分子生物學實驗

分子生物學實驗教案PAGEPAGE29分子生物學實驗教案（2012～2013學年第二學期）伊犁師范學院化學與生物科學學院2013年分子生物學實驗教案課程名稱分子生物學實驗任課教師總學時數(shù)36學分1授課對象2011級生物科學實驗項目名稱與學時分配序號項目名稱學時1質粒DNA的提取和純化32DNA濃度和純度的測定33瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA34PCR擴增獲取目的基因35DNA酶切36目的DNA的回收37目的基因與載體的體外連接38大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備39大腸桿菌感受態(tài)細胞的轉化310重組子的篩選311PCR鑒定重組子312酶切鑒定重組子313表達載體的構建（選修）314外源基因的誘導表達（選修）315SDS檢測目的蛋白（選修）3使用教材分子生物學實驗指導，教學參考資料朱旭芬，史鋒，趙小立等編著，《基因工程實驗》，浙江大學生命科學學院全國生物技術實驗師資培訓教材，2004。魏群主編，《分子生物學實驗指導》，高等教育出版社、施普林格出版社，1999。吳乃虎編著，《基因工程原理》，高等教育出版社，1997。[美]J.姆布魯克等編著，《分子克隆實驗指南》，科學出版社，2002。《分子生物學實驗》簡介分子生物學實驗是根據(jù)基因工程的本質而設計的一門綜合性和設計性的實驗課程。本實驗課程涵蓋基因的主要操作過程，由內(nèi)容相關的一系列實驗組成，強調(diào)實驗的連續(xù)性和一體化，包括目的DNA片段的PCR擴增及電泳鑒定，質粒DNA的抽提、純化及電泳鑒定，質粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切及體外連接，感受態(tài)細胞的制備及轉化，轉化子鑒定及接種培養(yǎng)，重組質粒抽提、純化、酶切與及檢測及重組蛋白表達分析等實驗。通過本課程學習，使學生學習和掌握分子生物學中常用的各種實驗技術，包括培養(yǎng)學生形成正確的實驗操作習慣，正確地使用各種實驗儀器與試劑、詳細記錄實驗的過程與結果、對實驗中所出現(xiàn)的問題做合理的分析，培養(yǎng)學生分析問題和解決問題的能力。該課程自設置以來不斷進行實驗內(nèi)容的調(diào)整和改進，并在實驗運行機制和課時設置方面進行了大膽的嘗試和革新，既讓學生自主地設計實驗技術路線、實驗材料準備、實驗操作和結果分析，發(fā)揮學生的主動和創(chuàng)新意識，增加對實驗的興趣和認識，又讓學生學習和熟悉科研課題研究思路，達到掌握開展科學研究的方法和具體實驗操作的目的。分子生物學實驗計劃表細菌的培養(yǎng)質粒提取(PUCATPH，pBSKS，pGEX-2TKPET28c)DNA濃度和純度的測定瓊脂糖凝膠電泳檢測DNAPCR擴增（PUCATPH）獲取目的基因序列酶切表達質粒酶切表達質粒PET28cPCR產(chǎn)物的酶切、電泳確定；酶切克隆載體pBSKS、電泳確認；電泳回收表達載體片斷電泳回收表達載體片斷試劑盒回收目的基因條帶；試劑盒回收酶切過的克隆載體目的基因片斷與表達載體體外連接目的基因片斷與表達載體體外連接目的基因與pBSKS載體的體外連接感受態(tài)制備，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞BL21制備感受態(tài)宿主菌，重組質粒熱擊轉化感受態(tài)細菌DH5a感受態(tài)制備，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞BL21誘導目的基因表達，轉化子篩選藍白斑選擇篩選轉化子誘導目的基因表達，轉化子篩選挑取白色單菌落，擴大培養(yǎng)；藍斑作對照檢測表達情況檢測表達情況菌液PCR擴增提取質粒，酶切質粒電泳檢測重組子插入片斷大小，確認正確插入的重組子說明：本程序基本涵蓋了基因工程的整個實驗流程，包括目的基因的獲得，克隆載體的構建，表達載體的構建，載體和目的基因的連接、轉化，重組子的篩選、目的基因的誘導表達。限于我們的實驗條件，感受態(tài)細胞的的制備和目的基因的表達可能比較粗放，請大家諒解。實驗1質粒DNA大量提取和純化【時間安排】：3學時【實驗類型】：基本訓練【目的要求】：了解：質粒DNA的一般特征特性和提取質粒的原理；掌握：最常用的提取質粒DNA的方法；熟悉：質粒DNA大量提取和純化的方法步驟?！緦嶒炘怼浚嘿|粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，在基因工程中具有及其廣泛的應用價值，因此，質粒的分離、提取和純化是最常用、最基本的實驗技術。質粒（plasmid）是一種獨立、穩(wěn)定的遺傳因子，是在細菌等細胞中染色體之外的DNA分子，大小范圍在1～200kb以上不等。大多數(shù)來自細菌細胞的質粒是雙鏈、共價閉合的環(huán)狀分子，以超螺旋形式存在。作為理想的克隆載體的質粒必須具備以下四點：（1）一個復制起點（raplicationorigin）；（2）一個或多個選擇性標記基因，如抗生素基因；（3）帶有一個人工合成的、含有多個限制性酶切位點的多克隆位點（Multiplecloningsite,MCS）；（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。天然質粒存在不同程度的局限性，現(xiàn)在常用的質粒大多數(shù)都是經(jīng)過修飾和改造過的質粒。應用質粒作為基因克隆的載體分子，一個重要的條件是獲得批量純化的質粒DNA分子。帶有質粒的宿主（如大腸桿菌）細胞中，除了質粒外，還有基因組DNA和各種RNA的存在，并且還含有菌體組分的蛋白質、脂類物質等。提取質粒就是從這些混合物中將質粒分離出來。已經(jīng)建立了多種從細菌中提純質粒DNA的方法，這些方法無一例外都包括以下三個步驟：（1）培養(yǎng)細菌，使質粒大量擴增；（2）收集和裂解細菌并除去蛋白質和染色體DNA；（3）分離和純化質粒。本實驗是采用SDS裂解法制備質粒DNA。人們使用堿與SDS裂解法從E.coli中分離制備質粒DNA已有20多年的歷史。其原理是：將細菌懸浮液暴露于高pH值的強陰離子洗滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質變性，將質粒DNA釋放到上清液中。盡管堿性溶劑使堿基配對完全破壞，閉環(huán)的質粒DNA雙鏈仍不會彼此分離，這是因為它們在拓撲學上是相互纏繞。只要OH－處理的強度和時間不要太過，當pH值恢復到中性時，DNA雙鏈就會再次形成。在裂解過程中，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，然后被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時，這些復合物會從溶液中沉淀下來。離心除去變性劑后，就可以從上清液中回收復性的質粒DNA。SDS裂解法制備質粒DNA通常使用SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ三種溶液，其生化作用原理：SolutionⅠ：溶菌液，葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解；EDTA螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制Dnase對DNA的降解作用（因為Dnase作用時，需要一定的金屬離子作輔基）。SolutionⅡ：核酸在pH大于5，小于9的溶液中是穩(wěn)定的，當pH＞12或pH＜3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在SolutionⅡ中NaOH的濃度為0.2mol/L，加抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA和質粒DNA的變性；SDS是離子型表面活性劑，它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3－……R+——蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉淀下來。