhì)粒的復(fù)制與調(diào)節(jié)一、質(zhì)粒的大小和拷貝數(shù)1.大小測定表示方式：MD或kb，1MD的雙鏈DNA≈1.65kb。測定方法：電泳、電鏡、測序。大小范圍：1~200kb，個(gè)別800~1000。2.質(zhì)粒的拷貝數(shù)嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringentplasmid)或低拷貝質(zhì)粒；松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)或高拷貝質(zhì)粒。（氯霉素可抑制細(xì)胞分離，終止染色體復(fù)制，但松弛型質(zhì)?？沙掷m(xù)復(fù)制，其拷貝數(shù)可達(dá)到1000~3000）。第十三頁，共二十八頁。二、質(zhì)粒的復(fù)制1.質(zhì)粒復(fù)制的方式(P120)質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)稱為oriV,大腸桿菌為oriC。復(fù)制主要通過型復(fù)制和滾環(huán)復(fù)制之一進(jìn)行。其中以型復(fù)制為主（包括單向和雙向）。質(zhì)粒只編碼一種或少數(shù)幾種與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，其他復(fù)制蛋白都來自宿主。第十四頁，共二十八頁。2.復(fù)制起點(diǎn)區(qū)oriV的功能和pBR322質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)區(qū)oriV功能與質(zhì)粒載體的構(gòu)建、寄主范圍pBR322質(zhì)粒：pMB1的ori和rop（ROP蛋白對質(zhì)粒的復(fù)制負(fù)調(diào)控）區(qū)；pSC101的tetr；Tn3的ampr。屬中等拷貝質(zhì)粒，10~30個(gè)/細(xì)胞pUC類：高拷貝質(zhì)粒（100~300個(gè)/細(xì)胞），也是pMB1的ori，但是沒有rop。第十五頁，共二十八頁。質(zhì)粒的寄主范圍和質(zhì)粒的拷貝數(shù)均決定于質(zhì)粒的ori區(qū)域。第十六頁，共二十八頁。三、質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控質(zhì)粒的調(diào)控一般采用直接或間接的負(fù)調(diào)控機(jī)制。負(fù)調(diào)控因子可是蛋白質(zhì)、RNA或DNA重復(fù)序列。調(diào)控類型可分兩類：抑制物-靶位調(diào)控(inhibitor-targetregulation)重復(fù)子-競爭結(jié)合調(diào)控(iteron-bindingregulation)第十七頁，共二十八頁。1.抑制物-靶位調(diào)控依賴一小段反向轉(zhuǎn)錄的RNA作為抑制物，通過它與質(zhì)粒DNA復(fù)制引物或編碼Rep蛋白（復(fù)制蛋白）的mRNA的互補(bǔ)結(jié)合以阻止質(zhì)粒復(fù)制的起始。(1)ColE1質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控（P122圖5-7）第十八頁，共二十八頁。抑制物（負(fù)調(diào)控因子）：反義RNA、Rop蛋白靶位：質(zhì)粒復(fù)制的前提引物機(jī)制：反義RNA和引物RNA互補(bǔ)結(jié)合，阻止其發(fā)揮作用；Rop蛋白具有強(qiáng)化反義RNA和引物RNA結(jié)合的作用。是抑制物對靶位的直接調(diào)控模型。第十九頁，共二十八頁。(2)R1質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控抑制物通過抑制Rep蛋白的形成而阻止了該蛋白對oriV的激活作用。是間接調(diào)控模型。抑制物：CopB蛋白：是PrepA啟動(dòng)子的阻遏蛋白；copA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA：Rep蛋白mRNA互補(bǔ)，抑制其合成靶位：Rep蛋白的合成第二十頁，共二十八頁。2.重復(fù)子-競爭結(jié)合調(diào)控采用該機(jī)制進(jìn)行調(diào)控的質(zhì)粒為重復(fù)子質(zhì)粒。