生化分離技術(shù)核心知識(shí)點(diǎn)

第一章生物技術(shù)下游加工過(guò)程特點(diǎn)：1.發(fā)酵液或培養(yǎng)液是產(chǎn)物濃度很低的水溶液.培養(yǎng)液是多組分的混合物.生物產(chǎn)品的穩(wěn)定性差.對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量要求很高生物技術(shù)下游加工的一般步驟：1.發(fā)酵液的預(yù)處理與固-液分離.初步純化.高度純化.成品加工生物技術(shù)產(chǎn)品的類型：1.按分子質(zhì)量：小分子質(zhì)量、大分子質(zhì)量2.按產(chǎn)品所處位置：細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外第一章共價(jià)過(guò)程中導(dǎo)致的失活：1.集團(tuán)本身的共價(jià)修飾，導(dǎo)致基團(tuán)功能不起作用2.蛋白質(zhì)上任何基因的共價(jià)修飾，使三維結(jié)構(gòu)受到破壞對(duì)策：1.避免細(xì)菌污染.水分的除去.高濃度的化學(xué)物質(zhì)會(huì)使蛋白質(zhì)變性，應(yīng)避免.高濃度的底物、多元醇和穩(wěn)定鹽利于穩(wěn)定蛋白質(zhì).對(duì)許多蛋白質(zhì)而言，為防止硫羥基的氧化和降低光氧化的危險(xiǎn)，除去空氣至關(guān)第三章懸浮液預(yù)處理方法：1.加熱法.調(diào)節(jié)懸浮液pH值.絮凝和凝聚.使用惰性助濾劑去除懸浮顆粒，依據(jù)物理、化學(xué)性質(zhì)：顆粒密度、顆粒大小、顆粒表面性質(zhì)過(guò)濾方法：恒壓過(guò)濾、恒速過(guò)濾、變速變壓過(guò)濾過(guò)濾器類型：1.真空過(guò)濾器：轉(zhuǎn)鼓真空過(guò)濾器、圓盤真空過(guò)濾器、水平帶式真空過(guò)濾器

2.壓濾器：板框壓濾器、加壓葉濾器、帶式壓濾器、氣壓罐式連續(xù)壓濾器帶式壓濾器的工作必要條件：料液過(guò)濾前都要加絮凝劑進(jìn)行預(yù)處理，使懸浮液成絮團(tuán)錯(cuò)流過(guò)濾：如果料液給過(guò)濾介質(zhì)表面一個(gè)平行的大流量的沖刷，則過(guò)濾介質(zhì)表面積累的濾餅會(huì)減少到可以忽略的程度，則通過(guò)過(guò)濾介質(zhì)的流速則減少。細(xì)胞壁經(jīng)酸水解，可以獲得：肽聚糖、氨基酸、磷壁酸、糖、脂質(zhì)破碎率的評(píng)價(jià)：1.直接計(jì)數(shù)法2.間接計(jì)數(shù)法細(xì)胞的破碎按是否外加作用分為：機(jī)械法（高壓勻漿法、珠磨、超聲波法、非機(jī)械法超聲波法理論依據(jù)：超聲波破碎細(xì)胞的機(jī)理可能與超聲波引起的空穴現(xiàn)象有關(guān)非機(jī)械法：1.酶法融胞.化學(xué)法：a.酸堿調(diào)節(jié)溶液pH值b.有機(jī)溶劑常用甲苯c.表面活性劑是兩性化合物.物理法：a.滲透壓沖擊法b.凍融法c.干燥法.其他方法：a.多種破碎方法相結(jié)合第五章b.第五章b.與下游過(guò)程相結(jié)合c.與上游過(guò)程相結(jié)合離心分離可分為：1.離線沉降.離心過(guò)濾.離心分離+超離心離心分離因數(shù)Fr：粒子在離心機(jī)中產(chǎn)生的離心加速度與自有下降的加速度之比離心設(shè)備的放大：1.等價(jià)時(shí)間Gt法.煙子法超離心技術(shù)分類：1.制備性超離心：粒子差速離心、一般密度梯度離心法、等密度離心法.