劉焰-201212本免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課件

醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)劉焰2012.11

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則二、實(shí)驗(yàn)報(bào)告書寫要求三、自做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：①對(duì)流免疫電泳②巨噬細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)③間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)④ELISA雙抗原夾心法測(cè)HBs-Ab

⑤凋亡細(xì)胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳四、示教實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：①沉淀反應(yīng)（單擴(kuò)、雙擴(kuò)、火箭電泳、免疫電泳等）②淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、E花環(huán)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1、穿好工作服。需要時(shí)嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作。禁止在實(shí)驗(yàn)室吃東西、吸煙。2、認(rèn)真做好各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，各種實(shí)驗(yàn)物品按指定地點(diǎn)存放，使用后的吸管、滴管及玻片等放指定地方。3、實(shí)驗(yàn)中發(fā)生意外事故時(shí)，應(yīng)立即報(bào)告及時(shí)處理，切勿隱瞞或自作主張，不按規(guī)定處理。4、愛護(hù)室內(nèi)儀器設(shè)備，按使用規(guī)則操作，不得隨意撥動(dòng)電器開關(guān)，顯微鏡用好后要功能部件復(fù)位。實(shí)驗(yàn)室公用物品用完之后按原樣放回，不得擅自借出或帶出到其它實(shí)驗(yàn)室。5、節(jié)約使用實(shí)驗(yàn)材料，如不慎損壞了器材，應(yīng)告知相關(guān)管理人員登記。6、實(shí)驗(yàn)完畢后整理操作區(qū)，關(guān)好水、電、門、窗。需培養(yǎng)的材料要標(biāo)記組名，姓名等。

第一次實(shí)驗(yàn)

內(nèi)容：

1、實(shí)驗(yàn)一對(duì)流免疫電泳（自做）2、實(shí)驗(yàn)二巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)（自做）3、單擴(kuò)、雙擴(kuò)、對(duì)流、火箭、免疫電泳（示教）4、凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、免疫細(xì)胞檢測(cè)等（理論）

要求掌握：1、抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)、影響因素2、凝集反應(yīng)、間接凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)概念3、對(duì)流免疫電泳原理、吞噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)原理

第二次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

1、實(shí)驗(yàn)三ELISA雙抗原夾心法測(cè)HBs-Ab

（自做）2、實(shí)驗(yàn)四間接免疫熒光（自做）3、實(shí)驗(yàn)五凋亡細(xì)胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳（自做）

4、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、E花環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（示教）

5、免疫標(biāo)記技術(shù)、免疫細(xì)胞檢測(cè)等（理論）要求掌握：

1、間接免疫熒光原理

2、ELISA（雙抗原夾心法）原理

3、標(biāo)記一種抗抗體可檢測(cè)多種Ag-Ab的原理

4、凋亡細(xì)胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳原理

實(shí)驗(yàn)一對(duì)流免疫電泳[原理]對(duì)流免疫電泳是雙向瓊脂擴(kuò)散與電泳技術(shù)的結(jié)合。Ag或Ab分子在一定的pH溶液中帶有電荷，在電場(chǎng)作用下可發(fā)生定向移動(dòng)。將Ag、Ab分別加在pH為8.6緩沖液瓊脂中電泳，因各種血清蛋白質(zhì)都帶負(fù)電荷，泳向陽極。由于電滲作用，液體則流向陰極，二者方向相反。Ab（多為丙種球蛋白）的等電點(diǎn)較高（pI6~7），故帶負(fù)電荷少，所以電泳力小于電滲力，向陰極移動(dòng)。而Ag的等電點(diǎn)較低（pI4~5），所帶負(fù)電荷多，故其電泳力大于電滲力，向正極移動(dòng)。如Ag、Ab相應(yīng)，相遇，在比例適當(dāng)時(shí)即形成白色沉淀線。由于電場(chǎng)限制了Ag、Ab分子的自由擴(kuò)散，因而提高了試驗(yàn)的敏感性(提高10~20倍),并縮短了反應(yīng)時(shí)間（與雙向瓊脂擴(kuò)散相比）。

電滲負(fù)極

正極

AgAb

電泳力：

正極

正極

電滲力：

負(fù)極

負(fù)極[方法]

1.

