其他氨基酸發(fā)酵

第二節(jié)其他氨基酸發(fā)酵氨基酸的生物合成氨基酸生產(chǎn)工藝按照起始物可將氨基酸的合成分成幾個(gè)家族：

1.谷氨酸族（α-酮戊二酸族）谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、賴氨酸和脯氨酸；

2.丙酮酸族：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸；

3.天冬氨酸族（草酰乙酸族）天冬氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸和異亮氨酸；

4.磷酸甘油酸族:甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸；

5.芳香族：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；另外，組氨酸的合成為單獨(dú)的一條途徑。氨基酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制

反饋抑制與優(yōu)先合成

氨基酸生物合成的基本調(diào)節(jié)機(jī)制有反饋抑制與在合成途徑分支點(diǎn)處的優(yōu)先合成。

反饋抑制：A→B→C→D

ED

優(yōu)先合成：A→B→CFG2）順序控制

EDA→B→CFGA→B→C→D

1）終產(chǎn)物控制

催化分支合成途徑共同部分的初始酶，在僅一種氨基酸終產(chǎn)物過剩時(shí)，完全不受或微弱或部分地反饋抑制（或阻遏），只是在多數(shù)終產(chǎn)物共存下才強(qiáng)烈地控制。有以下幾種情況：①協(xié)同（或多價(jià)）反饋抑制②合作（或增效）反饋抑制③同功酶控制④積累反饋抑制生產(chǎn)公司及國別

Archer

Daniels

Midland

Company

(USA)Biokyowa

Incorporated

Heartland

Lysine,

Inc.

法國歐洲氨基酸公司

意大利

Bio-Italia

S.P.A

斯羅法克

俄羅斯

日本味之素公司

印度尼西亞

韓國

泰國

生產(chǎn)能力(t/a)

12000013600

20000

50000

1500010000

1600015000

20000

3000010000

備注

日本公司在美國的工廠

日本公司在美國的工廠

與德國Degussa合資工廠

一、賴氨酸發(fā)酵我國賴氨酸主要生產(chǎn)單位及生產(chǎn)能力

企業(yè)名稱

生產(chǎn)能力(t/a)

原料路線

廣西桂元賴氨酸有限責(zé)任公司(原廣西賴氨酸廠)

10000

糖蜜，

1997年底擴(kuò)建完成

川化味之素有限公司

10000

玉米淀粉，1997底擴(kuò)建完成

福建大泉賴氨酸公司

6500

玉米淀粉

吉林長春大成生化工程開發(fā)有限公司

15000

引進(jìn)技術(shù)，2000年建成

谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌和乳糖發(fā)酵短桿菌突變類型：缺陷型、敏感型、抗結(jié)構(gòu)類似物和組合型突變株。1.天冬氨酸族生物合成途徑

天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨酸為原料，合成蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸。甲硫氨酸琥珀酰高絲氨酸合成酶草酰乙酸→天冬氨酸→天冬氨酸磷酸→天冬氨酸-β-半醛→高絲氨酸→蘇氨酸

DAP合成酶異亮氨酸

二氨基庚二酸→賴氨酸2.天冬氨酸族生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制

在細(xì)菌中，雖然天冬氨酸族氨基酸生物合成途徑是相同的，但是其代謝調(diào)節(jié)機(jī)制是多種多樣的。1）大腸桿菌K12(同功酶調(diào)節(jié))①天冬氨酸激酶(三個(gè))②天冬氨酸-β-半醛脫氫酶(兩個(gè))③DAP合成酶（賴氨酸分支的第一個(gè)酶）④高絲氨酸合成酶（HD）（通向蘇氨酸、蛋氨酸分支的第一個(gè)酶）2）黃色短桿菌(協(xié)同反饋抑制)

賴氨酸生物合成調(diào)節(jié)機(jī)制中天冬氨酸激酶只有一種。3）乳糖發(fā)酵短桿菌賴氨酸合成調(diào)節(jié)微生物賴氨酸合成途徑不同：