分析性超離心：相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定、大分子純度估計(jì)、檢測(cè)大分子中構(gòu)的變化.超離心設(shè)備：分析用超離心機(jī)、制備用超離心機(jī)第八章膜分離分類：1.以靜壓力差為推動(dòng)力的膜分離過(guò)程：微濾、超濾、納濾、反滲透.以蒸汽分壓為推動(dòng)力的膜分離過(guò)程：膜蒸餾、滲透蒸發(fā).以濃度差為推動(dòng)力的膜分離過(guò)程：滲析.以電位差為推動(dòng)力的膜分離過(guò)程：電滲析膜的類型：1.有、無(wú)孔膜.膜對(duì)稱性（各向同性膜、不對(duì)稱膜、各向異性膜）.膜的孔道特性.膜材料水通量：膜對(duì)純水的通過(guò)量，是用在壓力為0.1MPa,溫度為20℃的條件下，透過(guò)一定量純水所需的時(shí)間來(lái)測(cè)定。截留分子質(zhì)量MWCO:相當(dāng)于一定截留率（90%/95%）的相對(duì)分子質(zhì)量。膜組件：平板式、管式、螺旋卷式、中空纖維式濃差極化：在超濾過(guò)程中，由于水透過(guò)膜，因而在膜表面的溶質(zhì)濃度增高，形成梯度，在濃差梯度作用下，溶質(zhì)與水以相反方向擴(kuò)散，在達(dá)平衡狀態(tài)時(shí)，膜表面形成一溶質(zhì)濃度分布邊界層，對(duì)水的透過(guò)起阻礙作用。膜的污染：1.膜的劣化：化學(xué)性劣化、物理性劣化、生物性劣化.水生物污垢：吸著層、堵塞.預(yù)防和控制膜污染：①預(yù)處理法②開發(fā)新型抗污染的膜③加大供給液的流速4.污染膜的清潔：化學(xué)洗滌、物理洗滌中空纖維膜組件的工作模式：超濾、再循環(huán)、逆洗超-微濾膜組件的工作模式：濃縮、透析、純化超-微濾系統(tǒng)的工廠布置：開路式操作、間歇式操作、進(jìn)料和排放式操作、多次再循環(huán)操作第七章納米過(guò)濾：介于反滲透和超濾之間，能截留有機(jī)小分子而使大部分無(wú)機(jī)鹽通過(guò)，操作壓力低納米過(guò)濾膜的截留相對(duì)分子質(zhì)量一般小于1000，大于300按納濾膜的荷電情況可分為荷負(fù)電膜、荷正電膜、雙極膜第八章膜親和過(guò)濾法包括：親和膜分離技術(shù)、親和-錯(cuò)流膜過(guò)濾配基及其選擇：通用性配基、特異性配基、間隔臂及其配基親和載體有兩個(gè)特性，擁有其一即可，或能溶于水溶液，或易于懸浮在水溶液親和載體的內(nèi)核：水溶性大分子量聚合物、非水溶性的粒子第九章滲透蒸發(fā)：通過(guò)滲透蒸發(fā)膜，在膜兩側(cè)組分的蒸汽分壓差作用下，使液體混合物部分蒸發(fā)，從而達(dá)到分離目的的一種膜分離法滲透蒸發(fā)膜的分類：1.根據(jù)膜材料的化學(xué)性質(zhì)和組成分類：親水膜、親油膜2.根據(jù)結(jié)構(gòu)不同分類：復(fù)合膜、離子交換膜膜材料的選擇：溶解度參數(shù)法蒸汽滲透：當(dāng)進(jìn)料是某種混合蒸氣，進(jìn)行滲透蒸發(fā)時(shí)即為蒸氣滲透第十章萃取溶劑的選擇：1.利用溶解度參數(shù)理論指導(dǎo)溶劑選擇2.根據(jù)"相似物容易溶解在相似物中”的規(guī)律選擇乳化：一種液體以細(xì)小液滴的形式分散在另一不相溶的液體中乳狀液可分為：水包油、油包水乳狀液的消除：過(guò)濾、離心分離、化學(xué)法、物理法、頂轉(zhuǎn)法萃取操作：混合一分離一溶劑回收萃取因子：萃取平衡后，溶質(zhì)在萃取相與萃余相中質(zhì)量的比值多級(jí)逆流萃?。喝舾奢腿〖?jí)，料液與溶劑分別從兩端加入，萃取相與萃余相逆流流動(dòng)，操作系連續(xù)進(jìn)行微分萃?。