制板：取一潔凈載玻片，先用0.4%巴比妥瓊脂鋪底、烘干，放置水平臺(tái)面上。再取4mL隔水煮融的1.3%巴比妥瓊脂，立即澆注在已鋪底的玻片上，制成厚薄均勻的瓊脂板。2.

打孔：待瓊脂凝固后，用打孔器按下圖打孔，孔徑3mm，孔距5mm。

3.加樣：用微量加樣器取Ag（人血清）20μL分別加于陰極側(cè)1、2、3、4孔內(nèi)，陽極側(cè)5、6、7、8各孔均加抗體（抗人血清）。加樣量以孔滿為宜，但不可溢出孔外。

4.電泳：瓊脂板放入電泳槽內(nèi)，瓊脂板兩端用濾紙或紗布與緩沖液相接，Ag端接負(fù)極電源，抗體端接正極電源。按電場(chǎng)強(qiáng)度4~6V/cm電泳50min左右。方法：

實(shí)驗(yàn)二小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測(cè)（體外法）[原理]巨噬細(xì)胞具有吞噬異物的功能，將巨噬細(xì)胞與被吞噬物(雞紅細(xì)胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同溫育，染色，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)吞噬異物的巨噬細(xì)胞的吞噬率，以此判斷巨噬細(xì)胞的吞噬功能，從而評(píng)價(jià)機(jī)體的免疫狀態(tài)。[方法]

(1)小鼠巨噬細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1ml。實(shí)驗(yàn)時(shí)眼球放血、斷椎處死小鼠，新潔爾滅浸泡5分鐘（或酒、灑精消毒皮膚），剪開腹部皮膚，暴露腹膜，用鑷子夾起腹膜剪開一小口(注意避開血管)用生理鹽水(或1640)灌注腹腔，收集腹腔液于試管中(約4ml)，1500r/min，離心10min，去上清，沉積細(xì)胞用生理鹽水(或1640)洗二次（離心轉(zhuǎn)速、時(shí)間同上）。最后沉積細(xì)胞用含10％小牛血清1640（約0.5ml）配成適當(dāng)濃度備用(1-2×106／ml)。（2）白色念珠菌制備

將白色念珠菌接種于沙氏平皿培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時(shí)，收集菌，用適量生理鹽水配成懸液，100℃，煮沸30min滅活，離心去掉上清，再用1％美蘭染色30min，用生理鹽水洗滌二次，用生理鹽水配成1×108／ml菌懸液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）吞噬細(xì)胞與菌混合培養(yǎng)取巨噬細(xì)胞0.5ml加l×l08／ml白色念珠菌懸液0.5ml，置37℃溫育30min。取2滴混合液置玻片上加蓋玻片，在高倍鏡下觀察計(jì)數(shù)，或離心1000r／min,10min，取細(xì)胞沉淀混懸液制成涂片，甲醇固定，姆薩染色、油鏡觀察計(jì)數(shù)。[結(jié)果]高倍鏡下觀察計(jì)算：吞噬率％=(吞噬白色念珠菌的巨噬細(xì)胞數(shù)/100個(gè)巨噬細(xì)胞)×100％吞噬指數(shù)=至少含一個(gè)細(xì)菌的吞噬細(xì)胞百分率×每一個(gè)陽性細(xì)胞內(nèi)吞噬真菌的平均數(shù)[注意事項(xiàng)]

1、菌與細(xì)胞混合后充分混勻非常重要。對(duì)于此實(shí)驗(yàn)，菌與吞噬細(xì)胞之比10：1時(shí)吞噬作用容易觀察和計(jì)數(shù)。但是吞噬效果好，能真正反映實(shí)際情況又可被檢測(cè)的比例為1：1。2、菌和細(xì)胞在搖床中作用的時(shí)間不超過30min，如果在37C條件下作用時(shí)間過長(zhǎng)，被吞噬的菌很快會(huì)被裂解，也就不能計(jì)數(shù)為吞噬了菌的細(xì)胞。3、滴片時(shí)加入的細(xì)胞數(shù)依細(xì)胞的大小而定，如果使用的吞噬細(xì)胞是細(xì)胞系，細(xì)胞體積較大，那么加入的細(xì)胞數(shù)就相應(yīng)的少一點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)三ELISA（雙抗原夾心法）檢測(cè)HBs-Ab免疫標(biāo)記技術(shù)