SolutionⅢ：NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH值至4.8必須加入大量的冰醋酸。所以SolutionⅢ實際上是NaAc-HAc緩沖液。其作用是為了把pH12.6的抽提液中和，調(diào)pH至中性，使變性的質粒DNA能夠復性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/LNaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電賀，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS-蛋白復合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉淀更完全?！緝x器與試劑】：主要儀器：微量移液器、離心機、離心管、冰盒、恒溫水浴鍋、干燥器等。主要試劑：LB培養(yǎng)基、抗生素、TE溶液、RNase溶液、NaAc溶液、酚/氯仿/異戊醇溶液、乙醇、緩沖液和溶液等LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：配制每升培養(yǎng)基，應在950ml去離子水中加入細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g；細菌培養(yǎng)用酵母提取物（bacto-yeastextract）5g；NaCl10g，充分溶解后用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1L，在15lbf/in2（1.034×105Pa）高壓蒸汽滅菌20分鐘。少量配制應按比例減?。olutionⅠ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）SolutionⅡ：200mmol/LNaOH，1%（m/v）SDS（要現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫使用?。㏒olutionⅢ：3mol/LKAc（pH4.8）溶液?？蛇@樣配制：5mol/L乙酸鉀60.0ml冰乙酸11.5mlH2O28.5ml混合（所配成的溶液中鉀離子濃度為3mol/L，乙酸根的濃度為5mol/L。保存于4℃，用時置于冰浴中。）其他溶液：酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），酚可用可不用！NaAc：3mol/L【重要實驗步驟和教學設計】：實驗準備：制備含有相應抗生素的固體和液體LB培養(yǎng)基，將保存的菌液涂布到固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)單菌落（1～2天）。挑取單菌落在含有對應于某一抗生素(如Amp或Kan)的LB培養(yǎng)液（25mL）中接種，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，使細菌處于對數(shù)生長期（約12－16個小時）。吸取10mL培養(yǎng)液于eppendorf管中，12000rpm離心5分鐘，棄去上清液，可用微量移液器適當吸取殘余上清。細菌沉淀于管底。加入1mL溶液Ⅰ，用手指或渦旋振蕩器劇烈彈震，使菌體充分懸浮，室溫下靜置5min。加入2mL新配制的溶液Ⅱ，蓋緊管蓋，上下溫和顛倒eppendorf管2－3回，以混勻內(nèi)容物（千萬不要劇烈振蕩）,冰浴靜置5min。加入1.5mL浴冷的溶液Ⅲ，上下顛倒混勻數(shù)次，冰浴條件下靜置5min。12000rpm離心10min，將上清液移至新的eppendorf管中（約400μL）。加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），充分振蕩混勻，12000rpm離心5min。吸取上層水相至新的離心管中，加入十分之一體積量的3mol/L的pH5.2NaAc,再加入2倍體積（約1

mL）的預冷的無水乙醇。10.放入－20℃冰箱中靜置30分鐘，11.棄去上清，加入1mL預冷的70%乙醇，12000rpm離心5min，洗滌沉淀。12.棄去上清，沉淀在室溫下自然干燥。然后加入40μLTE溶液。13.取5μL的質粒與2μL的6X上樣緩沖液混合后，在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。14.將所獲得的質粒DNA樣品置于4℃【實驗注意事項】：注意微量移液器、離心機的正確使用方法；在記入溶液Ⅱ時只需上下溫和顛倒離心管即可，千萬不能劇烈振蕩。經(jīng)抽提后，吸取上清液時注意不要把中間的白色層吸入，其中含有蛋白質等雜質。【思考題】：作為理想的克隆載體的質粒必須具備哪些特點？SDS裂解法制備質粒DNA的原理是什么？SDS裂解法制備質粒DNA中三種溶液的生化原理分別是什么？除了SDS裂解法外，還有什么方法可以制備質粒DNA？【實驗后記】：實驗2分光光度法測定DNA的濃度和純度【時間安排】：3學時【實驗類型】：基本訓練【目的要求】：了解：分光光度法測定DNA濃度和純度的原理；掌握：分光光度法測定DNA濃度和純度的技術方法；熟悉：分光光度法測定DNA濃度和純度的實驗操作步驟和注意事項。【實驗原理】：前面提取得到的DNA的濃度和純度都是未知的，在后續(xù)的DNA酶切、連接及轉化等實驗中需要一定的濃度和純度要求，因此要測定DNA的濃度和純度。測定DNA的方法通常有：紫外分光光度法；瓊脂糖凝膠電泳法（也叫熒光光度法）（1）紫外分光光度法：組成DNA的堿基均具有一定的吸收紫外線特性，最大吸收值在波長為250～270nm之間，腺嘌呤的最大紫外線吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鳥嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶：259nm。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不會改變，但核酸的最大吸收波長是260nm，吸收低谷在230nm。這個物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎。在波長260nm紫外線下，10OD值的光密度相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA或RNA為40μg/ml；單鏈寡聚核苷酸為20μg/ml?？梢源藖碛嬎愫怂針悠返臐舛?。分光光度法不但能夠確定核酸的濃度，還可以通過測定在260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計核酸的純度。DNA的比值為1.8，RNA的比值為2.0。若DNA比值高于1.8，說明制劑中RNA尚未除盡。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白質將導致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干擾。當然也會出現(xiàn)既含蛋白質又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況，所以有必要結合凝膠電泳等方法鑒定有無RNA，或用測定蛋白質的方法檢測是否存在蛋白質。紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液。（2）瓊脂糖凝膠電泳法（熒光光度法）：對于很稀的核酸溶液，可以用瓊脂糖凝膠電泳法。溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，它插入到DNA分子中形成熒光結合物，使發(fā)射的熒光增強幾十倍，而熒光的強度正比于DNA的含量，將已知濃度的標準樣品作為電泳對照，就可以估計出待測樣品的濃度。