在復(fù)制起始位點(diǎn)ori和復(fù)制基因rep附近存在著多個(gè)長度為17~22bp的DNA短片段。這些短片段叫重復(fù)子。重復(fù)子能與復(fù)制必需的Rep蛋白競爭性結(jié)合，從而抑制了質(zhì)粒的復(fù)制和拷貝數(shù)的增加。pSC101、F、P1等都屬于重復(fù)子質(zhì)粒。第二十一頁，共二十八頁。重復(fù)子質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控機(jī)制（兩種,p124-125）(1)轉(zhuǎn)錄自體調(diào)控：RepA蛋白通過與自身啟動(dòng)子區(qū)的某些序列（如pSC101中的反向重復(fù)序列IR1和IR2）的結(jié)合而抑制自身的合成，這種方式叫做轉(zhuǎn)錄自體調(diào)控。第二十二頁，共二十八頁。(2)偶聯(lián)模型調(diào)控：由于重復(fù)子序列間的相互作用使兩個(gè)質(zhì)粒偶聯(lián)在一起，從而抑制了質(zhì)粒復(fù)制的起始，該方式即為偶聯(lián)模型。質(zhì)粒濃度低時(shí)，RepA蛋白只與一個(gè)質(zhì)粒結(jié)合；質(zhì)粒濃度高時(shí)，RepA蛋白通過與重復(fù)子序列的結(jié)合使兩個(gè)質(zhì)粒聯(lián)結(jié)在一起，阻止質(zhì)粒的復(fù)制。第二十三頁，共二十八頁。F質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控F質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)也含有19~22bp的重復(fù)序列，repE基因編碼的RepE蛋白也是質(zhì)粒復(fù)制所必需的。RepE蛋白是一種自體調(diào)控蛋白，可能也是通過與自身啟動(dòng)子結(jié)合對自身濃度進(jìn)行調(diào)控。RepE蛋白通過與重復(fù)子序列結(jié)合抑制質(zhì)粒復(fù)制。第二十四頁，共二十八頁。四、質(zhì)粒之間的不相容性不相容性(incompatibility):親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒，在非選擇性條件下不能穩(wěn)定存在于同一個(gè)細(xì)胞中，該種特性為質(zhì)粒的不相容性。與質(zhì)粒的復(fù)制起始的控制密切相關(guān)。同種質(zhì)粒的衍生物總是不相容的；不同質(zhì)粒的衍生物可能相容，也可能不相容。不相容群(incompatibilitygroup)：不能在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)穩(wěn)定存在的質(zhì)粒屬于一個(gè)不相容群。因此，不同的不相容群的質(zhì)粒能同時(shí)穩(wěn)定存在于一個(gè)細(xì)胞中。第二十五頁，共二十八頁。五、質(zhì)粒的穩(wěn)定性質(zhì)粒的不穩(wěn)定性包括：分離的不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。質(zhì)粒分配到子細(xì)胞中的途徑包括：主動(dòng)分配(activedistribution)和隨機(jī)分配(randomdistribution)兩種方式。第二十六頁，共二十八頁。1.主動(dòng)分配機(jī)理該類質(zhì)粒一般為低拷貝質(zhì)粒。其穩(wěn)定性通過質(zhì)粒編碼的基因產(chǎn)物來實(shí)現(xiàn)，包括編碼主動(dòng)分配體系的par區(qū)和致死基因。par區(qū)：即分配區(qū)partitionregion，指在細(xì)胞分裂過程中使質(zhì)?？截悢?shù)均等分配到子細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA序列。質(zhì)粒的復(fù)制與分配是分開獨(dú)立進(jìn)行的。第二十七頁，共二十八頁。F質(zhì)粒的par區(qū)結(jié)構(gòu)和分配機(jī)理結(jié)構(gòu)（p128圖5-13）：反式作用基因(sopA,sopB)，順式作用位點(diǎn)(sopC)。機(jī)理：sopC區(qū)的