PCR技術及臨床應用新冠病毒核酸檢測原理教學文案課件

1PCR技術及臨床應用、新冠病毒核酸檢測原理1PCR技術及臨床應用、新冠病毒核酸檢測原理目錄核酸基本知識PCR的發(fā)展史PCR技術簡介實時熒光PCR技術實時熒光PCR的臨床應用新冠病毒核酸檢測原理目錄核酸基本知識一、核酸基本知識

核酸：生物貯存遺傳信息物質(zhì)的大分子，是生命的直接標志核酸的分類：脫氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。DNA和RNA的區(qū)別在于：DNA所含的戊糖為脫氧核糖，而RNA所含的戊糖為核糖；在堿基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧啶U。核苷酸：是核酸的基本結構單位，核酸水解首先得到的是單核苷酸，后者可進一步水解為核苷和磷酸，核苷可進一步水解為戊糖（核糖和脫氧核糖），和含氮堿基（嘌呤堿和嘧啶堿）。一、核酸基本知識

核酸：生物貯存遺傳信息物質(zhì)的大分子，是生命核酸的基本結構核酸的基本結構遺傳信息傳遞的中心法則遺傳信息傳遞的中心法則DNA的復制：能在酶的作用下解鏈，根據(jù)堿基互補配對的原則進行半保留復制。聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction,PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。DNA的復制：能在酶的作用下解鏈，根據(jù)堿基互補配對的原則進行二、PCR的發(fā)展史

1953年，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋的結構，開啟了分子生物學時代，極大地推動了核酸生物化學,分子生物學及分子遺傳學等各類生命科學的迅速發(fā)展。1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

二、PCR的發(fā)展史

1953年，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺

1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶，此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應用。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、PCR污染少、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。

1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(t第一代：手動/機械手式水浴基因擴增

用三個恒溫水浴箱，分別將三個水浴溫度恒定在三個溫度：PCR的高溫變性溫度（如94℃）低溫復性溫度（如58℃），適溫延伸溫度（如72℃）。再用一個裝有PCR標本試管的提籃，用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴。這種方法的特點是：實驗人員勞動強度大，容易因疲勞引起差錯；而優(yōu)點是:設備簡單，投資少，與自動化基因擴增儀相比，它無須升降溫過程，實驗時間短，試驗更接近理想PCR反應條件。第一代：手動/機械手式水浴基因擴增

用三個恒溫水浴箱，分別將第二代：自動化控制型PCR

使用廣泛及具有代表性，采用瓊脂糖電泳的方式對PCR產(chǎn)物進行分析，但存在著操作繁瑣、只適用于定性研究、交叉污染風險大等不足。且無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測。第二代：自動化控制型PCR

使用廣泛及具有代表性，第三代PCR：實時熒光定量PCR

為了避免上述傳統(tǒng)PCR的缺陷，并對基因的表達水平進行定量分析，1992年誕生了所謂“第三代PCR"的熒光定量實時PCR。

所謂real-timeQ-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。第三代PCR：實時熒光定量PCR

為了避免上述傳統(tǒng)PCR的缺第四代PCR：數(shù)字PCR由于定量PCR的分析最終結果依賴于Ct值，在這個意義上所謂的“定量”也只是相對的。而且在低拷貝靶分子、模板濃度差異細微的條件下，其檢測的靈敏度、精確度都受到了限制。在這種背景下，“數(shù)字PCR"應運而生。數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。相較于實時熒光定量PCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的絕對定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領域：拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達研究（如等位基因不平衡表達）、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。第四代PCR：數(shù)字PCR由于定量PCR的分析最終結果依賴于C三、PCR技術簡介

高溫可以使雙鏈DNA解鏈成為單鏈，這一過程稱為變性。變性后的DNA通過降溫可以重新接合為雙鏈，這一過程稱為復性。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，它的特異性取決于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。三、PCR技術簡介高溫可以使雙鏈DNA解鏈成為單鏈，這一過利用溫度的升降來控制DNA的變性和復性。設計引物作為啟動序列，加入DNA聚合酶、dNTP（三磷酸脫氧核甘酸）等原料完成特定基因的體外復制。周而復始的升降溫度進行擴增，每一循環(huán)可以使靶序列增加一倍。利用溫度的升降來控制DNA的變性和復性。PCR擴增步驟DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷酸脫氧核甘酸）為原料，從引物的5'端→3'端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA的含量既增加一倍。PCR擴增步驟DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在PCR擴增示意圖PCR擴增示意圖30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,82430次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.Ampli常用的ＰＣＲ技術定性ＰＣＲ電泳檢測、放射自顯影特異性差、易污染、只能定性ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ特異性較好，極易污染、定量不準確終點法熒光ＰＣＲ特異性很好，不易污染，定量線性范圍小，重復性不好實時熒光ＰＣＲ特異性很好，不易污染，線性寬重復性較好常用的ＰＣＲ技術定性ＰＣＲ四、實時熒光PCR技術實時熒光定量PCR：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。定量PCR儀是在普通PCR儀的基礎上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測裝置，PCR擴增和檢測同時進行，最終結果不需進行電泳檢測，所以有效地避免了樣品間的交叉污染。四、實時熒光PCR技術熒光PCR的原理熒光PCR的原理實時熒光PCR常用的三個概念