用量只需要5-10ngDNA即可，肉眼觀察可檢測0.05μg-0.1μg的DNA。該方法只是估計水平，另外還應考慮DNA或RNA樣品中分子大小與標準對照中核酸分子的長度?！緝x器與試劑】：主要儀器：紫外分光光度計、石英杯、離心管、微量移液器；主要試劑：實驗1提取的質粒樣品、純水?！局匾獙嶒灢襟E和教學設計】：吸取5μLDNA樣品，加水至1ml混勻后，轉入分光光度計的石英比色杯中。如果樣品很少，可以用0.5ml的比色杯，上述核酸樣品與水的用量縮小一半。先用1ml水對分光光度計校正為零點。在260nm和280nm分別讀出光密度，DNA樣品的濃度我OD260×核酸稀釋倍數(shù)×50/1000；RNA樣品的濃度OD260×核酸稀釋倍數(shù)×40/1000；濃度單位為μg/μL。按步驟1的稀釋方式，DNA或RNA的濃度（μg/μL）均為OD260的10倍；如OD260為0.1，則樣品的濃度就為1μg/μLDNA或RNA。這樣稀釋倍數(shù)非常便于計算。若為DNA樣品，OD260/OD280比值大于1.8，說明仍存在RNA，可以考慮用RNA酶處理樣品；小于1.6，說明樣品中存在蛋白質或酚，應再用酚/氯仿抽提，用乙醚抽提后，以乙醇沉淀純化DNA。RNA樣品OD260/OD280比值小于2，也應該考慮再用酚/氯仿抽提?！緦嶒炞⒁馐马棥浚菏褂檬⒈瓡r要注意拿取方法，不要直接拿透光的那兩個側面；測量前要調(diào)零，測量不同樣品時要沖洗石英杯；正確開、關紫外分光光度計?！舅伎碱}】：實驗得出的數(shù)據(jù)是否合理？為什么？如果實驗測得A260/A280＝1.8，是否能說明提取的DNA樣品非常純凈？為什么？【實驗后記】：實驗3瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA【時間安排】：3學時【實驗類型】：基本訓練【目的要求】：了解：瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的原理；掌握：瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法；熟悉：瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的操作過程。【實驗原理】：瓊脂糖凝膠電泳是檢測DNA的常用方法。瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取，是一種聚合鏈線性分子，實驗室中常用兩種瓊脂糖，即常熔點的和低熔點的，它們都是瓊脂的衍生物，具有很高的聚合強度和很低的電內(nèi)滲，都是良好的電泳支持介質。核酸分子是兩性解離分子，在pH3.5時，堿基上的氨基基團解離，而三個磷酸基團中只有第一個磷酸解離，整個核酸分子帶正電荷，在電場中向負極泳動；在pH值為8.0～8.3時，堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負電荷，向正極移動。不同大小和構象的核酸分子的電荷密度大致相同，在自由泳動時，各核酸分子的遷移率區(qū)別很小，難以分開。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。由于DNA分子的電荷密度大致相同，即相同數(shù)量的鏈DNA幾乎具有等量凈電荷，它們以同樣速度向正極移動，因此，在一定電場強度下，DNA分子的移動速率取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構型。具有不同的相對分子質量的DNA片斷泳動速度不一樣，可進行分離。其遷移速度與相對分子質量的對數(shù)值成反比關系。凝膠不僅可以分離不同相對分子質量的DNA，也可以分離相對質量相同，但構型不同的DNA分子。如抽提質粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使提取的質?？赡艽嬖谌N構型：①超螺旋的共價閉環(huán)狀質粒（CC）；②解旋開環(huán)質粒DNA（OC）；③線狀質粒DNA（L）。電泳中，泳動最快的是CC，其次為L，最慢的為OC。DNA在瓊脂糖中的電泳遷移速率主要取決于：樣品DNA分子大小、DNA分子構象、瓊脂糖濃度、電場電壓、緩沖液、溫度等。加入EB，并將已知濃度的標準樣品和已知分子量大小的標準DNA片斷（即marker）作瓊脂糖凝膠電泳對照，可分別檢測樣品的濃度和分子量大小?！緝x器與試劑】：主要儀器：微波爐、穩(wěn)壓電泳儀、電泳槽、紫外燈箱、三角瓶、量筒、微量移液器、離心管、記號筆等；主要試劑：實驗1提取的質粒樣品、溴化乙錠、溴酚蘭、電極緩沖液、瓊脂糖、上樣緩沖液、標準DNAmarker?！局匾獙嶒灢襟E和教學設計】：準備好制膠板，封邊防漏。根據(jù)所需濃度稱取一定量的瓊脂糖，加入適量的0.5×或1×TBE或其它電泳緩沖液，微波爐加熱或沸水裕使瓊脂糖溶解。等凝膠溫度降到55℃～60℃時，加入溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5μL/ml，搖勻。將瓊脂糖倒入制膠板中，凝膠厚度一般為0.3～0.5cm，迅速插上梳子，檢查有無氣泡。凝膠充分凝固后，小心取出梳子，并撤除兩端封邊擋板。將凝膠放置于電泳槽中，加入相應的電泳緩沖液，使液面略高于膠面。在DNA樣品中加入1/6的上樣緩沖液，混勻后，稍離心，然后用移液器將DNA樣品加入樣品孔中。接通電源，選擇適當電壓和電泳方向，使DNA樣品由負極向正極電泳。當指示劑接近凝膠末端時，切斷電源，停止電泳。10、取出凝膠，在紫外燈下觀察，攝像?！緦嶒炞⒁馐马棥浚褐谱鳝傊悄z時，要戴手套，不要滴灑在臺面或地面，千萬不要觸碰溴化乙錠（EB），因為它是癌變的強烈誘變劑，用后用水徹底沖洗干凈；加樣時不要慌，不要抖動，以免碰裂加樣孔導致各個加樣孔中的DNA相互滲透觀看電泳結果時不要擁擠，認真辨認是否提取到了目的質粒DNA?！舅伎碱}】：DNA電泳方向與pH值有什么關系？在一定電場強度下，DNA分子的移動速率取決于分子篩效應？DNA在瓊脂糖中的電泳遷移速率與樣品DNA分子大小、DNA分子構象、瓊脂糖濃度、電場電壓、緩沖液、溫度等有什么樣的關系？【實驗后記】：實驗4PCR擴增獲取目的基因【時間安排】：3學時【實驗類型】：設計【目的要求】：了解：PCR反應的基本原理和引物設計的一般要求；掌握：通過PCR反應獲取目的基因的實驗技術；熟悉：PCR反應體系的加樣順序和PCR儀的正確使用方法。【實驗原理】：獲取目的基因是非常艱巨的工作，通常要求：靶基因表型明確；單個靶基因編碼優(yōu)良性狀或疾病基因；靶基因是一對等位基因控制的顯性基因；容易獲得目的基因的突變體和重組子等。但通過設計合理的基因克隆策略還是可以分離獲得目的基因的。使用的方法通常有：PCR擴增法、核酸探針篩選法、免疫反應篩選法、酶活性篩選法、差示雜交法、DNA標簽法、染色體巡查法（chromosomewalking）、圖位克隆法、酵母雙雜交法等等。聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction）簡稱PCR技術，是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應。分三步：①變性，通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA；②退火，當溫度降低時由于模板分子結構較引物要復雜得多，而且反應體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少；③延伸，在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的條件下，5′→3′的聚合酶催化以引物為起始點DNA鏈延伸反應。以上三個步驟為一個循環(huán)，每一循環(huán)產(chǎn)物可作為下一個循環(huán)的模板，幾十個循環(huán)后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到大量復制，可達2×106～7拷貝。