生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥 1課件

第四章抗體工程制藥第四章抗體工程制藥（1）抗體的產(chǎn)生MMMMDMDGMDA成熟B細(xì)胞祖B細(xì)胞前B細(xì)胞（胞漿出現(xiàn)

IgM重鏈）不成熟B細(xì)胞MatureBcellsImmatureBcellsPre-BcellsPro-BcellsB細(xì)胞的發(fā)育過程第一節(jié)、概述（1）抗體的產(chǎn)生MMMMDMDGMDA成熟B（2）IgG的結(jié)構(gòu)（2）IgG的結(jié)構(gòu)生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件（3）抗原抗體反應(yīng)（3）抗原抗體反應(yīng)生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件以ELISA偵測特定

病原體（4）抗體的應(yīng)用WersternBlot、免疫熒光等檢測

特定抗原2.醫(yī)療以毒素連結(jié)抗體攻擊

病變細(xì)胞3.檢驗(yàn)1.研究以ELISA（4）抗體的應(yīng)用WersternBlot2生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件（5）抗體制藥發(fā)展歷史

1890年發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，建立了血清療法，開抗體制藥之先河(馬血清多克隆抗體）。1937年用電泳法將血清分為白蛋白、甲種、乙種、丙種球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。1975年首次利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出McAb.在臨床上主要用于診斷和治療。1986年第一個(gè)治療用單抗OKT3上市（5）抗體制藥發(fā)展歷史1890年發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，建立了血清McAb在免疫導(dǎo)向療法中存在的問題：A、McAb均是鼠源性抗體，可產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)的半衰期只有5-6h，難以維持有效藥物作用靶組織時(shí)間；B、完整的抗體分子的相對(duì)分子質(zhì)量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。需要解決的問題：A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相對(duì)分子質(zhì)量。McAb在免疫導(dǎo)向療法中存在的問題：A、McAb均是鼠源性解決問題的方法或途徑—基因工程技術(shù)

1984年報(bào)道了人—鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識(shí)別單位等多種類型，基本上消除了抗體的鼠源性（免疫源性），相對(duì)分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1/80-1/3。解決問題的方法或途徑—基因工程技術(shù)

1984年報(bào)道了人—鼠嵌生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件基因工程包括以下內(nèi)容基因克隆技術(shù)將全套抗體Ｈ鏈和Ｌ鏈Ｖ區(qū)基因克隆出來，進(jìn)行原核表達(dá)，篩選特異性的基因噬菌體抗體庫技術(shù)含人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠基因工程包括以下內(nèi)容基因克隆技術(shù)將全套抗體Ｈ鏈和Ｌ鏈Ｖ區(qū)基因治療用抗體發(fā)展的三個(gè)階段單克隆抗體基因工程抗體多克隆抗血清第一代抗體第二代抗體第三代抗體治療用抗體發(fā)展的三個(gè)階段單克隆抗體基因工程抗體多克隆抗血清第整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)

基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術(shù)噬菌體抗體庫技術(shù)

Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)技術(shù)整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技（6）抗體制藥的現(xiàn)狀1986年，美FDA批準(zhǔn)上市了第一個(gè)用于治療移植物抗宿主?。℅VHD）抗體藥物OrthocloneOKT3，翻開了生物醫(yī)藥歷史嶄新的一頁8年后，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第二個(gè)抗體藥物上市。21世紀(jì)后，抗體藥物研發(fā)上市速度加快，目前共有150余個(gè)抗體藥物正在臨床評(píng)估中，其中20多個(gè)已經(jīng)上市，超過500種處于臨床前研究階段。1996年開始進(jìn)入快速發(fā)展的軌道。

2002年治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的完全人源化單抗humira批準(zhǔn)上市，這是抗體藥物發(fā)展具有里程碑意義大事。（6）抗體制藥的現(xiàn)狀1986年，美FDA批準(zhǔn)上市了第一個(gè)用于抗體藥物銷售趨勢圖2009年銷售400億，復(fù)合增長率高達(dá)55%