擴增曲線：反映PCR循環(huán)次數(shù)和熒光強度的曲線，定量PCR儀每次PCR擴增都會自動記錄熒光強度的變化熒光閾值：在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，儀器可自動計算，手動設置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99。Ct值：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。實時熒光PCR常用的三個概念

擴增曲線：反映PCR循環(huán)次數(shù)和

實時熒光PCR擴增曲線示意圖

實時熒光PCR擴增曲線示意圖手工調(diào)整熒光閾值示意圖手工調(diào)整熒光閾值示意圖Ct值的意義Ct值與重復性同一樣本在相同條件下同時進行96次擴增Ct值與濃度不同濃度的模板達到熒光域值時的Ct值不同Ct值的意義Ct值與重復性Ct值與濃度PCR擴增的理論模式Yn=X*(1+E)n

，0≤E≤1，E為擴增效率,X為原始模板數(shù),Y為PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量,n為周期數(shù)。模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量。PCR擴增的理論模式Yn=X*(1+E)n，0≤E≤1，E標準曲線的建立梯度稀釋后，標準品的擴增曲線間距相等，標準曲線上的間距也相等，說明標準曲線建立的很成功，假如間距參差不齊，說明梯度稀釋時操作誤差太大，建議重新做標準品的梯度稀釋，重新做標準曲線，直到擴增曲線之間的間距相等為止。因為這一步直接影響著樣品中目的基因原始模板量的準確性。標準曲線的建立梯度稀釋后，標準品的擴增曲線間距相等，實時熒光定量PCR技術的特點靈敏度高特異性強快速簡便應用范圍廣實時熒光定量PCR技術的特點靈敏度高五、實時熒光PCR的臨床應用

感染性疾病的診斷母嬰傳播的控制與觀察遺傳疾病的診斷腫瘤的診斷法醫(yī)學鑒定早期診斷病情評估和預后判斷抗病毒藥物療效的觀察、指導新藥驗證五、實時熒光PCR的臨床應用

感染性疾病的診斷感染性疾病的診斷

1.病原體含量與病情之間的關系

2.病原體含量與用藥之間的關系

3.藥物及療法的研究與開發(fā)

4.新的病原體分子診斷標準

5.新的愈后指標

6.傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預測與預防感染性疾病的診斷1.病原體含量與病情之間的關系六、新冠病毒核酸檢測原理

對新型冠狀病毒（2019-nCoV）ORF1ab及編碼核衣殼蛋白N或E基因的特異性保守序列為靶區(qū)域，進行了雙靶標基因的設計，配以PCR反應液，在熒光定量PCR儀上，應用實時熒光定量RT-PCR檢測技術，通過熒光信號的變化實現(xiàn)樣本新型冠狀病毒RNA的檢測。

六、新冠病毒核酸檢測原理

對新型冠狀病毒（201PCR技術及臨床應用新冠病毒核酸檢測原理教學文案課件此課件下載可自行編輯修改，僅供參考！

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核酸：生物貯存遺傳信息物質(zhì)的大分子，是生命的直接標志核酸的分類：脫氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。DNA和RNA的區(qū)別在于：DNA所含的戊糖為脫氧核糖，而RNA所含的戊糖為核糖；在堿基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧啶U。核苷酸：是核酸的基本結構單位，核酸水解首先得到的是單核苷酸，后者可進一步水解為核苷和磷酸，核苷可進一步水解為戊糖（核糖和脫氧核糖），和含氮堿基（嘌呤堿和嘧啶堿）。一、核酸基本知識

核酸：生物貯存遺傳信息物質(zhì)的大分子，是生命核酸的基本結構核酸的基本結構遺傳信息傳遞的中心法則遺傳信息傳遞的中心法則DNA的復制：能在酶的作用下解鏈，根據(jù)堿基互補配對的原則進行半保留復制。聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction,PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。DNA的復制：能在酶的作用下解鏈，根據(jù)堿基互補配對的原則進行二、PCR的發(fā)展史

1953年，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋的結構，開啟了分子生物學時代，極大地推動了核酸生物化學,分子生物學及分子遺傳學等各類生命科學的迅速發(fā)展。1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