引物的設計在PCR反應中極為重要，應遵循幾條原則：①堿基組成，G﹢C含量應在40～60%，4種堿基要在引物中分配均勻，如沒有多聚嘌呤或多聚嘧啶的序列，并且沒有二核苷酸重復序列；②長度，18～25個核苷酸，上下游引物的長度差別不能大于3bp；③不能有大于3bp的反向重復序列或自身互補序列的存在，這種序列可能成發(fā)夾結構，如果是這種結構在PCR條件下穩(wěn)定，它會非常有效地組織寡聚核苷酸和靶DNA之間的復性；④一個引物的3′末端都不能和其他任何引物互補，否則會形成引物二聚體。精心設計引物，應用熱啟動PCR或降落PCR或特制的DNA聚合酶都可以避免二聚體形成；⑤解鏈溫度（Tm）：計算出兩個引物的Tm值相差不能大于5℃，擴增產(chǎn)物的Tm值與引物的Tm值相差不能大于10℃，這些特性保證了擴增產(chǎn)物在每個PCR循環(huán)可有效地變性；⑥3′末端，每個因為的3′末端堿基應盡可能為G或C，但又不推薦使用3′末端有……NNCG或……NNGC序列的引物，因為末端GC堿基高的自由能可以村級發(fā)夾結構的形成，還可能產(chǎn)生二聚體；⑦向引物5′末端添加限制性酶切位點，噬菌體啟動子等序列，因為位于DNA分子5′末端的限制性酶切位點的切割效率比較低，所以，引物應當超出限制性內(nèi)切酶識別位點2－3個核苷酸，即至少包含有2－3個保護堿基；本實驗已知目的基因是在質粒pUCATPH中的抗潮霉素基因，見圖1要求通過PCR技術將目的基因擴增出來，關鍵是引物設計，在設計引物時要考慮到后續(xù)實驗中的DNA酶切、連接和轉化等，所用的克隆載體為pBSKS，見圖2圖2【儀器與試劑】：主要儀器：微量移液器、PCR儀、離心機、微波爐、電泳槽、電泳儀、紫外燈箱等。主要試劑：模板DNA、質粒DNA、引物、Tag酶及其他PCR反應體系的成分、DNA標準Marker、進口瓊脂糖、TE、上樣緩沖液、乙醇等?！局匾獙嶒灢襟E和教學設計】：取一個0.2mL的eppendorf管，在其中添加以下各種成分。模板DNA(質粒PUCATPH)2.5μL引物Doc1F0.5μL（注意：引物自己設計?。┮顳oc1R0.5μL（注意：引物自己設計！）10XBuffer2.5μLdNTP2μLddH2O17μLTaq酶（5U/μL）0.2μL總體積25μL稍離心。將反應管放入PCR熱循環(huán)儀，按下列條件設計程序，進行PCR反應。預變性94℃3min變性94℃50sec退火62℃50sec30個循環(huán)各個溫度可以自己設定！延伸72℃1.2min補充延伸72℃10min保存10℃forever反應結束后，取8μL反應液與2μL上樣緩沖液混合后用1.0％瓊脂糖凝膠電泳，以DNAmarker做標準對照，鑒定PCR產(chǎn)物是否存在以及大小。將三個PCR反應產(chǎn)物混合在一個管子中，然后添加1/10體積的3mol/L的pH5.2NaAc和2倍體積的冰冷無水乙醇，－20℃冰箱中放置30min以上。12000rpm離心5分鐘，將eppendorf管倒置于吸水紙上，室溫干燥5分鐘。30μLTE溶解沉淀，電泳確認回收PCR產(chǎn)物。【實驗注意事項】：在實驗步驟1中，每組做三個重復反應，先在一個0.5mL的eppendorf管中配制4個反應的混合液（不加模板），然后分裝到已加入了模板的0.2μL的eppendorf管中。整個操作過程最好在冰上進行，尤其Taq酶一定要在冰上操作。DNA片斷的回收，用DNA凝膠回收試劑盒，詳細操作見實驗6【思考題】：在設計PCR引物時，為什么在目的基因的上游、下游分別加上限制性內(nèi)切酶的識別序列？在配制PCR反應混合液時為什么要把各個反應管相同的成分加起來混合配制再分裝？為什么要多配一管的用量？除了PCR擴增獲取目的基因外，還有什么方法可以獲得目的基因？列出其中幾種的原理。【實驗后記】：實驗5DNA酶切【時間安排】：3學時【實驗類型】：基本訓練【目的要求】：了解：限制性內(nèi)切酶的一般特性，為了實現(xiàn)DNA的體外重組，選擇合適的限制性內(nèi)切酶，對質粒載體DNA和供體目的DNA進行酶切，產(chǎn)生粘性末端的原理；掌握：通過對DNA的酶切，學會設計構建體外重組DNA分子，根據(jù)目的基因合理選擇載體與限制性內(nèi)切酶以及DNA的酶切技術；熟悉：DNA酶切操作的實驗步驟?！緦嶒炘怼浚悍肿由飳W實驗中常用到限制性內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease），它能夠識別和切割雙鏈DNA（ds-DNA）分子內(nèi)特殊核苷酸序列。幾乎所有種類的原核生物都能產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶，根據(jù)其結構核作用特點分成Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三類。Ⅰ型、Ⅲ型核酸內(nèi)切限制酶一般都是大型的多亞基的蛋白復合物，既具有內(nèi)切酶的活性，又具有甲基化酶的活性。Ⅱ型酶由于其核酸內(nèi)切酶活性和甲基化作用是分開的，而且核酸內(nèi)切作用又具有序列特異性，所以在基因克隆中有特別廣泛的用途。在基因工程操作中通常使用Ⅱ型酶。（一）Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的一般特性各種限制性內(nèi)切酶能專一地識別堿基順序；識別堿基對數(shù)目一般為4、5、6bp的長度范圍；識別順序大多數(shù)為二重對稱，酶切后一般形成粘性末端，少數(shù)產(chǎn)生帶平端的DNA片段；不同來源的限制性內(nèi)切酶可以切割相同的序列，這些酶稱為同列酶。有的限制性內(nèi)切酶識別位點不同，但對DNA切割后產(chǎn)生相同的粘性末端；一般都以Mg2+為唯一的輔助因子，并要求有一定的鹽離子濃度；有些限制性內(nèi)切酶易受到甲基化酶的抑制，因此需要消除甲基化酶，才能順利酶解DNA；1U酶：是1微克的純DNA在指定緩沖液中，37℃（應是在理想條件下）酶解60分鐘完全酶切時所用的酶的活力；限制性內(nèi)切酶都較昂貴，極易失活，注意保存其活力。（二）設計構建體外重組DNA分子選用的限制性內(nèi)切酶都不能在目的基因內(nèi)部有專一的識別位點。構建體外重組DNA分子，最簡單的重組方式就是用兩種不同的限制性內(nèi)切酶同時分別酶切目的基因DNA的兩端和載體，分別產(chǎn)生兩個不同的粘性末端。這樣構建的重組DNA分子，目的基因DNA片段是從一個方向插入質粒載體中的，重組的效率較高，也易于篩選出重組子。如果目的基因DNA片段只能用一種限制性內(nèi)切酶進行切割，產(chǎn)生末端或粘性末端，那么載體也要用同樣的酶進行酶切，這樣構建的重組DNA分子，目的基因DNA片段以兩個方向插入質粒載體中，甚至目的基因DNA串連后再插入載體中，載體的自連也較多，因而重組效率差。這樣篩選重組子比使用兩種不同限制性內(nèi)切酶構建的重組DNA分子工作量大些。（三）酶切反應反應需要Mg2+和一定鹽離子濃度，如果緩沖液中鹽離子濃度使用不當，會使酶的識別位點發(fā)生改變。反應溫度一般是37℃，極少個別酶要求在25℃、30℃、50℃、60℃、65℃等。酶切反應時間有30min、60min、2hours或過夜，一般來說，酶純度不佳，酶切時間不能太長?！緝x器與試劑】：主要儀器：離心機、離心管、微量移液器、冰盒、電泳儀、電泳槽、恒溫水浴鍋等。主要試劑：質粒、PCR產(chǎn)物、限制性內(nèi)切酶、限制酶緩沖液、上樣緩沖液、乙醇、TE等?！局匾獙嶒灢襟E和教學設計】：在0.5mLeppendorf管中加入下列成分APCR回收產(chǎn)物（目的基因）：ddH2O7μL回收產(chǎn)物10μL(約1μg)10X通用Buffer2μLHindⅢ(10U/μL)0.5μL如果前面自己設計的不是這兩種酶，則使用自己設計的酶BamHⅠ(10U/μL)0.5μL如果前面自己設計的不是這兩種酶，則使用自己設計的酶總體積20μLBpBSKS質粒酶切ddH2O7μLpBSKS質粒10μL(約2μg)10X通用Buffer2μLHindⅢ(10U/μL)0.5μLBamHⅠ(10U/μL)0.5μL總體積20μL混勻，稍離心，在37℃反應2-4小時，或過夜。