目前是抗體藥物的黃金期，增長勢頭還在持續(xù),市場遠(yuǎn)未飽和

抗體藥物銷售趨勢圖2009年銷售400億，復(fù)合增長率高達(dá)55至2010年底，全世界共有34個(gè)治療用抗體藥物批準(zhǔn)上市。2004年，約占全球藥物市場份額的2％2006年，單抗藥物的聯(lián)合銷售額為200億美元。2008年，全球單抗藥物市場規(guī)模達(dá)370億美元

2009年，單抗藥物的聯(lián)合銷售額為400億美元。2010年，全球單抗藥物市場規(guī)模達(dá)480億美元

(診斷和研究試劑的單抗藥物100億美元銷售額

)2006-2012年間的年銷售額增長率為14%。而同一時(shí)期，小分子藥物增長率預(yù)計(jì)僅為0.6%。單克隆抗體藥成為增長最快的藥物至2010年底，全世界共有34個(gè)治療用抗體藥物批準(zhǔn)上市。現(xiàn)在有5大單抗藥物占據(jù)了80%的市場份額，1.Remicade(類克,強(qiáng)生公司)2.Avastin安維汀、3.Rituxan美羅華(Roche和Geneteck)

4.Humira(修美樂,雅培公司)5.Herceptin(赫賽汀,

Roche和Geneteck)抗體藥物的價(jià)格昂貴，治療乳腺癌的Herceptin，250mg／支(15000元／支，一個(gè)療程8支)，治療淋巴瘤的Rituxan，400mg／支(21000元／支，一個(gè)療程４支)現(xiàn)在有5大單抗藥物占據(jù)了80%的市場份額，全世界正在研制的生物技術(shù)藥品，25%為各類單克隆抗體。前三大生物治療藥物分別為單克隆抗體、疫苗和腫瘤壞死因子（TNF）抑制劑.

抗體市場快速增長的主要推動(dòng)：一、銷售持續(xù)攀升；二、新品種不斷上市；三、研發(fā)方面的重金投入。大型醫(yī)藥公司還會(huì)通過收購來獲得對(duì)抗體新藥的控制權(quán)。如最近美國強(qiáng)生公司收購了抗體藥物研發(fā)的領(lǐng)頭羊Centocor公司。生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件2016年，美國FDA批準(zhǔn)了22個(gè)新藥，其中抗體藥占七席，31.82%比重。美國ElusysTherapeutics公司的抗吸入性炭疽感染的Anthim（Obiltoxaximab）；美國禮來公司的抗中重度銀屑病藥物Taltz（Ixekizumab）；以色列梯瓦公司的血液嗜酸性粒細(xì)胞水平升高重度哮喘成人患者用藥Cinqair（Reslizumab）；瑞士羅氏公司的抗膀胱癌治療藥物Tecentriq（Atezolizumab），瑞士羅氏和Biogen的復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥藥物Zinbryta（Daclizumab）；美國禮來的抗軟組織肉瘤藥物L(fēng)artruvo（Olaratumab）；美國默沙東的降低梭菌毒素B感染風(fēng)險(xiǎn)藥物Zinplava（Bezlotoxumab）。2016年，美國FDA批準(zhǔn)了22個(gè)新藥，其中抗體藥占七席，3生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件（6）抗體制藥－國內(nèi)市場1.利妥昔單抗銷售額領(lǐng)先

TOP5品種依次是利妥昔單抗、曲妥珠單抗、貝伐珠單抗、雷珠單抗和重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白，TOP5品種用藥金額約占據(jù)抗體市場的近四分之三。2.廣州地區(qū)銷量最大