免疫標(biāo)記技術(shù)是指用酶、熒光素、同位素、化學(xué)發(fā)光物等標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體，而進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。該技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，可進(jìn)行定性、定量，及定位的檢測(cè)。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)

屬于固相免疫檢測(cè)。利用AgAb反應(yīng)具有特異性，Ag或Ab吸附到固相載體（例聚乙烯）表面，以及Ag或Ab與酶連接后，仍保持免疫活性和酶活性，當(dāng)酶遇到相應(yīng)底物時(shí)，可引起底物水解顯色。此法的特異性及靈敏度與熒光及同位素標(biāo)記相似，但其方法較以上兩者簡(jiǎn)便，且不需特殊貴重儀器。常用ELISA檢測(cè)方法有：間接法、抗原競(jìng)爭(zhēng)法、夾心法（雙抗體夾心法、雙抗原夾心法）和其他方法。1、間接法2、抗原竟?fàn)幏?、雙抗原夾心法

實(shí)驗(yàn)三ELISA（雙抗原夾心法）檢測(cè)HBs-Ab[原理]

采用純化HBsAg包被酶標(biāo)板，加入待測(cè)標(biāo)本，同時(shí)加入酶標(biāo)抗原（HBsAg-HRP），當(dāng)標(biāo)本中存在抗HBsAg的抗體HBsAb時(shí)，HBsAb與包被HBsAg結(jié)合并與HBsAg-HRP結(jié)合形成

HBsAg－HBsAb-HBsAg-HRP復(fù)合物，加入TMB底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之則無顯色反應(yīng)。

辣根過氧化物酶（HRP）[材料]1、HBsAg包被酶標(biāo)板2、酶標(biāo)抗原（HBsAg-HRP）3、陽性對(duì)照（HBsAb+）4、陰性對(duì)照（HBsAb-）5、待測(cè)標(biāo)本（血漿）6、洗滌液7、顯色劑A+顯色劑B（TMB底物）8、終止液[結(jié)果]先觀察陽性對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔、空白對(duì)照孔。待測(cè)樣品孔顏色與陽性孔同，則為陽性?；驑悠稯D值/陰性對(duì)照平均OD值≥2.1判斷為陽性，否則為陰性。2wellsforneededdectectionoffirsthumanserum2wellsforneededdectectionofsecondhumanserum2wellsforPositivecontrol2wellsforNegativecontrol1wellforBlankAddonedropStopSolutionintoeachwell思考題為什么標(biāo)記一種二抗能檢測(cè)多對(duì)抗原抗體系統(tǒng)？

免疫熒光技術(shù)

是利用熒光素標(biāo)記的抗體來分析或定位相應(yīng)抗原，以測(cè)定細(xì)胞相應(yīng)抗原的存在。廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)中的一種熒光素是異硫氰酸熒光素（FITC），當(dāng)在熒光顯微鏡下用紫外光照射時(shí)，其發(fā)出可見的黃綠色熒光。另一個(gè)廣泛應(yīng)用的熒光素是藻紅蛋白（PE），其發(fā)紅色熒光。免疫熒光技術(shù)主要包括直接法和間接法。實(shí)驗(yàn)四間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)免疫熒光技術(shù)-直接法免疫熒光技術(shù)-間接法