加入反應終止液以終止酶切反應（一般可省略）取10μL酶切反應液，加入3μL上樣緩沖液，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，參照標準分子量marker，回收目的條帶?！緦嶒炞⒁馐马棥浚篋NA樣品與限制性內(nèi)切酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的正確性，確認樣品確實被加入反應體系，酶的操作必須嚴格在冰浴條件下進行，用完后立即放回－20℃冰箱。使用兩種酶同時進行DNA酶切時，為了節(jié)省反應時間，通常希望在同一反應體系內(nèi)進行，可以采用通用緩沖液（universalbuffer）,但有時還會難以找到合適的universalbuffer。為了節(jié)省酶的使用，本實驗我們將為大家配好反應混合液，請同學們分裝即可。各種酶切反應的緩沖液歸納為三類：高鹽、中鹽和低鹽離子強度的緩沖液。市售各類酶都配有制定的緩沖液，如果有兩種酶要用兩種不同濃度的緩沖液，一般先用低濃度，然后再補加鹽調(diào)節(jié)至更高鹽濃度。DNA的純度直接影響酶切產(chǎn)物的質量，DNA中的DNA酶切蛋白、RNA及SDS、酚、氯仿、乙醇、EDTA等雜質都影響酶切效果。DNA中的核酸酶、蛋白（雜酶）往往隨酶切時間的增長使DNA降解越嚴重。DNA中的雜DNA也有競爭酶的切口，往往造成切不動，DNA中的有機離子與溶劑抑制酶的活性，也使酶失活，DNA切不動或使酶解產(chǎn)生星號反應。產(chǎn)生星號反應的原因還有因酶濃度太大，離子濃度太低等，DNA的構型多，也影響酶切效果。【思考題】：限制性內(nèi)切酶酶解中通常遇見什么問題？分析可能存在的原因，有什么解決的辦法？在選擇限制性酶酶切目的基因片斷時，我們必須充分考慮什么因素？實驗中用一種酶酶切和用兩種酶酶切，對后續(xù)實驗有什么影響？【實驗后記】：實驗6目的DNA的回收【時間安排】：3學時【實驗類型】：基本訓練【目的要求】：了解：常用目的DNA的回收方法；掌握：從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的實驗技術；熟悉：膠回收試劑盒回收DNA的操作流程?！緦嶒炘怼浚簭暮懈鞣N不同大小的DNA混合物（如：內(nèi)切酶酶解的DNA）中分離純化特定分子量的DNA片段是基因工程操作的基礎工作。實驗室中最常用的是凝膠電泳分離和回收的方法。許多生物公司都已經(jīng)開發(fā)從凝膠中回收DNA片段的試劑盒。本實驗計劃采用UNIQ－10柱式DNA膠回收試劑盒回收目的DNA。該試劑盒主要含有UNIQ－10柱式離心管和BindingBuffer、Washsolution、ElutionBuffer三種溶液。UNIQ－10柱式離心管中含有一小片濾膜，通常是DEAE纖維素即二乙基氨基乙基（diethylaminoethyl）纖維素，在它的纖維骨架鏈上，連接有許多陽離子交換基團，是一種吸附陰離子基團的陰離子交換纖維素，它能結合帶負電荷的DNA分子。DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，將DNA片段轉移到DEAE纖維素上，再用高離子緩沖液將其從DEAE濾膜上洗脫下來。BindingBuffer主要是融解瓊脂糖凝膠塊，釋放DNA；Washsolution沖洗掉雜質；ElutionBuffer洗脫并保存DNA?；厥誅NA片段的方法還有很多，如：DEAE纖維素紙插片電泳法、電泳洗脫法、低熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法、玻璃粉末洗脫法聚丙烯酰銨凝膠電泳回收法、蔗糖梯度超速離心分離法等等，這里不具體闡述?！緝x器與試劑】：主要儀器：電泳儀、電泳槽、紫外觀察箱、手術刀、eppendorf離心管、電子天平、離心機、恒溫水浴鍋、主要試劑：UNIQ－10柱式DNA膠回收試劑盒、無水乙醇【重要實驗步驟和教學設計】：A從瓊脂糖凝膠中回收DNA通過瓊脂糖凝膠電泳將目的片斷與其它DNA盡可能分開，然后用干凈的手術刀割下含需回收的瓊脂塊，放入1.5mL離心管中。判斷DNA片斷的位置時，要盡可能使用長波長紫外光，在紫外光下照射的時間盡可能短。按400μL/100mg瓊脂糖凝膠的比例加入BindingBufferⅡ，置于50～60℃水浴中10分鐘，使膠徹底融化。加熱融膠時，每2分鐘混勻一次。將融化的膠溶液轉移到套放在2mL收集管內(nèi)的UNIQ－10柱中，室溫放置2分鐘。8000rpm室溫離心1分鐘。取下UNIQ－10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ－10柱放入到同一個收集管中，加入500μLWashsolution，8000rpm室溫離心1分鐘。重復步驟4一次。取下UNIQ－10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ－10柱放入同一個收集管中，12000rpm室溫離心15秒。將UNIQ－10柱放入一根新的1.5mL離心管中，在柱子膜中央加入40μLElutionBuffer或水（ph>7.0）,室溫或37℃放置2分鐘。12000rpm室溫離心1分鐘，離心管中的液體即為回收的DNA片斷，可立即使用或存放于－20℃?zhèn)溆?。B從溶液中回收DNA:根據(jù)溶液的體積和所要回收的DNA的含量，加入3倍體積的BingdingBufferⅡ。如果溶液的體積不足50μL，加TE補足到50μL，再加入150μLBingdingBufferⅡ混勻。以下同瓊脂糖膠中回收DNA步驟3－8?！緦嶒炞⒁馐马棥浚和谌…傊悄z塊時，要戴手套，注意溴化乙錠（EB）的安全使用；加入Washsolution、ElutionBuffer時，要對著濾膜滴加，又不要刺破濾膜；注意：對于高濃度的膠（1.5－2.0％），每100mg膠加入700μLBindingBufferⅡ，加熱融膠的時間可延長到15分鐘，以保證全部融化。提高洗脫溫度到55-80℃有利于DNA的洗脫效率?！舅伎碱}】：在挖取瓊脂糖凝膠塊時為什么盡量減少不含目的DNA的凝膠？為什么盡量用長波長紫外線，并且盡量減少紫外線的照射時間？列舉幾個DNA回收的其他幾種方法原理?！緦嶒灪笥洝浚簩嶒?目的基因與載體的體外連接【時間安排】：3學時【實驗類型】：基本訓練【目的要求】：了解：DNA連接酶的一般特性、連接反應條件和DNA連接方式；掌握：用T4DNA在連接酶降載體與目的基因連接起來，構建體外重組DNA分子，同時學習幾種DNA連接的方法。熟悉：DNA連接反應所用的連接酶以及連接反應體系的構建。【實驗原理】：DNA連接酶催化雙鏈DNA中相鄰堿基的5’磷酸和3’羥基間磷酸二脂鍵的形成，利用DNA連接酶將適當切割的載體DNA與目的基因DNA進行共價連接，就能構建重組DNA分子。構建體外重組DNA分子一般是在T4DNA連接酶的作用下，有Mg2+ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將上述二種酶切后的DNA分子進行連接。（一）DNA連接酶的作用步驟1、T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶-AMP復合物（腺苷酰酶）2、酶-AMP復合物再結合到具有5′－磷酸基和3′－羥基切口的T4DNA上，使DNA腺苷化。3、產(chǎn)生一個新的磷酸二酸二脂鍵，把缺口封起來。（二）DNA的連接方式在T4DNA連接酶的作用下的DNA連接反應，一般講是隨機的，連接方式有：①自連；②兩種片段相連；③三個片段以上的自連與互連，一般這種幾率較少，但也有?？梢酝ㄟ^對載體、目的基因的處理以控制和調(diào)整DNA的有效連接。如，通過控制載體DNA與目的DNA的分子比例，可以影響重組率。一般情況下，對分離片段來講，載體DNA的摩爾數(shù)與目的基因的摩爾數(shù)之比為1︰5，但目的基因的比例太多，容易產(chǎn)生自連后插入載體的多聚體。