廣州是最大的抗體藥物市場，占有總市場份額的30％，其次是北京和上海。（6）抗體制藥－國內(nèi)市場1.利妥昔單抗銷售額領(lǐng)先

TOP53.羅氏產(chǎn)品占絕對(duì)優(yōu)勢上海羅氏制藥操控著整個(gè)國內(nèi)抗體藥物市場。巴利昔單抗是北京諾華的獨(dú)家產(chǎn)品3.羅氏產(chǎn)品占絕對(duì)優(yōu)勢（6）抗體制藥－國內(nèi)生產(chǎn)研究現(xiàn)狀CFDA到2015年底共批準(zhǔn)了10個(gè)抗體藥物上市，國內(nèi)形成了三個(gè)抗體藥物的中試及產(chǎn)業(yè)化基地。產(chǎn)業(yè)化基地：北京基地（百泰生物藥業(yè)）；上?；兀ㄖ行艊∷帢I(yè)）；中試：第四軍醫(yī)大學(xué)和成都華神集團(tuán)合作形成西安基地。

（6）抗體制藥－國內(nèi)生產(chǎn)研究現(xiàn)狀CFDA到2015年底共批準(zhǔn)泰欣生(尼妥珠單抗,Nimotuzumab，百泰藥業(yè))：重組人源化抗人表皮因子受體(EGFR)單克隆抗體注射液，2008年6月上市，人源化程度95%，是世界上第三個(gè)用于治療實(shí)體瘤的單克隆抗體。目前定價(jià):50mg/10ml（3680元）泰欣生上市不僅代表我國在單抗藥物人源化技術(shù)領(lǐng)域取得了重大突破,更重要的意義在于突破了哺乳動(dòng)物細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)這一生物技術(shù)瓶頸

泰欣生(尼妥珠單抗,Nimotuzumab，百泰藥業(yè))：重組碘［131I］美妥昔單抗注射液（西安基地）［131I］人鼠嵌合型腫瘤細(xì)胞核單抗注射液（上海基地）注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白”（商品名為“益賽普”）（上?；兀┑猓?31I］美妥昔單抗注射液（西安基地）抗體制藥的國內(nèi)狀態(tài)隨著生物單抗專利到期，國內(nèi)已進(jìn)行了仿制生物制品的研究開發(fā)。據(jù)CFDA最新數(shù)據(jù)，國內(nèi)有多家獲得臨床批文。利妥昔單抗2016年已由正大天晴藥業(yè)獲得臨床批文（利妥昔單抗CXSL1500056蘇）華蘭的重組CD20單抗(利妥昔單抗)獲得臨床批文（CXSL1400096豫）曲妥珠單抗2016年國內(nèi)已有兩家企業(yè)獲得臨床批文，分別是正大天晴的注射用曲妥珠CXSL1400013蘇），華蘭的重組抗人表皮生長因子受體2(HER2)單抗(曲妥珠單抗)注射用藥（CXSL1400077豫）。抗體制藥的國內(nèi)狀態(tài)隨著生物單抗專利到期，國內(nèi)已進(jìn)行了仿制生物瓶頸：大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝，而此類工藝屬于歐美嚴(yán)禁出口的技術(shù)，長期以來對(duì)我國實(shí)行封鎖。

成都基地瓶頸：大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝，而此類工藝屬于歐美嚴(yán)禁出口的技（1）概念抗原決定族

（Epitope,Antigenicdeterminant）●一個(gè)抗原分子上可能有數(shù)個(gè)抗原決定基●

每個(gè)抗原決定族至少誘生一種專一性抗體●蛋白質(zhì)性質(zhì)抗原決定基含有六個(gè)以上氨基酸第二節(jié)、單克隆抗體及其制備（1）概念抗原決定族（Epitope,Antigeni多價(jià)抗原單克?。ㄖ旅舻腂細(xì)胞）單克隆抗體多價(jià)抗原單克隆單克隆抗體單克隆抗體

基本原理

細(xì)胞工程抗體----雜交瘤----單克隆抗體單克隆抗體基本原理細(xì)胞工程抗體----雜交（2）多克隆抗體

(Polyclonalantibody)（2－1）概念給動(dòng)物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物,它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的,稱為多克隆抗體.（2）多克隆抗體