寒?dāng)輕相和重相連續(xù)不斷地逆流通過(guò)萃取器時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生微分萃取，在兩相的接觸中，溶質(zhì)從一相轉(zhuǎn)移至另一相中，但一般不可能達(dá)到平衡萃取段：從含溶質(zhì)的重溶劑中優(yōu)先萃取或分離第一種溶質(zhì)洗滌段：從不含溶質(zhì)的重溶劑則洗滌除去萃取物中不希望有的第二章溶質(zhì)第十一章反膠束：表面活化劑分散于連續(xù)有機(jī)相中，一種自發(fā)形成的納米尺度的聚集體形成條件：表面活化劑、臨界膠束濃度特性：極性頭向內(nèi)，活性尾向外臨界膠束濃度：膠束形成時(shí)所需表面活化劑的最低濃度反膠束中水分為結(jié)合水、自由水反膠束萃取體系：?jiǎn)我环茨z束體系、混合反膠束體系、親和反膠束體系蛋白質(zhì)增溶于反膠束溶液的方法：注入法、液-固萃取法、液-液萃取法影響反膠束萃取蛋白質(zhì)的因素：水相pH值、離子強(qiáng)度對(duì)萃取率的影響、表面活性劑類型的影響、表面活性劑濃度的影響、離子種類對(duì)萃取的影響、反萃取及蛋白質(zhì)的變性濁點(diǎn)萃?。阂员砻婊钚詣┠z束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ)，通過(guò)改變實(shí)驗(yàn)條件而弓I起相分離，從而將水溶性物質(zhì)與親油性物質(zhì)分離濁點(diǎn)現(xiàn)象：在一定溫度范圍內(nèi)，表面活性劑易溶于水成為澄清溶液，而當(dāng)溫度升高或降低一定程度時(shí)，溶解度反而減小，會(huì)在水溶液中出現(xiàn)混濁、析出、分層現(xiàn)象第十二章聚合物不相溶性：由于不同類型分子間的斥力大于同它們的親水性有關(guān)的相互吸引力，因此聚合物發(fā)生分離，形成兩個(gè)不同的相雙水相系統(tǒng)：1.聚合物/聚合物/水系統(tǒng)2.聚合物/低分子量成分/水系統(tǒng)第十三章利用超臨界流體，即溫度和壓力略超過(guò)或靠近臨界溫度和臨界壓力、介于氣體和液體之間的流體，作為萃取劑，從固體或液體中萃取出某種高沸點(diǎn)或熱敏性成分，以達(dá)到分離、純化目的液體在臨界區(qū)附近，壓力和溫度的微小變化，會(huì)引起流體的密度大幅度地變化，而非揮發(fā)性溶質(zhì)在超臨界流體中的溶解度大致上和流體的密度成正比。超臨界流體萃取正是利用了這個(gè)特性，形成了新的分離工藝。超臨界流體性質(zhì)：1.溶解度.傳遞性質(zhì).選擇性4選定.夾帶劑的使用提高選擇性原則：1.操作溫度應(yīng)和超臨界流體的臨界溫度相接近.超臨界流體的化學(xué)性質(zhì)應(yīng)和待分離溶質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)相接近作為萃取劑的臨界流體應(yīng)具：1.化學(xué)穩(wěn)定性.溫度不可太高或太低.溫度應(yīng)低于被萃取溶質(zhì)的分解溫度或變質(zhì)溫度.臨界壓力不可太高.選擇性要好.溶解度要高.要易獲取，價(jià)格便宜CO2是天然產(chǎn)物和生物活性物質(zhì)提取和精制的理想和最常用溶劑夾帶劑：在純流體中加入少量與被萃取物親和力強(qiáng)的組分，以提高其對(duì)被萃取組分的選擇性和溶解度，添加的這類物質(zhì)稱為夾帶劑SC-CO2萃取工藝流程：等溫變壓工藝、等壓變溫工藝、恒溫恒壓工藝第十四章液膜由膜溶劑、表面活性劑、流體載體組成液膜分離技術(shù)按其構(gòu)型和操作方式不同分為，乳狀液膜、支撐液膜無(wú)流動(dòng)載體液膜分離機(jī)理：選擇性滲透、化學(xué)反應(yīng)、萃取、吸附有流動(dòng)載體液膜分離機(jī)理：主要決定于載體的性質(zhì)，有離子型、非離子型，其滲透機(jī)理分為逆向遷移、同向遷移流動(dòng)載體應(yīng)具條件：溶解性、配位性、載體應(yīng)不與膜相表面活性劑反應(yīng)液膜分離操作過(guò)程：制備液膜一液膜萃取一澄清分離一破乳影響液膜分離效果因素：液膜體系組成、液膜分離工藝條件液膜分離過(guò)程的關(guān)鍵：1.