實(shí)驗(yàn)四間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)[原理]間接免疫熒光法是用熒光素標(biāo)記二抗以檢測(cè)Ag或Ab的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其原理是Ag首先與一抗結(jié)合，然后一抗再與熒光素標(biāo)記的二抗結(jié)合，形成一個(gè)Ag-Ab1-熒光素標(biāo)記Ab2的三分子復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)熒光。[材料]1、抗原：外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）2、一抗：兔抗PBMC血清3、熒光素標(biāo)記二抗：FITC-抗兔單克隆抗體4、其他：載玻片、接種環(huán)、pH7.2PBS、熒光顯微鏡等。[方法]1、制備抗原滴片：將PBMC用1mlPBS稀釋，混勻。用吸管取1滴液體（約10ul）滴加到標(biāo)本片黑色圈圈背面中央（圓圈正面中央已涂防脫片劑）。靜止5-10分鐘，待PBMC干燥。2、加一抗：滴加15uL稀釋好的一抗至抗原片上，37℃濕盒孵育30分鐘。3、洗滌：甩干標(biāo)本片上液體，小心擦去圓圈周圍的殘余液體，于圓圈中央滴加洗脫液1滴，來回震蕩，靜置1分鐘，再甩去液體。重復(fù)上述步驟，洗滌3次。4、加熒光二抗（整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程需關(guān)閉強(qiáng)烈光源，避光?。?/p>

：迅速滴加熒光標(biāo)記二抗15uL，37℃濕盒,孵育30分鐘。5、洗滌：同步驟3，洗滌5次。

。6、鏡檢：用吸水紙印干玻片，熒光顯微鏡觀察。FITC為綠色熒光。

[結(jié)果]

熒光顯微鏡觀察：暗背景中有黃綠色明亮熒光的外周血單個(gè)核細(xì)胞[思考題]為什么用間接免疫熒光技術(shù)可以檢測(cè)人PBMC？[方法]常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞

外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同。紅細(xì)胞和多核細(xì)胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比重為1.075左右。利用比重為1.077左右的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞按密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。

1、無菌采集靜脈血2ml,注入盛有1mlHank’s液（含20u/ml肝素）的試管中，混勻。2、吸取淋巴細(xì)胞分層液3ml加入離心管中，再將稀釋抗凝血液3ml小心沿管壁加至分層液上，應(yīng)注意保持兩者界面清晰。

3、室溫2000r／min離心20min。管內(nèi)可分為四層。4、用毛細(xì)吸管輕輕吸出乳白色的單個(gè)核細(xì)胞，加入另一支已含有2~5mlHank’s液的離心管中，混勻。5、室溫下,1500rpm離心10min。6、棄上清，重復(fù)洗滌一次（即加入2~5mlHank’s液到離心管中，混勻。然后，室溫下，1500rpm離心10min。）7、棄上清，用完全RPMI-16401ml定容，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液至所需濃度：一般每ml血可分離出1~2×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。8、細(xì)胞活力檢查取0.1ml細(xì)胞懸液加1滴2%臺(tái)盼藍(lán)染液，作濕片高倍鏡檢計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞百分率?；罴?xì)胞不著色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。一般活性應(yīng)在95％以上。實(shí)驗(yàn)五細(xì)胞凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳[原理]細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡，是受基因控制的細(xì)胞自主性死亡的過程，是有別于細(xì)胞壞死的一種細(xì)胞死亡方式。凋亡細(xì)胞有其形態(tài)、化學(xué)等特征。其中最重要和最具有特征性的改變是Ca2+/Mg2+依賴性的核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致染色質(zhì)DNA在核小體連接部位斷裂，形成以180~200bp為最小單位的單體或寡聚體片段。檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法有形態(tài)學(xué)方法、DNA瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)、原位末端標(biāo)記等方法。

DNA瓊脂糖凝膠電泳是最早用于研究細(xì)胞凋亡的傳統(tǒng)方法，是檢測(cè)細(xì)胞凋亡過程中DNA降解的敏感、特異、快速的方法。隨著核酸內(nèi)切酶的活化，DNA降解成寡核小體，這些降解片段均為180~200bp或其整倍數(shù)的片段，通過電泳可形成典型的“梯狀帶”，而壞死細(xì)胞或凋亡后期的繼發(fā)性壞死細(xì)胞DNA電泳后則成模糊的“涂片狀”。

本實(shí)驗(yàn)是利用瓊脂糖凝膠電泳分析小鼠胸腺淋巴細(xì)胞DNA在地塞米松誘導(dǎo)下細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。染色質(zhì)的基本單位—核小體核小體(nucleosome)結(jié)構(gòu)