(Polyclonalantibody（2－2

）實(shí)驗(yàn)室制備多克隆抗體研究、診斷用所用動(dòng)物：1Balb/c小鼠，6－8周齡；雄性

2大鼠3兔子生后約12周?？乖?純化的抗原（線性抗原或構(gòu)型抗原）

2非純化抗原技術(shù)關(guān)鍵：抗原制備應(yīng)用：免疫學(xué)檢測

（2－2）實(shí)驗(yàn)室制備多克隆抗體所用動(dòng)物：1Balb/c小抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234B細(xì)胞抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234B細(xì)（2－3）制備多克隆抗體藥物－緊急被動(dòng)免疫和及緊急預(yù)防1234馬血清抗原（破傷風(fēng)毒素）破傷風(fēng)抗毒素血清一頭成年馬反復(fù)采血可獲得10000ml以上的抗血清

（2－3）制備多克隆抗體藥物1234馬血清抗原（破傷風(fēng)毒素）類毒素毒素馬血清抗毒素超敏反應(yīng)抗體抗原類毒素毒素馬血清抗毒素超敏反應(yīng)抗體抗原馬血清抗毒素的兩重性：(1)特異性抗體----中和毒素(2)異種抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗馬血清抗體馬血清具有立即提供保護(hù)的優(yōu)勢，但異種gamma-球蛋白只是短期有效，常常導(dǎo)致病理合并癥（血清?。┖瓦^敏反應(yīng)。馬血清抗毒素的兩重性：人源多克隆抗體－血液制品

人的gamma-球蛋白是最理想的(同源性免疫球蛋白)，但具有傳播肝炎和愛滋病的風(fēng)險(xiǎn)。獻(xiàn)血員免疫（白喉毒素、狂犬病疫苗等）少量采血測效價(jià)大量采血制備抗體是人源多克隆抗體－血液制品

人的gamma-球蛋白是最理（3）單克隆抗體

(Monoclonalantibody,McAb)（3－1）概念:通過B細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體.特點(diǎn):單一特異;可重復(fù);大量供應(yīng)不需純抗原;靈敏度高

（3）單克隆抗體

(Monoclonalantibody,骨髓瘤細(xì)胞致敏的B淋巴細(xì)胞雜交瘤骨髓瘤細(xì)胞致敏的B淋巴細(xì)胞雜交瘤HAT:次黃嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)HGPRT：次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶HAT:次黃嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)

(3-2)、抗原與動(dòng)物免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原不需純化;化學(xué)合成或者提純微生物或細(xì)胞可直接作為抗原免疫動(dòng)物：BALB/c小鼠和Lou大鼠Balb/c小鼠，8-12周齡；雄性動(dòng)物與骨髓瘤同品系P183頁佐劑:弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑(3-2)、抗原與動(dòng)物免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原免疫方法：體內(nèi)免疫:免疫原性強(qiáng),抗原量多.皮下注射,腹腔注射免疫體外免疫:不能用體內(nèi)免疫的雜交瘤細(xì)胞株不穩(wěn)定

初步免疫和加強(qiáng)免疫測定抗體效價(jià)處死小鼠,去脾細(xì)胞

免疫方法：生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件基本方法：取適量脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行混合，在PEG作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。其他融合方法:電融合等細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷型）應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交率高。（3－3）免疫及細(xì)胞融合基本方法：取適量脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行混合，在PEG作用下誘飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其他活細(xì)胞則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的細(xì)胞稱飼養(yǎng)細(xì)胞。常用的有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。用于細(xì)胞融和的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備融和率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定等特點(diǎn)飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長漿細(xì)胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體一個(gè)