連接體積太大，自連機會多。（三）連接反應的條件1、緩沖液含有Mg2+作為輔助因子，ATP提供能量，同時也有保護和穩(wěn)定酶活性的物質，如DTT（二硫蘇糖醇）、BSA（小牛血清蛋白）。2、溫度：連接反應溫度在37℃時有利于連接酶的活性，但該溫度下，粘性末端的氫鍵結合是不穩(wěn)定的。因此在實際操作時，DNA分子粘性末端的連接反應溫度是折中采取催化反應與末端粘合的溫度，一般為12～163、時間：12～16h（過夜）或7～8℃（四）幾種DNA連接方法1、粘性末端連接法：即用專一性限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生粘性末端，再通過DNA連接酶（T4DNA連接酶）進行體外連接。2、平頭末端連接法：是利用某些酶對DNA能切出平整的末端，然后利用T4DNA連接酶將兩者連接。它要求DNA濃度高，酶用量比粘性末端的連接大20～100倍。3、多聚核苷酸投影法：采用任一種限制性內(nèi)切酶把DNA切開，利用DNA末端轉移酶把互補的多聚核苷酸（polyA與polyT或polyG與polyC）連接到兩者DNA片段的末端，然后用DNA聚合酶將其連接。4、人工街頭（Waker）法：在要連接的外源基因與載體DNA的末端，先接上一段互補的人工接頭，這個接頭就是酶切酶的識別位點，因此可再用一種或二種限制性內(nèi)切酶將其切開，產(chǎn)生粘性末端，再將外源基因與載體DNA連接?！緝x器與試劑】：主要儀器：離心管、16℃培養(yǎng)箱、離心機、微量移液器、冰盒等。主要試劑：酶切后的基因DNA片段和載體DNA片段、T4DNA連接酶以及10倍的連接緩沖液?！局匾獙嶒灢襟E和教學設計】：在一個0.5mL的eppendorf管中加入2μL酶切后的載體與6μL目的基因片斷。添加1μL的10X連接buffer以及1μL的T4DNA連接酶即PCR產(chǎn)物6μL酶切質粒（pBSKS）2μL10X連接buffer1μLT4DNA連接酶1μL總體積10μL混勻后3000rpm短暫離心將液體全部甩到管底。16℃條件下保溫過夜或4℃過夜。連接產(chǎn)物用于轉化感受態(tài)細胞。【實驗注意事項】：連接時外源基因量要多些，載體的量要少些，這樣碰撞的機會就多些，否則載體自身環(huán)化就比較嚴重。連接酶比較昂貴，酶的用量不要過多。連接反應需要ATP提供能量，在連接Buffer中含有ATP，所以盡量避免連接Buffer反復凍融。【思考題】：影響DNA體外連接的因素有哪些？實驗過程應注意什么問題？【實驗后記】：實驗8大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備【時間安排】：3學時【實驗類型】：基本訓練【目的要求】：了解：制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的原理；掌握：大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備方法和技術；熟悉：制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的實驗步驟。【實驗原理】：在原核生物中，轉化是一種普遍的現(xiàn)象，在細胞間轉化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與受體菌在進化過程中的親緣關系，另一方面還與受體菌是否處在一種感受狀態(tài)有很大的關系。所謂感受態(tài)是指細胞處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性所決定的，同時也受菌齡、外界環(huán)境因子等影響。實驗中通常使用氯化鈣制備感受態(tài)大腸桿菌細胞。因為鈣離子能夠誘導大腸桿菌形成感受態(tài)細胞。對于鈣離子誘導的完整細胞轉化而言，菌齡、CaCl2處理時間、感受態(tài)細胞的保存期以及熱脈沖時間都是很重要的因素，其中感受態(tài)細胞通常在12～24小時內(nèi)轉化率最高，之后轉化率急劇下降。因此在制備感受態(tài)細胞時，將細胞培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6后放入冰浴中使之停止生長，然后進行細胞處理。外界環(huán)境因子環(huán)腺苷酸（cAMP）及鈣離子（Ca2+）能夠提高受體細胞的感受態(tài)水平。另外，細胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在生長對數(shù)期，新鮮幼嫩的細胞是制備感受態(tài)細胞和進行成功轉化的關鍵。制備感受態(tài)大腸桿菌的方法還有Hanahan方法（用于高效轉化）和Inoue方法（用于制備超級感受態(tài)細胞）?！緝x器與試劑】：主要儀器：離心管、三角瓶、搖床、超凈工作臺、冷凍離心機、冰盒、碎冰、微量移液器等。主要試劑：LB培養(yǎng)基、大腸桿菌菌株、CaCl2溶液甘油等?！局匾獙嶒灢襟E和教學設計】：從大腸桿菌DH10B平板上挑取一個單菌落接于2ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取0.5ml菌液轉接到一個含有50ml的LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)2～3h，此時，OD60≤0.4～0.6，細胞數(shù)務必＜108將菌液轉移到50ml離心管中，冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃離心10min（4000r/min），回收細胞。倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡。用冰冷的0.1mol/L10ml懸浮沉淀，立即放在冰上保溫30min。0～4℃，4000r/min，離心10min回收細胞。用冰冷的0.1mol/LCaCl22ml懸浮細胞（務必放冰上）。分裝細胞，每200μL一份。此細胞為感受態(tài)細胞?！緦嶒炞⒁馐马棥浚簢栏駸o菌操作，謹防雜菌污染。實驗中凡是涉及溶液的轉移、分裝等需要敞開實驗器具的操作，均應該在無菌超凈工作臺進行。細胞最好是從-70℃和-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。所用的CaCl2應該是高純度的。整個操作均需要在冰上操作，不要離開冰浴條件，否則細胞轉化率將會降低?！舅伎碱}】：實驗過程中應注意什么問題？制備出來的感受態(tài)細胞在什么時候做轉化最佳？【實驗后記】：實驗9大腸桿菌感受態(tài)細胞的轉化【時間安排】：3學時【實驗類型】：基本訓練【目的要求】：了解：轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞的原理；掌握：大腸桿菌感受態(tài)細胞的轉化方法和技術；熟悉：轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞的實驗步驟。【實驗原理】：轉化是指質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌，并使細菌細胞的生物學特性發(fā)生可遺傳的改變的過程。用冰冷CaCl2溶液處理和短暫熱休克處理是轉化的常用方法，也是最便宜而簡便的方法。其原理是當細菌處于0℃的CaCl2低滲溶液中時，菌體細胞膨脹造成球形，同時轉化混合物中的DNA形成抗Dnase的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng)過42℃短時間熱擊處理，促進細胞吸收DNA復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長1小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，重組子中的基因在被轉化的細菌中得到表達，再通過選擇性培養(yǎng)基平板即可篩選出所需要的轉化子。