二、PCR的發(fā)展史

1953年，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺

1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶，此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應用。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、PCR污染少、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。

1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(t第一代：手動/機械手式水浴基因擴增

用三個恒溫水浴箱，分別將三個水浴溫度恒定在三個溫度：PCR的高溫變性溫度（如94℃）低溫復性溫度（如58℃），適溫延伸溫度（如72℃）。再用一個裝有PCR標本試管的提籃，用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴。這種方法的特點是：實驗人員勞動強度大，容易因疲勞引起差錯；而優(yōu)點是:設備簡單，投資少，與自動化基因擴增儀相比，它無須升降溫過程，實驗時間短，試驗更接近理想PCR反應條件。第一代：手動/機械手式水浴基因擴增

用三個恒溫水浴箱，分別將第二代：自動化控制型PCR

使用廣泛及具有代表性，采用瓊脂糖電泳的方式對PCR產(chǎn)物進行分析，但存在著操作繁瑣、只適用于定性研究、交叉污染風險大等不足。且無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測。第二代：自動化控制型PCR

使用廣泛及具有代表性，第三代PCR：實時熒光定量PCR

為了避免上述傳統(tǒng)PCR的缺陷，并對基因的表達水平進行定量分析，1992年誕生了所謂“第三代PCR"的熒光定量實時PCR。

所謂real-timeQ-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。第三代PCR：實時熒光定量PCR

為了避免上述傳統(tǒng)PCR的缺第四代PCR：數(shù)字PCR由于定量PCR的分析最終結果依賴于Ct值，在這個意義上所謂的“定量”也只是相對的。而且在低拷貝靶分子、模板濃度差異細微的條件下，其檢測的靈敏度、精確度都受到了限制。在這種背景下，“數(shù)字PCR"應運而生。數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。相較于實時熒光定量PCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的絕對定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領域：拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達研究（如等位基因不平衡表達）、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。第四代PCR：數(shù)字PCR由于定量PCR的分析最終結果依賴于C三、PCR技術簡介

高溫可以使雙鏈DNA解鏈成為單鏈，這一過程稱為變性。變性后的DNA通過降溫可以重新接合為雙鏈，這一過程稱為復性。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，它的特異性取決于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。三、PCR技術簡介高溫可以使雙鏈DNA解鏈成為單鏈，這一過利用溫度的升降來控制DNA的變性和復性。設計引物作為啟動序列，加入DNA聚合酶、dNTP（三磷酸脫氧核甘酸）等原料完成特定基因的體外復制。周而復始的升降溫度進行擴增，每一循環(huán)可以使靶序列增加一倍。利用溫度的升降來控制DNA的變性和復性。PCR擴增步驟DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷酸脫氧核甘酸）為原料，從引物的5'端→3'端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA的含量既增加一倍。PCR擴增步驟DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在PCR擴增示意圖PCR擴增示意圖30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,82430次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.Ampli常用的ＰＣＲ技術定性ＰＣＲ電泳檢測、放射自顯影特異性差、易污染、只能定性ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ特異性較好，極易污染、定量不準確終點法熒光ＰＣＲ特異性很好，不易污染，定量線性范圍小，重復性不好實時熒光ＰＣＲ特異性很好，不易污染，線性寬重復性較好常用的ＰＣＲ技術定性ＰＣＲ四、實時熒光PCR技術實時熒光定量PCR：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。定量PCR儀是在普通PCR儀的基礎上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測裝置，PCR擴增和檢測同時進行，最終結果不需進行電泳檢測，所以有效地避免了樣品間的交叉污染。四、實時熒光PCR技術熒光PCR的原理熒光PCR的原理實時熒光PCR常用的三個概念

擴增曲線：反映PCR循環(huán)次數(shù)和熒光強度的曲線，定量PCR儀每次PCR擴增都會自動記錄熒光強度的變化熒光閾值：在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，儀器可自動計算，手動設置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99。Ct值：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。實時熒光PCR常用的三個概念

擴增曲線：反映PCR循環(huán)次數(shù)和

實時熒光PCR擴增曲線示意圖

實時熒光PCR擴增曲線示意圖手工調(diào)整熒光閾值示意圖手工調(diào)整熒光閾值示意圖Ct值的意義Ct值與重復性同一樣本在相同條件下同時進行96次擴增Ct值與濃度不同濃度的模板達到熒光域值時的Ct值不同Ct值的意義Ct值與重復性Ct值與濃度PCR擴增的理論模式Yn=X*(1+E)n

，0≤E≤1，E為擴增效率,X為原始模板數(shù),Y為PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量,n為周期數(shù)。模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log濃度與循環(huán)