Bcell只產(chǎn)生一種抗體癌細(xì)胞漿細(xì)胞融合瘤YYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)兩組1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+癌細(xì)胞各抗體分開1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+各抗細(xì)胞融合后存在脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞融合后存在脾細(xì)胞HAT培養(yǎng)液：次黃嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)，氨基蝶呤可阻斷DNA的合成。胸腺嘧啶激酶（TK）、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）。如細(xì)胞含有此兩種酶則可啟動(dòng)補(bǔ)救（應(yīng)急）途徑。次黃嘌呤,胸腺嘧啶在次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶作用下合成DNA的合成，并可克服氨基蝶呤的阻斷．（3－4）篩選及抗體檢測HAT培養(yǎng)液：次黃嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)在HAT培養(yǎng)液中，骨髓瘤細(xì)胞缺乏TK或HGPRT而不能生長，而脾細(xì)胞能生長但不能長期增殖而死亡，只有雜交瘤細(xì)胞具有以上兩種酶故能生長。脾細(xì)胞（HGPRT+,TK+,不能長期生長）骨髓瘤細(xì)胞（HGPRT-,TK-，不能生長）雜交瘤細(xì)胞（HGPRT+,TK+，能夠生長）在HAT培養(yǎng)液中，骨髓瘤細(xì)胞缺乏TK或HGPRT而不能生長，雜交瘤的克隆化指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。作用:分開抗體分泌細(xì)胞和非分泌細(xì)胞及其他抗體分泌細(xì)胞，非分泌細(xì)胞比分泌細(xì)胞生長快，可抑制分泌細(xì)胞的生長。方法：常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。（3－5）雜交瘤的克隆化雜交瘤的克隆化指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。（3－5）雜交瘤的克有限稀釋法：把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。第一次克隆化時(shí)也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入0.5%的瓊脂糖凝膠，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用吸管吸出，移入96孔板培養(yǎng)。有限稀釋法：把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中單抗檢測RIA、ELISA、免疫熒光技術(shù)等雜交瘤細(xì)胞的凍存每次克隆后進(jìn)行凍存常規(guī)凍存法單抗檢測RIA、ELISA、免疫熒光技術(shù)等（3-6）單克隆抗體的鑒定：特異性鑒定；類與亞類的鑒定；類:酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的IgG,IgM中和活性的鑒定；識(shí)別抗原表位的鑒定；親和力的鑒定。效價(jià)鑒定（3-6）單克隆抗體的鑒定：特異性鑒定；雜交瘤細(xì)胞的鑒定—染色體分析正常鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)：40，全部為端著絲粒。小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體：SP2/0細(xì)胞為62-68，NS-1為54-64，大多數(shù)為非整倍性，有中部和亞中部著絲點(diǎn)。雜交瘤細(xì)胞的鑒定—染色體分析正常鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)：40，全雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目：接近兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體。染色體數(shù)目多且較集中的雜交瘤細(xì)胞分泌高效價(jià)的抗體；反之，則反。雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目：接近兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)單克隆抗體的大量生產(chǎn)：體外培養(yǎng)法：無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞：收取腹水或血清。（3－7）單抗大量生產(chǎn)單克隆抗體的大量生產(chǎn)：（3－7）單抗大量生產(chǎn)（1）體外培養(yǎng)法：可獲得10μg/ml的抗體。采用RPMI1640，添加10%-20%牛血清。但由于培養(yǎng)液中含有血清成分，給純化帶來困難。改良的方法有：無血清培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法、微載體懸浮培養(yǎng)法。無血清培養(yǎng)法：利用白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法雖可減少污染，但產(chǎn)量不高。懸浮培養(yǎng)法：連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度可達(dá)2*107/ml,收集的單克隆抗體可達(dá)400μg/ml。如在培養(yǎng)液中加入微載體，細(xì)胞密度可達(dá)108。（1）體外培養(yǎng)法：可獲得10μg/ml的抗體。采用RPMI1（2）動(dòng)物體內(nèi)誘生法：可獲得10mg/ml的抗體?；境绦颍航臃N前1-2周，小鼠腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或用液體石蠟，然后注射1*106雜交瘤細(xì)胞，7-12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，離心去細(xì)胞沉淀，取上清液凍存。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，比較經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體量多且效價(jià)高，還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株。缺點(diǎn)：小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。（2）動(dòng)物體內(nèi)誘生法：可獲得10mg/ml的抗體。