液膜溶脹：外水相透過(guò)膜進(jìn)入液體內(nèi)相，從而使液膜體系增大2.液膜的破損：攪拌速度影響，接觸時(shí)間影響，料液濃度、酸度影響，乳水比影響，膜內(nèi)比影響，操作溫度影響乳水比：液膜乳化體積和料液體積之比膜內(nèi)比：膜相體積和內(nèi)相體積之比也I\-Tr第十八章蛋白質(zhì)表面大部分親水，其內(nèi)部大部分疏水表面分為荷電區(qū)、親水區(qū)、疏水區(qū)小分子蛋白質(zhì)比起在化學(xué)上類似的大分子蛋白質(zhì)更易溶劑蛋白質(zhì)沉淀加入沉淀劑不同：加入中性鹽鹽析、將pH值調(diào)節(jié)至等電點(diǎn)、加入可溶性有機(jī)溶劑、加入非離子型親水性聚合物、加入聚電解質(zhì)絮凝、加入多價(jià)金屬離子蛋白質(zhì)沉淀法：1.中性鹽鹽析法：①Ks分級(jí)鹽析法：在一定pH值及溫度下，改變鹽的濃度，達(dá)到沉淀目的②汾級(jí)鹽析法：在一定離子強(qiáng)度下，改變?nèi)芤簆H值及溫度，達(dá)到沉淀目的.等電點(diǎn)沉淀法：基于不同蛋白質(zhì)離子具不同等電點(diǎn)這一特性，用依次改變?nèi)芤簆H值的辦法，將雜蛋白沉淀除去，獲目標(biāo)產(chǎn)物.有機(jī)溶劑沉淀法（乙醇是工業(yè)最常用的）：破壞蛋白質(zhì)的某些鍵和氫鍵，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某種程度的變化，致使一些原來(lái)包在內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露在表面，并與有機(jī)溶劑的疏水基團(tuán)結(jié)合形成疏水層，從而使蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變形超過(guò)一定程度時(shí)，便會(huì)導(dǎo)致完全變形.非離子型聚合物沉淀法.聚電解質(zhì)沉淀法.金屬離子沉淀法親和沉淀：將生物親和作用和沉淀分離技術(shù)結(jié)合起來(lái)的一種蛋白質(zhì)純化方法，其實(shí)質(zhì)是配基-產(chǎn)品復(fù)合物的沉淀，即利用蛋白質(zhì)與特定生物或合成的分子間高度專一的相互作用而設(shè)計(jì)出的一種特殊選擇性分離技術(shù)，其沉淀原理不是依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異，而是依據(jù)吸附有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小，親和過(guò)程提高了一個(gè)從復(fù)雜混合物中分離提取單一產(chǎn)品的方法第十七章吸附類型：物理吸附、化學(xué)吸附、交換吸附穿透：操作開始時(shí)，大部分溶質(zhì)被吸附，故流出液中溶質(zhì)的濃度較低，隨吸附過(guò)程繼續(xù)，流出液中溶質(zhì)的濃度逐漸升高，開始較慢，后來(lái)加速，在某一時(shí)刻濃度突然急劇增大膨脹床吸附步驟：床層的穩(wěn)定膨脹和介質(zhì)的平衡一進(jìn)料吸附一洗滌一洗脫一再生、清洗離子交換劑類型：含合成樹脂骨架的多孔彈性顆粒、多糖類骨架的粒子交換樹脂（強(qiáng)離子交換材料）（弱離子交換材料）離子交換劑預(yù)處理：1.