1）為經(jīng)過二氨基庚二酸的生物合成途徑，如細(xì)菌，DAP；

2）是AAA，酵母菌、霉菌經(jīng)過α-氨基己二酸AAA途徑合成賴氨酸。3.賴氨酸生產(chǎn)菌的育種途徑出發(fā)菌株的選擇：

要求代謝比較簡單的細(xì)菌（如黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳酸發(fā)酵短桿菌等）1）優(yōu)先合成的轉(zhuǎn)換：滲漏缺陷型的選育。2）切斷支路代謝：營養(yǎng)缺陷型的選育。3）抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育（代謝調(diào)節(jié)突變）。4）代謝互鎖解除代謝互鎖的方法：

①選育亮氨酸缺陷型菌株，或者以抗AEC的賴氨酸的生產(chǎn)菌為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變得到抗AEC兼亮氨酸缺陷型菌株。②選育抗亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物的突變株，從遺傳上解除亮氨酸對DAP合成酶的阻遏。③選育對苯醌或喹啉衍生物敏感菌株，這是一種尋找亮氨酸滲漏缺陷型菌株的有效方法。5）增加前體物的生物合成和阻塞產(chǎn)物的生成6）改變細(xì)胞膜的透過性7）選育溫度敏感突變株8）應(yīng)用細(xì)胞工程和遺傳工程育種9）防止高產(chǎn)菌株回復(fù)突變4.賴氨酸發(fā)酵條件控制溶氧：不足，賴氨酸生產(chǎn)受到不可逆抑制；PH：補(bǔ)加氨水；溫度：32℃；前體：甘氨酸或絲氨酸。（短小假單胞菌）二、蘇氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)具有多重標(biāo)記的缺陷型菌株蘇氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株（AHVr）三、異亮氨酸、亮氨酸生產(chǎn)工藝1.異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸的生物合成途徑：圖23-4

2.異亮氨酸發(fā)酵兩種方法：添加前體發(fā)酵法和直接發(fā)酵法添加前體發(fā)酵法：

蘇氨酸脫水酶受異亮氨酸的反饋抑制；添加前體物質(zhì)D-蘇氨酸、α-酮基異戊酸；繞過異亮氨酸對蘇氨酸脫水酶的反饋抑制。直接發(fā)酵法：

抗反饋調(diào)節(jié)突變株，解除對蘇氨酸脫水酶的反饋抑制。四、新種分離與篩選的步驟

調(diào)查研究（包括資料查閱）

試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

含微生物樣品的采集（如何使樣品中含所需微生物的可能性大？）

樣品預(yù)處理

菌種分離

根據(jù)目的菌株及其產(chǎn)物特點(diǎn)分

選擇性分離方法 隨機(jī)分離方法

(定向篩選←選擇壓力)

(用篩選方案-檢測系統(tǒng)進(jìn)行間接分離）

富集液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基條件培養(yǎng)

(初篩)

菌種純化

復(fù)篩

菌種純化初步工藝條件摸索再復(fù)篩生產(chǎn)性能測試較優(yōu)菌株1-3株保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)試驗(yàn)?zāi)承┍匾囼?yàn)和或作為育種的出發(fā)菌株毒性試驗(yàn)等

含微生物樣品的采集采樣時(shí)應(yīng)注意的問題:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情況采樣季節(jié)土壤的酸堿度樣品的預(yù)處理目的：提高分離效率方法：物理方法：熱處理；膜過濾法；離心法化學(xué)方法誘餌法分離方法的選擇