抗體-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體(抗血清)是所有抗體的混和

脾臟產(chǎn)生各種

B細(xì)胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫

抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已建立之小鼠骨髓癌細(xì)胞株由脾臟收集

B細(xì)胞抗原通常有多個(gè)抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次AgX抗體-a-b-c-d-a-b--d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤細(xì)胞（Subcloning）

(確定只有一種細(xì)胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌細(xì)胞Bcell脾細(xì)胞分株培養(yǎng)篩選篩選單抗傳統(tǒng)抗體(抗血清)試驗(yàn)專一性對(duì)抗原的反應(yīng)無法分辨完全不同d舊有抗原d’新的抗原-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgAgELISAHATPEG單克隆抗體用于免疫治療存在的問題？單克隆抗體的特異性由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對(duì)腫瘤有嚴(yán)格特異性的單抗，對(duì)正常組織有交叉反應(yīng)異種抗體反應(yīng)鼠源性單抗用于人體，產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA），導(dǎo)致異源性超敏反應(yīng)

至2003年再?zèng)]有新的鼠源抗體藥物進(jìn)入臨床研究

單克隆抗體用于免疫治療存在的問題？第四章抗體工程制藥第四章抗體工程制藥（1）抗體的產(chǎn)生MMMMDMDGMDA成熟B細(xì)胞祖B細(xì)胞前B細(xì)胞（胞漿出現(xiàn)

IgM重鏈）不成熟B細(xì)胞MatureBcellsImmatureBcellsPre-BcellsPro-BcellsB細(xì)胞的發(fā)育過程第一節(jié)、概述（1）抗體的產(chǎn)生MMMMDMDGMDA成熟B（2）IgG的結(jié)構(gòu)（2）IgG的結(jié)構(gòu)生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件（3）抗原抗體反應(yīng)（3）抗原抗體反應(yīng)生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件以ELISA偵測特定

病原體（4）抗體的應(yīng)用WersternBlot、免疫熒光等檢測

特定抗原2.醫(yī)療以毒素連結(jié)抗體攻擊

病變細(xì)胞3.檢驗(yàn)1.研究以ELISA（4）抗體的應(yīng)用WersternBlot2生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件（5）抗體制藥發(fā)展歷史

1890年發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，建立了血清療法，開抗體制藥之先河(馬血清多克隆抗體）。1937年用電泳法將血清分為白蛋白、甲種、乙種、丙種球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。1975年首次利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出McAb.在臨床上主要用于診斷和治療。1986年第一個(gè)治療用單抗OKT3上市（5）抗體制藥發(fā)展歷史1890年發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，建立了血清McAb在免疫導(dǎo)向療法中存在的問題：A、McAb均是鼠源性抗體，可產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)的半衰期只有5-6h，難以維持有效藥物作用靶組織時(shí)間；B、完整的抗體分子的相對(duì)分子質(zhì)量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。需要解決的問題：A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相對(duì)分子質(zhì)量。McAb在免疫導(dǎo)向療法中存在的問題：A、McAb均是鼠源性解決問題的方法或途徑—基因工程技術(shù)

1984年報(bào)道了人—鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識(shí)別單位等多種類型，基本上消除了抗體的鼠源性（免疫源性），相對(duì)分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1/80-1/3。解決問題的方法或途徑—基因工程技術(shù)