用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿液洗滌.按在離子交換操作時(shí)對(duì)pH的要求.在實(shí)驗(yàn)初始階段，用水或稀鹽液洗滌離子交換劑的選擇性：1.離子交換劑及其上面的離子的強(qiáng)弱和展開劑中離子的強(qiáng)弱.離子交換劑對(duì)各反離子的親核性.離子濃度其他吸附；1.疏水作用吸附：利用溶質(zhì)和吸附劑表面間弱的疏水性相互作用而被吸附的過(guò)程.鹽析吸附：由疏水吸附和鹽析沉淀組合而成，將硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)懸浮液，加到一用硫酸銨預(yù)平衡的吸附柱中，再用遞減的鹽濃度展開，達(dá)分離目的.親和吸附：借助于溶質(zhì)和吸附劑之間特定的生物結(jié)合力實(shí)現(xiàn)的.染料配位吸附：當(dāng)親和吸附中的配基是活性染料時(shí)，由于其中有一些染料能對(duì)蛋白質(zhì)有識(shí)別作用產(chǎn)生專一性，可逆結(jié)合免疫吸附：利用抗原-抗體的親和反應(yīng)進(jìn)行分離純化固定金屬親和吸附：包含了金屬離子經(jīng)螯合被固定在吸附劑基質(zhì)上并與蛋白質(zhì)上氨基酸中電子供體形成金屬配合物羥基磷石灰晶體有兩個(gè)不同的吸附面，即存在兩種不同的吸附點(diǎn)，起陰離子交換劑作用的為C點(diǎn)，帶正電荷；起陽(yáng)離子交換劑作用的為P點(diǎn)，帶負(fù)電荷第十，八章所有層析系統(tǒng)分為：固定組、移動(dòng)組、需離析的樣品色層分離過(guò)程：加試樣T展開T分部收集色譜展開是關(guān)鍵，方法：洗脫分析法、前流分析法、頂替分析法阻滯因素：溶質(zhì)的遷移速率和一個(gè)理想標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的遷移速率之比溶出體積：溶質(zhì)的最大濃度區(qū)從柱中流出時(shí)已流出的流動(dòng)相體積容量因子：衡量色譜柱對(duì)分離組分保留能力的重要參數(shù)，意味著在固定相和移動(dòng)相中溶質(zhì)數(shù)量的比例大小吸附色層分離法利用吸附劑對(duì)組分的吸附能力的差別進(jìn)行分離，用了填充柱的物質(zhì)包括無(wú)機(jī)吸附劑、有機(jī)吸附劑疏水作用色層分離法原理：靠疏水基團(tuán)的疏水力分離生物大分子在的液相色譜法。利用生物大分子如蛋白質(zhì)表面暴露的疏水部位和疏水介質(zhì)上的疏水配基的疏水作用來(lái)表達(dá)分離目的共價(jià)作用色層分離法：利用溶質(zhì)分子與層析劑凝膠間的共價(jià)吸附作用將目標(biāo)產(chǎn)物與其他溶質(zhì)分子分離開聚焦色層分離法原理：利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子等電點(diǎn)的不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)分離純化離子交換色層分離法原理：通過(guò)帶點(diǎn)的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換而達(dá)分離目的凝聚過(guò)濾色層分離法是以多孔性凝膠作為介質(zhì)利用分子篩原理將生物物質(zhì)按其分子大小不同而建立起來(lái)的一種分離純化方法原理：含不同組分的溶液，過(guò)網(wǎng)狀的凝膠粒子，小分子物質(zhì)自由擴(kuò)散于凝膠顆粒隙縫中進(jìn)入凝膠相，大分子被排阻在外，加入洗脫劑后溶液向下推移，重復(fù)上述擴(kuò)散、排阻。