DNA繞在組蛋白八聚體(H2A、H2B、H3、H4各一對(duì))核心外1.8周(146bp)，形成核小體核心顆粒。

兩個(gè)核小體核心顆粒之間有LinkerDNA(0-80bp)

核小體核心顆粒+Linker=核小體(180-200bp)核小體組蛋白DNA凋亡小體(apoptoticbody)

編程性死亡細(xì)胞的核DNA在核小體連接處斷裂成核小體片段，并向核膜下或中央異染色質(zhì)區(qū)聚集形成濃縮的染色質(zhì)塊。隨著染色質(zhì)不斷聚集，核纖層斷裂消失，核膜在核孔處斷裂，形成核碎片。同時(shí)在編程性死亡過程中，由于不斷脫水，細(xì)胞質(zhì)不斷濃縮，細(xì)胞體積減小。調(diào)亡細(xì)胞經(jīng)核碎裂形成的染色質(zhì)塊(核碎片)，然后整個(gè)細(xì)胞通過發(fā)芽(bybudding)、起泡(byzelosls)等方式形成一個(gè)球形的突起，并在其根部絞窄而脫落形成一些大小不等，內(nèi)含胞質(zhì)、細(xì)胞器及核碎片的小體稱為凋亡小體。

[材料]1、昆明小鼠2、RPMI-1640培養(yǎng)基3、小牛血清4、地塞米松5、基因組DNA抽提試劑盒6、10mg/mLRNA酶7、TE緩沖液(pH8.0)8、50×TAE電泳緩沖液9、DNAladder分子量標(biāo)準(zhǔn)品10、6×凝膠加樣緩沖液11、眼科剪、眼科鑷、不銹鋼網(wǎng)、250目尼龍濾布、臺(tái)式高速離心機(jī)、恒溫水浴、瓊脂糖凝膠電泳裝置、紫外透色儀等[方法]一、制備小鼠胸腺細(xì)胞：頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下取胸腺，去除小血管及結(jié)締組織，浸入含5%小牛血清的預(yù)冷RPMI1640，先用不銹鋼網(wǎng)研磨，再將研磨好的細(xì)胞懸液用250目尼龍濾布過濾，1000rpm離心4min，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2x106/mL待用。二、地塞米松誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：取上述2x106/mL濃度的胸腺細(xì)胞加入終濃度為1x10－5M的地塞米松，培養(yǎng)5h即為凋亡陽性細(xì)胞，對(duì)照組不加地塞米松。三、小鼠胸腺細(xì)胞DNA快速提取1.裂解細(xì)胞階段（使用到的試劑：裂解液=L液、RNaseA/蛋白酶K液=A液）：將誘導(dǎo)后或未誘導(dǎo)的細(xì)胞移入EP管（1.5ml）中，12000轉(zhuǎn)/分離心10s后，徹底棄上清，離心管中加入100μlL液和20μlA液，充分混勻，置于55℃溫浴20分鐘，其間來回顛倒離心管3-5次。

2.結(jié)合DNA階段(使用到的試劑:結(jié)合緩沖液=B液、3MNaAC)加入10μl3MNaAC(pH4.8)，隨后加入1250μlB液，充分振蕩混合均勻（重要?。?，12000rpm離心3分鐘。將上清分2次加入到離心吸附管（注：離心吸附管上層容積為700ul左右，故eppendorf管中結(jié)合緩沖液需分2次加入到離心吸附管中）。靜置1分鐘，12000rpm離心30秒鐘，倒掉收集管中廢液。第二次同上，靜置1分鐘，離心30秒。

3.漂洗階段（使用試劑：600ul漂洗緩沖液×2=W液）倒掉收集管中的廢液，再加入600ulW液，12000rpm離心30秒。重復(fù)上述步驟，再次加入600ulW液，12000rpm離心30秒。倒掉廢液，不加任何液體，再次12000rpm離心30秒（此步必須！）。

