DB15T 2690-2022青貯飼料中乳酸菌菌種的分離與保藏技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01CCSICS65.020.01CCSB25內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB15/T2690—2022青貯飼料中乳酸菌菌種的分離與保藏技術(shù)規(guī)程TechnicalprotocolforisolationandpreservationoflacticacidTechnicalprotocolforisolationandpreservationoflacticacidbacteriastrainsinsilage2022-07-152022-08-15內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC19）歸口。青貯飼料中乳酸菌菌種的分離與保藏技術(shù)規(guī)程范圍本文件適用于青貯飼料中乳酸菌菌種的分離與保藏。（GB/T4789.28食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB20287農(nóng)用微生物菌劑SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則3術(shù)語(yǔ)和定義3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4基本原則應(yīng)針對(duì)菌種的生物學(xué)性狀選擇分離與保藏方法。應(yīng)使分離和保藏的菌種不染雜菌，使退化和死亡降到最低限度。應(yīng)保證菌種分離和保藏的安全性，不能對(duì)周圍環(huán)境造成污染和危害。5設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱：5℃～60℃。厭氧培養(yǎng)裝置：5℃～60℃。振蕩器：往復(fù)式。冰箱：4℃冰箱、超低溫冰箱（-50℃～-86℃）。分析天平：感量0.001g。光學(xué)顯微鏡：4×～100×。均質(zhì)器及無(wú)菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。水浴鍋：0℃～100℃。超凈工作臺(tái)。試劑MRS。8.5g1000mL12130min。GB/T6682菌液制備以無(wú)菌操作稱取10g樣品置于盛有90mL無(wú)菌生理鹽水的聚乙烯均質(zhì)袋內(nèi)，用拍打式無(wú)菌均質(zhì)器拍打2min，制成1：10的樣品菌液。菌液稀釋用1mL（1:1019mL1→101→1×1011→1×102、1→1×103、1→1×104，1→1×105（）。菌種培養(yǎng)按照GB20287規(guī)定制備瓊脂培養(yǎng)基，于高壓滅菌鍋滅菌后備用。選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品菌液（20μL20μL3072h）。乳酸菌的分離與純化1～2于MRS30℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h～72h1。乳酸菌的篩選將分離純化的乳酸菌菌液混勻并提取其懸液以6%的濃度接種至MRS培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)（37℃）24h，期間每2h用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)其在波長(zhǎng)620nm的OD值，每個(gè)菌種均重復(fù)3次，最終將測(cè)定結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線。3.0pH=6.5MRS（37℃培養(yǎng)24h2用pHpH3%MRS44℃培養(yǎng)10d，10℃與30℃培養(yǎng)3d，45℃培養(yǎng)7pH以及濃度為3.0%和6.5%NaCl的MRS30℃培養(yǎng)48620nmD0.小于D.，生長(zhǎng)：0.5小于OD值小于0.1OD值小于0.2OD值大于1.0）493圖1菌種分離及篩選程序BCA.2制法A.2制法100H至6.±01115in。附錄A（）A.1MRS乳酸菌培養(yǎng)基見表A.1。表A.1乳酸菌培養(yǎng)基成分組成稱取量蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g酵母粉4.0g葡萄糖20.0g吐溫801.0mLK2HPO4?7H2O2.0g醋酸鈉?3H2O5.0g檸檬酸三銨2.0gMgSO4?7H2O0.2gMnSO4?4H2O0.05g附錄B（）本方法廣泛適用于細(xì)菌、放線菌、真菌等的短期保藏。原料））按照GB/T4789.28和SN/T1538.1執(zhí)行。接種點(diǎn)接（）。用接種環(huán)從斜面中部自下而上劃一直線。適用于細(xì)菌和酵母菌等。用接種環(huán)從斜面底部自下而上劃稀“之”字形線。適用于易擴(kuò)散的細(xì)菌，也適用于部分真菌。之”用接種鏟挖取菌絲體連同少量瓊脂培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔(dān)子菌類真菌。（）挑取少量固體斜面菌種或用無(wú)菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)30℃～38培養(yǎng)好的菌種于4℃～6℃保藏，有些菌種（如：部分弧菌、假單胞菌等）4℃～6℃容易死亡，適于25℃室溫保藏。培養(yǎng)好的菌種于4℃～6℃保藏，有些菌種（如：部分弧菌、假單胞菌等）4℃～6℃容易死亡，適于25℃室溫保藏。通常相對(duì)濕度為50%～70%。B.4.5定期移植1～24～6（1～330～38附錄C（）本方法適用于大多數(shù)需要長(zhǎng)期保藏的細(xì)菌、真菌、放線菌、病毒等。原理60將2.0mL凍存管（圓底硼硅玻璃安瓶管或螺旋式塑料管）清洗干凈，121℃高壓滅菌15min～20min，備用。也可使用商品化的菌種保藏管。注意凍存管不能有裂紋。保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物的類別選擇，一般采用無(wú)菌的10%～20%甘油或脫脂奶粉，或10%二甲亞砜。5mm～10mm），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)；1.2mm～2mm2d～10d將含菌種的凍存管插入保