根據(jù)目的菌有無選擇性特征來選擇分離方法菌種的營養(yǎng)特征獨(dú)特

生長特征獨(dú)特

無選擇性特征根據(jù)產(chǎn)物的特征進(jìn)行

隨機(jī)分離選擇性分離

選擇性分離原理和技術(shù)生長條件的選擇與控制原理控制營養(yǎng)成分

控制培養(yǎng)基酸堿度

添加抑制劑

控制培養(yǎng)溫度

控制通氣條件

選擇性分離技術(shù)富集液體培養(yǎng)技術(shù)固體培養(yǎng)技術(shù)施加選擇壓力，進(jìn)行定向篩選

A.富集液體培養(yǎng)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)培養(yǎng)方式分批培養(yǎng)方式：以最大比生長速率（μmax）篩選，存在選擇壓力的控制、移種時(shí)間和次數(shù)等問題連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長速率（μ）篩選

μ

ABS0基質(zhì)濃度對A、B兩種菌的比生長速率（μ）的影響

當(dāng)S<S0時(shí)，富集什么菌株？當(dāng)S>S0時(shí)，富集什么菌株？B.固體培養(yǎng)技術(shù)常用于分離某些酶產(chǎn)生菌

選擇壓力：在選擇培養(yǎng)基中加入所需酶的基質(zhì)

隨機(jī)分離原理與技術(shù)從產(chǎn)物入手，設(shè)計(jì)高產(chǎn)培養(yǎng)基和建立快速靈敏專一的篩選方法。技術(shù)關(guān)鍵：產(chǎn)物合成條件的選擇與控制及相應(yīng)篩選方法的確定。高產(chǎn)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的幾個(gè)原則

制備一系列的培養(yǎng)基，其中有各種類型的養(yǎng)分成為生長限制因素；使用一聚合或復(fù)合形式的生長限制養(yǎng)分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代謝物阻遏；確定含有所需的輔因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH緩沖劑以減少pH變化；前體、促進(jìn)劑及抑制劑的采用。生長因子產(chǎn)生菌的篩選

篩選模型：營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌

篩選方法：利用被分離的微生物產(chǎn)物能否促進(jìn)營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌生長氨基酸產(chǎn)生菌的篩選

樣品

預(yù)處理

初篩（除真菌）

在分離平板上生長獲得多個(gè)單菌落復(fù)印平板（copy法）

平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸對應(yīng)到copy前相應(yīng)

u.v線殺死長好的菌落

位置，找到目的菌落

再鋪上一層含營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌的瓊脂

培養(yǎng)后

產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長圈

目的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，對產(chǎn)物進(jìn)行定量測定篩選產(chǎn)物含量高的菌株菌種選育改良的具體目標(biāo)提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品

五、代謝工程

利用多基因重組技術(shù)有目的地對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，改變細(xì)胞特性，并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一個(gè)新的學(xué)科領(lǐng)域。又稱作途徑工程，是多基因的基因工程。

代謝網(wǎng)絡(luò)理論：是把細(xì)胞的生化反應(yīng)以網(wǎng)絡(luò)整體，而不是孤立地來考慮。代謝網(wǎng)絡(luò)分流處的代謝產(chǎn)物稱為節(jié)點(diǎn)，其中對終產(chǎn)物合成起決定作用的少數(shù)節(jié)點(diǎn)稱為主節(jié)點(diǎn)。根據(jù)節(jié)點(diǎn)下游分支的可變程度，節(jié)點(diǎn)分為：柔性節(jié)點(diǎn)：解除一個(gè)分支的反饋抑制可提高該分支下游產(chǎn)物的產(chǎn)量。半柔性節(jié)點(diǎn)：須降低主分支的酶活并同時(shí)提高次分支的酶活或解除其反饋抑制，才可提高次分支下游產(chǎn)物的產(chǎn)量。剛性節(jié)點(diǎn)：其下游各分支的比例不易改變。

（一）代謝工程發(fā)展基礎(chǔ)相依網(wǎng)絡(luò)：代謝網(wǎng)絡(luò)中各主節(jié)點(diǎn)集中于產(chǎn)物，為了避免中間物的過量積累，各分支的代謝流都必須保持平衡，各分支的分流相等，各節(jié)點(diǎn)的重要性相同。獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)：代謝網(wǎng)絡(luò)的主節(jié)點(diǎn)不集中，可以通過對代