最先洗出的洗脫液中含大量大分子，最后出的含大量小分子，分段收集可獲各種相對(duì)分子質(zhì)量大小的區(qū)段凝膠過(guò)濾介質(zhì)：葡萄糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠第十九章Zeta電位是動(dòng)點(diǎn)現(xiàn)象的根本原因。是在靜止流體和流動(dòng)流體間剪切面上的動(dòng)電電位動(dòng)電現(xiàn)象：固-液或液-液界面在外加電場(chǎng)作用下做相對(duì)運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的電場(chǎng)現(xiàn)象質(zhì)點(diǎn)的電泳遷移率，在電位梯度作用下，單位時(shí)間內(nèi)質(zhì)點(diǎn)所移動(dòng)距離影響質(zhì)點(diǎn)電泳遷移率的因素：顆粒性質(zhì)、電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液性質(zhì)（pH值、離子強(qiáng)度、黏度入其他（焦耳效應(yīng)、電滲、吸附、分子篩分離、擴(kuò)散、緩沖液性質(zhì)）電泳類型：自由界面電泳、自由相中的區(qū)帶電泳、不同支持物上的區(qū)帶電泳、有機(jī)溶劑中的凝膠電泳、親和電泳、等速電泳、等電聚焦、免疫電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：以聚丙烯酰胺為支持介質(zhì)的電泳是目前分離生物大分子的最好方法。其分離是以它們的物理差別、分子大小和凈電荷為基礎(chǔ)，即分離除了利用物質(zhì)所帶電位的差別外，還具分子篩的特殊作用，這種性質(zhì)為分開電泳率很相近的大分子提供了簡(jiǎn)單有效的方法。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：加有陰離子去污劑~SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳，用于分離蛋白質(zhì)和測(cè)定他的相對(duì)分子質(zhì)量。原理：SDS以一定比例和蛋白質(zhì)結(jié)合并使它帶大量負(fù)電荷，大大超過(guò)其原來(lái)所帶電荷，從而使各天然蛋白質(zhì)間的電荷差別下降乃消除，同時(shí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變松散，形狀變一致，排除電泳中電荷影響。等電聚焦原理：利用電場(chǎng)和pH梯度的復(fù)合作用來(lái)實(shí)現(xiàn)兩性物質(zhì)分離二維電泳最高分辨率，第一維度使用等點(diǎn)聚焦，第二維度使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳免疫電泳：將瓊脂電泳與瓊脂擴(kuò)散結(jié)合起來(lái)的一種免疫化學(xué)技術(shù)，使具有相同電泳遷移率的物質(zhì)通過(guò)抗原與同源抗體間的特異沉淀反應(yīng)來(lái)檢測(cè)所形成的沉淀數(shù)目，相當(dāng)于不同抗原存在的數(shù)目毛細(xì)管電泳：以內(nèi)徑為20~200師的柔性毛細(xì)管柱作為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，對(duì)各小分子、大分子及細(xì)胞等進(jìn)行高效