轉化的方法還有：Hanahan方法、Inoue方法、PEG法、電擊法等等?！緝x器與試劑】：主要儀器：超凈工作臺、離心機、42℃恒溫水浴鍋、37℃培養(yǎng)箱、離心管、三角瓶、搖床、冰盒、碎冰、微量移液器等。主要試劑：感受態(tài)細胞、連接產(chǎn)物、LB培養(yǎng)基（含抗生素的培養(yǎng)基平板）、X-gal、IPTG等?！局匾獙嶒灢襟E和教學設計】：1制備含有Amp的LB培養(yǎng)基平板。取一管100μL的感受態(tài)細胞（如果是冰凍的則需要在冰上化凍后，進行操作），加入重組質粒（質粒與目的基因）的連接產(chǎn)物5μL(不要超過5μL)，輕輕用槍吹打均勻。置冰浴中20min。然后42℃保溫90sec或37℃保溫5min，迅速放入冰中，冰浴3－5min添加1mL的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1hou。3000rpm離心5min,棄去上清，余下全部樣品（約0.1μL）用槍輕輕吹勻，吸至含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基上，另添加20μL20mg/mL的X-gal和40μL100mmol/L的IPTG，均勻涂布。培養(yǎng)基正面放置37℃培養(yǎng)箱中30min后，倒置培養(yǎng)16個小時。【實驗注意事項】：進行轉化時的質粒量應該是感受態(tài)細胞總量的1/10以下。IPTG是針對具有l(wèi)acZq基因型的大腸桿菌誘導表達lacZ而添加的，而對于不具有l(wèi)acZq菌株則沒有添加的必要。為了使藍色菌落更明顯，可以將培養(yǎng)基放于4℃冰箱中3hou。制備感受態(tài)細胞時一定要在冰上操作。【思考題】：轉化過程中要注意什么問題？為什么要先在不含有抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個小時，然后再涂布于含有抗生素的平板上？除了熱激轉化外，還有什么轉化方法？【實驗后記】：實驗10重組子的篩選【時間安排】：3學時【實驗類型】：基本訓練【目的要求】：了解：α互補原理以及其他篩選鑒定方法；掌握：通過本實驗學會重組DNA（重組子）的篩選方法和技術；熟悉：重組DNA篩選的操作步驟?！緦嶒炘怼浚褐亟M質粒轉化宿主細胞后，還需對轉化菌落進行篩選，利用α互補現(xiàn)象進行篩選是最常用的一種鑒定方法。α互補是指E.coliβ-半乳糖苷酶的兩個無活性片段組合而成為功能完整的酶的過程。該酶是把乳糖切成葡萄糖和半乳糖的酶，該酶基因來自大腸桿菌LacⅠ基因，刪去LacⅠ基因中編碼起始甲硫氨酸的5′區(qū)，翻將從下游的甲硫氨酸開始，從而產(chǎn)生酶的C端片段。現(xiàn)用的許多載體都含有β-半乳糖苷酶的前146各個氨基酸的編碼序列及其調(diào)控序列，即N端片段序列，其中在編碼序列中包含著保持讀框的多克隆位點，會在酶的N中引入少量不影響其功能的氨基酸。當在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導著氨末端片段，基β-半乳糖苷酶的合成，從而互補β-半乳糖苷酶缺陷的宿主。合成的β-半乳糖苷酶可將無色的X-gal切割城半乳糖和深藍色的底物5-溴-4-靛藍，在培養(yǎng)基平板上就形成藍色菌落。但在多克隆位點插入外源DNA時，導致β-半乳糖苷酶的氨末端失活（即LacⅠ基因表達中斷），從而不能進行α互補，因此帶有重組載體質粒的細菌產(chǎn)生白色菌落，即通過在X-gal平板上的藍/白顏色篩選重組子。除了α互補篩選法外，還有抗藥性篩選法、營養(yǎng)缺陷型篩選法、電泳篩選法、PCR檢測法、核酸碳針篩選法、DNA序列分析。【儀器與基本操作】：主要儀器：超凈工作臺、涂布工具、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱等。主要試劑：LB培養(yǎng)基（含抗生素氨芐青霉素、卡那霉素）、X-gal、IPTG等?！局匾獙嶒灢襟E和教學設計】：將含有重組子的并活化后的菌液均勻涂布于含Amp抗生素的并添加X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至藍/白斑出現(xiàn)。觀察平板上長出的抗性菌落（轉化子），有白色菌落和藍色菌落，白色菌落可視為重組子，藍色菌落為非重組子。統(tǒng)計藍、白斑的比例?！緦嶒炞⒁馐马棥浚恨D化后的大腸桿菌必須在含有適當抗生素（氨芐青霉素、卡那霉素）的LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，然后抽提質粒。抽提質粒所挑選的菌落必須是單菌落。菌落長出后可以放到4℃稍培養(yǎng)，增加顯色?！舅伎碱}】：α互補篩選重組子的原理是什么？白色菌落是否都是真正重組子？為什么？【實驗后記】：實驗11PCR鑒定重組子【時間安排】：3學時【實驗類型】：驗證【目的要求】：了解：PCR鑒定重組子的方法原理；掌握：通過本實驗學會PCR鑒定重組子的方法和技術；熟悉：PCR鑒定重組子的操作步驟?！緦嶒炘怼浚浩桨蹇股嘏c藍白斑篩選是非常重要，但并不精確，因為平板上許多菌落是假陽性的情況，如載體DNA缺失后自我連接引起的轉化，非特異性片段插入組建載體的轉化，而真正陽性重組體只有很小一部分。要確證外源目的基因片段插入載體，還要鑒定轉化子中重組質粒DNA分子的大小。所以必須從轉化子中鑒定出真正的重組子。PCR檢測法是比較簡便的方法。根據(jù)實驗4，可以利用現(xiàn)有的引物，以含有重組子的菌液為模板，或先通過堿變性法提取質粒，再以質粒為模板，進行PCR擴增，檢測構建質粒是否是所期望的重組質粒。其他方法還有酶切鑒定法、核酸探針分子雜交法、DNA序列分析法等。【儀器與基本操作】：主要儀器：超凈工作臺、涂布工具、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱、PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽等。主要試劑：LB培養(yǎng)基（含抗生素氨芐青霉素、卡那霉素）、X-gal、IPTG、瓊脂糖、電泳緩沖液、DNA標準Marker等?！局匾獙嶒灢襟E和教學設計】：按照藍白斑篩選法，挑取白色單菌落接入1.5mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)三個小時，取出2μL菌液作為模板進行PCR反應，反應體系其它成分同實驗4。剩余菌液繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，4℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物電泳，以目的基因片斷作為對照，確認出正確插入的重組質粒。具體操作方法間實驗3【實驗注意事項】：轉化后的大腸桿菌必須在含有適當抗生素（氨芐青霉素、卡那霉素）的LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，然后再以菌液為模板，或抽提質粒，抽提質粒所挑選的菌落必須是單菌落。電泳操作中要注意溴化乙錠的安全使用方法。【思考題】：以菌液做模板和以質粒做模板進行擴增有什么區(qū)別？還有什么方法可以鑒定重組子？【實驗后記】：實驗12酶切鑒定重組子【時間安排】：3學時【實驗類型】：驗證【目的要求】：了解：酶切鑒定重組子方法的原理；掌握：通過本實驗學會酶切鑒定重組子的方法和技術；熟悉：酶切鑒定重組子的操作步驟?！緦嶒炘怼浚浩桨蹇股嘏c藍白斑篩選是非常重要，但并不精確，因為平板上許多菌落是假陽性的情況，如載體DNA缺失后自我連接引起的轉化，非特異性片段插入組建載體的轉化，而真正陽性重組體只有很小一部分。要確證外源目的基因片段插入載體，還要鑒定轉化子中重組質粒DNA分子的大小。所以必須從轉化子中鑒定出真正的重組子。酶切電泳也是比較常用的方法。即從轉化子中，利用堿變性法提取質粒，通過瓊脂糖凝膠電泳測定它們的大小，并用酶切后電泳進一步驗證質粒的重組情況。但對于插入片段大小相似的非目的基因片段，電泳法仍不能鑒別出假陽性重組子。