4.洗脫收獲（使用試劑：50μl洗脫緩沖液=T液）小心取出離心吸附柱（不可沾上T液，因其中含有乙醇，會(huì)使提取DNA變性），將其套入一個(gè)干凈的1.5mleppendorf管中，沿吸附柱的正中間小心加入50μlT液，盡量保證洗脫緩沖液在吸附材料上。靜置1分鐘后，于12000rpm離心1分鐘。取出Eppendorf管，其中便是收集到的基因組DNA。5.電泳觀察：（1）1％瓊脂糖凝膠的制備稱取1g瓊脂糖粉溶于100ml1×TAE緩沖液中，隔水煮沸溶解(或微波爐中溶解),并加入DNA染料（比如：SYBRGreen染料0.01%）。取一定量上述1％瓊脂糖制成凝膠板備用。（2）吸取10uL/20uLDNA與2uL/4uL上樣緩沖液混勻,加到1％瓊脂糖凝膠的樣本孔中，室溫，恒流75mA電泳1小時(shí)。（3）電泳結(jié)束后，從電泳槽中取出瓊脂糖凝膠，在紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。續(xù)三、小鼠胸腺細(xì)胞DNA快速提取【結(jié)果】

加地塞米松培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞DNA電泳后呈典型的“階梯狀”條帶，與標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA參照物比較，為多倍的180~200bpDNA片斷。未加地塞米松培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞，DNA無類似改變。細(xì)胞壞死對(duì)照的DNA電泳呈現(xiàn)彌漫的片狀圖譜。地塞米松誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡1：DNAmarker;2-3：細(xì)胞壞死對(duì)照4-6：細(xì)胞凋亡；7：正常細(xì)胞對(duì)照1234567思考題為什么小鼠胸腺細(xì)胞用地塞米松誘導(dǎo)后易產(chǎn)生梯狀DNA條帶？免疫學(xué)檢測(cè)抗原抗體檢測(cè)（血清學(xué)反應(yīng)）

細(xì)胞免疫檢測(cè)

補(bǔ)充材料抗原抗體的檢測(cè)方法凝集反應(yīng)（直接凝集、間接凝集）沉淀反應(yīng)（單向免疫擴(kuò)散、雙向免疫擴(kuò)散、對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、免疫電泳、免疫比濁）補(bǔ)體參與反應(yīng)標(biāo)記技術(shù)（免疫熒光法、酶免疫測(cè)定、放射免疫測(cè)定、化學(xué)發(fā)光免疫法、免疫印跡法、免疫PCR）

1.特異性：抗原-抗體的結(jié)合是特異性結(jié)合2.可逆性：抗原抗體結(jié)合是分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合3.階段性：抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段特異性結(jié)合階段可見的反應(yīng)階段比例性：抗原和抗體結(jié)合是否呈現(xiàn)可見的反應(yīng)現(xiàn)象與兩者的分子比例密切相關(guān)抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)抗原抗體比例對(duì)反應(yīng)現(xiàn)象的影響抗原-抗體反應(yīng)受多種因素影響1.電解質(zhì)：抗原-抗體反應(yīng)通常應(yīng)用0.85%的氯化鈉作為稀釋液，以供給適應(yīng)濃度的電解質(zhì)。2.溫度：一般常使用反應(yīng)在37度水浴或孵育箱中進(jìn)行。3.酸堿度：抗原-抗體反應(yīng)適應(yīng)的酸堿度

為PH6~8。（一）凝集反應(yīng)

1、直接凝集①玻片凝集：定性實(shí)驗(yàn)，已知Ab測(cè)Ag？

用于細(xì)菌和血型鑒定玻片凝集反應(yīng)是在玻片上將Ab直接與顆粒性Ag物質(zhì)（如細(xì)菌、紅細(xì)胞等）混合，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下，如兩者對(duì)應(yīng)便發(fā)生特異性結(jié)合而形成肉眼可見的凝集物，即為陽性；如兩者不對(duì)應(yīng)便無凝集物出現(xiàn)，即為陰性。

②試管凝集試驗(yàn)：半定量實(shí)驗(yàn)，已知Ag定量測(cè)Ab？。

用已知的定量的顆粒性Ag懸液直接與系列稀釋的待檢血清（Ab？）在試管內(nèi)混合，經(jīng)一定時(shí)間后，觀察各管有無凝集，并根據(jù)凝集程度定量測(cè)定血清中的Ab水平及其效價(jià)。