其他方法還有核酸探針分子雜交法、DNA序列分析法等?！緝x器與基本操作】：主要儀器：超凈工作臺、涂布工具、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱、電泳儀、電泳槽、等。主要試劑：LB培養(yǎng)基（含抗生素氨芐青霉素、卡那霉素）、X-gal、IPTG、提取質粒的試劑、限制性內(nèi)切酶、瓊脂糖、電泳緩沖液、DNA標準Marker等。【重要實驗步驟和教學設計】：轉化后的細胞在含有抗生素的LB平板上，培養(yǎng)過夜后，在平板上會長出許多抗性菌落(轉化子)，其中有白色菌落（可視為重組子）和藍色菌落（可視為非重組子）。挑取白色單菌落接入5mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取1.5mL菌液提取質粒（具體方法見實驗1），另取0.5mL菌液至一新的eppendorf管，于4℃保存?zhèn)溆?。電泳檢測提取出來的質粒。按如下體系建立酶切反應H2O7μL如果前面自己設計的不是這兩種酶，則使用自己設計的酶重組質粒10μL(約2μg)如果前面自己設計的不是這兩種酶，則使用自己設計的酶10X通用Buffer2μLHindⅢ(10U/μL)0.5μLBamHⅠ(10U/μL)0.5μLTotalvolume20μL37℃利用空載體與目的基因片斷作為對照，對酶切后的重組質粒進行電泳，從酶切后的片斷的數(shù)目及大小上進行確認?！緦嶒炞⒁馐马棥浚恨D化后的大腸桿菌必須在含有適當抗生素（氨芐青霉素、卡那霉素）的LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，然后抽提質粒。抽提質粒所挑選的菌落必須是單菌落。酶切反應體系各個成分的準確性、電泳操作中要注意溴化乙錠的安全使用方法。【思考題】：酶切電泳法鑒定重組子有什么不足的地方？還有什么方法可以鑒定重組子？你認為哪種方法最好？【實驗后記】：實驗13表達載體的構建【時間安排】：3學時【實驗類型】：設計【目的要求】：了解：表達載體構建的常用方法；掌握：表達載體構建的實驗技術；熟悉：表達載體構建的技術路線和實驗流程?！緦嶒炘怼浚和庠椿蛟谑荏w細胞內(nèi)表達與表達載體構建有密切關系。原核生物中表達載體的構建一般要求：（1）有一個強的原核啟動子及兩側的調(diào)控序列；（2）位于讀碼框上游的SD序列與起始密碼子AUG之間有合適的距離；（3）在外源基因和啟動子之間有正確的讀碼框；（4）外源基因下游應加入不依賴ρ因子的轉錄終止區(qū)。一般表達載體都具有多克隆位點，對表達載體和外源基因用相同的兩種酶雙酶切后，再用T4DNA連接酶把外源基因連入表達載體中，通過酶切、PCR鑒定，如果插入的片段大小和方向與外源基因一致，則成功構建重組子。pET系列質粒具有強啟動子、RBS、基因標簽（如T7-Tag、His-Tag等）3個成一組，目前許多基因表達載體都是由三種成一組的三個位相載體構成的，即每種載體相對于起始密碼ATG的轉譯位相的位點是不同的，所以在與外源基因拼接時，其中必有一種位相可以保證外源基因處于正確的閱讀框架之中。如：pET-28a、b和c(+)，它們具有BamHI、EcoRI、SacI、SalI、HindIII、NotI、XhoI等酶切位點，His標簽以及T7標簽，外源基因可與N-端的His標簽或T7標簽相融合，以提高外源基因的表達量?！緝x器與試劑】：主要儀器：離心管、電泳儀、電泳槽、微量移液器、離心機、超凈工作臺、恒溫箱培養(yǎng)箱、恒溫搖床等。主要試劑：擴增質粒和PCR產(chǎn)物、LB培養(yǎng)基、限制性內(nèi)切酶、抗生素、瓊脂糖、陽性克隆轉化子、上樣緩沖液等?！局匾獙嶒灢襟E和教學設計】：提取質粒PET28c或pGEX-2TK（實驗1已做）質粒PET28c酶切，按照如下建立酶切反應體系（具體操作步驟如實驗3）ddH2O7μL如果前面自己設計的不是這兩種酶，則使用自己設計的酶PET28c質粒10μL(約2μg)如果前面自己設計的不是這兩種酶，則使用自己設計的酶10X通用Buffer2μLHindⅢ(10U/μL)0.5μLBamHⅠ(10U/μL)0.5μL總體積20μL37℃保溫3小時或過夜3電泳檢測，具體操作過程如實驗34以標準分子量marker做參照，回收目的條帶（具體回收操作見回收試劑盒）5載體和目的基因的連接，按照如下體系建立連接反應具體操作步驟如實驗4PCR酶切產(chǎn)物（實驗2）6μL酶切質粒（PET28c）2μL10X連接buffer1μLT4DNA連接酶1μL總體積10μL6混勻后3000rpm短暫離心將液體全部甩到管底。16℃條件下保溫過夜或4℃過夜。連接產(chǎn)物用于轉化感受態(tài)細胞BL21?！緦嶒炞⒁馐马棥浚恨D化操作如實驗5，唯一的不同只是在LB培養(yǎng)基中加入一定濃度的潮霉素。在平板上長出的菌落為表達了目的基因的重組子。挑取單菌落，對重組子進行鑒定，詳細操作步驟如實驗6【思考題】：表達載體構建時要考慮什么因素？如何做到高效表達？【實驗后記】：實驗14外源基因的誘導表達【時間安排】：3學時【實驗類型】：綜合【目的要求】：了解：外源基因在受體細胞內(nèi)表達及其影響因素；掌握：掌握通過誘導劑誘導目的基因表達的技術；熟悉：將目的基因插入表達載體中，表達完整目的基因的技術路線和實驗流程。【實驗原理】：外源基因在受體細胞內(nèi)表達與否以及表達水平受多種因素制約：外源基因是否插入正確的閱讀框架，只有與載體DNA的起始密碼相吻合時，才算處于正確的閱讀框架之中。靶基因的有效轉錄和及時的終止，如啟動子的作用和核糖體RNA轉錄終止子的作用。mRNA的有效翻譯，涉及到SD序列的作用，以及SD序列與起始密碼子（AUG）的距離。④轉錄和翻譯后適當修飾和加工。如合成的蛋白質向胞外分泌等。外源基因在原核生物中高效表達除了有合適的載體外，還要有適合的宿主菌以及一定的誘導因素。根據(jù)表達載體的不同有不同的誘導因素，如光、溫度和化學物質等。如含有LacⅠ的啟動子的載體（如PET28c（+））的基因表達是受誘導劑IPTG誘導；pBV211的基因表達是受溫度控制，在42℃條件下可誘導外源基因的大量表達。原核表達載體啟動子的轉錄常常是可以控制的，即一般情況下不轉錄，受誘導劑誘導時就能轉錄，從而帶動外源基因的表達，提高目的蛋白的產(chǎn)量和質量。如pET由于帶有來自大腸桿菌的乳糖操縱子，它由啟動基因、分解產(chǎn)物基因活化擔保（CAP）結合位點、操縱基因及部分半乳糖酶結構基因組成，受分解代謝系統(tǒng)的正調(diào)控和阻遏物的負調(diào)控。正調(diào)控是通過CAP（catabolitegeneactivationprotein）因子和cAMP來激活啟動子，促進轉錄；負調(diào)控則是由調(diào)控基因產(chǎn)生lacZ阻遏蛋白與操縱子結合，阻遏轉錄。乳糖的存在可以解除這種阻遏，其次IPTG是β-半乳糖苷酶底物類似物，具有很強的誘導能力，能與阻遏蛋白結合，使操縱子游離，促進轉錄（誘導lacZ啟動子轉錄）。所以，可以通過在培養(yǎng)基中添加IPTG誘導基因表達?！緝x器與試劑】：主要儀器：離心管、電泳儀、電泳槽、微量移液器、離心機、超凈工作臺、恒溫箱培養(yǎng)箱、恒溫搖床等。主要試劑：擴增質粒和PCR產(chǎn)物、LB培養(yǎng)基、限制性內(nèi)切酶、抗生素、瓊脂糖、陽性克隆轉化子、上樣緩沖液等?！局匾獙嶒灢襟E和教學設計】：僅以IPTG誘導pET重組子的表達為例：將含有pET28c和pET28c重組子的BL21菌落分別接種于2ml含卡那霉素（50μg/ml）的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。分別取100μL培養(yǎng)液（2％的接種量）于5ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2－3小時，至OD600達0.5左右。取出1.0ml樣品作為IPTG誘導前的樣品。其余樣品中添加12μL的100mMIPTG繼續(xù)培養(yǎng)。分別在1、2、3、4、5小時后取出1.0ml樣品作為IPTG誘導后的樣品。將IPTG誘導前