試管凝集試驗(yàn)管號(hào)1234567鹽水(mL)0.50.50.50.50.50.50.5

血清(mL)0.50.50.50.50.50.5棄0

抗原(mL)0.50.50.50.50.50.50.5終體積(mL)1.01.01.01.01.01.01.0

稀釋度1：201：401：801：1601：3201：640鹽水對(duì)照

結(jié)果++++++++++++--

效價(jià)——

能與定量Ag產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象（++）的血清最高稀釋倍數(shù)。

2、間接凝集

將可溶性Ag（或Ab）包被在惰性顆粒載體（紅細(xì)胞、乳膠顆粒等）表面，再與相應(yīng)Ab（或Ag）反應(yīng)，出現(xiàn)可見凝集物的現(xiàn)象。

（免疫微球）（二）沉淀反應(yīng)定義：可溶性Ag（如血清蛋白、細(xì)胞裂解液或組織液等）與相應(yīng)Ab特異性結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)可見沉淀物的現(xiàn)象。

方法：

1、環(huán)狀沉淀

2、

絮狀沉淀

3、

免疫比濁4、

瓊脂凝膠擴(kuò)散：①單向免疫擴(kuò)散②雙向免疫擴(kuò)散③對(duì)流免疫電泳④火箭電泳⑤免疫電泳①單向免疫擴(kuò)散[原理]將某種特異性Ab混合于瓊脂凝膠中，制成含Ab的瓊脂板，再于瓊脂板上打孔，并將一定量的Ag加入孔中。Ag在孔中向四周作輻射狀擴(kuò)散，如Ag與已知的Ab相對(duì)應(yīng)，在兩者比例適合處出現(xiàn)由免疫復(fù)合物所形成的白色沉淀環(huán)。沉淀環(huán)直徑的大小與Ag的含量成正比。以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)Ag與固定濃度的Ab抗體反應(yīng)后測(cè)得沉淀環(huán)的直徑作為橫坐標(biāo)，以Ag濃度為縱坐標(biāo)可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)樣本沉淀環(huán)的大小，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可推算其含量。主要用于定量測(cè)定抗原或IgG、IgM、IgA方法：抗原濃度mg/ml）②雙向免疫擴(kuò)散[原理]將可溶性Ag和Ab分別加到瓊脂板上相應(yīng)的小孔中，使兩者各自向四周擴(kuò)散，若Ag與Ab相對(duì)應(yīng)，兩者相遇即發(fā)生特異性結(jié)合，并在比例適合處形成白色沉淀線。每一對(duì)應(yīng)Ag和Ab可出現(xiàn)一條沉淀線，根據(jù)沉淀線的有無、位置、形狀以及對(duì)比關(guān)系，可分析Ag或Ab成分。③對(duì)流免疫電泳[原理]對(duì)流免疫電泳是雙向瓊脂擴(kuò)散與電泳技術(shù)的結(jié)合。Ag或Ab分子在一定的pH溶液中帶有電荷，在電場(chǎng)作用下可發(fā)生定向移動(dòng)。將Ag、Ab分別加在pH為8.6緩沖液瓊脂中電泳，因各種血清蛋白質(zhì)都帶負(fù)電荷，泳向陽極。由于電滲作用，液體則流向陰極，二者方向相反。Ab（多為丙種球蛋白）的等電點(diǎn)較高（pH6~7），故帶負(fù)電荷少，所以電泳力小于電滲力，向陰極移動(dòng)。而Ag的等電點(diǎn)較低（pH4~5），所帶負(fù)電荷多，故其電泳力大于電滲力，向正極移動(dòng)。如Ag、Ab相應(yīng)，相遇，在比例適當(dāng)時(shí)即形成白色沉淀線。由于電場(chǎng)限制了Ag、Ab分子的自由擴(kuò)散，因而提高了試驗(yàn)的敏感性(提高10~20倍),并縮短了反應(yīng)時(shí)間（與雙向瓊脂擴(kuò)