1984年報(bào)道了人—鼠嵌生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件基因工程包括以下內(nèi)容基因克隆技術(shù)將全套抗體Ｈ鏈和Ｌ鏈Ｖ區(qū)基因克隆出來，進(jìn)行原核表達(dá)，篩選特異性的基因噬菌體抗體庫技術(shù)含人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠基因工程包括以下內(nèi)容基因克隆技術(shù)將全套抗體Ｈ鏈和Ｌ鏈Ｖ區(qū)基因治療用抗體發(fā)展的三個(gè)階段單克隆抗體基因工程抗體多克隆抗血清第一代抗體第二代抗體第三代抗體治療用抗體發(fā)展的三個(gè)階段單克隆抗體基因工程抗體多克隆抗血清第整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)

基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術(shù)噬菌體抗體庫技術(shù)

Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)技術(shù)整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技（6）抗體制藥的現(xiàn)狀1986年，美FDA批準(zhǔn)上市了第一個(gè)用于治療移植物抗宿主?。℅VHD）抗體藥物OrthocloneOKT3，翻開了生物醫(yī)藥歷史嶄新的一頁8年后，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第二個(gè)抗體藥物上市。21世紀(jì)后，抗體藥物研發(fā)上市速度加快，目前共有150余個(gè)抗體藥物正在臨床評(píng)估中，其中20多個(gè)已經(jīng)上市，超過500種處于臨床前研究階段。1996年開始進(jìn)入快速發(fā)展的軌道。

2002年治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的完全人源化單抗humira批準(zhǔn)上市，這是抗體藥物發(fā)展具有里程碑意義大事。（6）抗體制藥的現(xiàn)狀1986年，美FDA批準(zhǔn)上市了第一個(gè)用于抗體藥物銷售趨勢圖2009年銷售400億，復(fù)合增長率高達(dá)55%

目前是抗體藥物的黃金期，增長勢頭還在持續(xù),市場遠(yuǎn)未飽和

抗體藥物銷售趨勢圖2009年銷售400億，復(fù)合增長率高達(dá)55至2010年底，全世界共有34個(gè)治療用抗體藥物批準(zhǔn)上市。2004年，約占全球藥物市場份額的2％2006年，單抗藥物的聯(lián)合銷售額為200億美元。2008年，全球單抗藥物市場規(guī)模達(dá)370億美元

2009年，單抗藥物的聯(lián)合銷售額為400億美元。2010年，全球單抗藥物市場規(guī)模達(dá)480億美元

(診斷和研究試劑的單抗藥物100億美元銷售額

)2006-2012年間的年銷售額增長率為14%。而同一時(shí)期，小分子藥物增長率預(yù)計(jì)僅為0.6%。單克隆抗體藥成為增長最快的藥物至2010年底，全世界共有34個(gè)治療用抗體藥物批準(zhǔn)上市?，F(xiàn)在有5大單抗藥物占據(jù)了80%的市場份額，1.Remicade(類克,強(qiáng)生公司)2.Avastin安維汀、3.Rituxan美羅華(Roche和Geneteck)

4.Humira(修美樂,雅培公司)5.Herceptin(赫賽汀,

Roche和Geneteck)抗體藥物的價(jià)格昂貴，治療乳腺癌的Herceptin，250mg／支(15000元／支，一個(gè)療程8支)，治療淋巴瘤的Rituxan，400mg／支(21000元／支，一個(gè)療程４支)現(xiàn)在有5大單抗藥物占據(jù)了80%的市場份額，全世界正在研制的生物技術(shù)藥品，25%為各類單克隆抗體。前三大生物治療藥物分別為單克隆抗體、疫苗和腫瘤壞死因子（TNF）抑制劑.

抗體市場快速增長的主要推動(dòng)：一、銷售持續(xù)攀升；二、新品種不斷上市；三、研發(fā)方面的重金投入。大型醫(yī)藥公司還會(huì)通過收購來獲得對(duì)抗體新藥的控制權(quán)。如最近美國強(qiáng)生公司收購了抗體藥物研發(fā)的領(lǐng)頭羊Centocor公司。生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件2016年，美國FDA批準(zhǔn)了22個(gè)新藥，其中抗體藥占七席，31.82%比重。美國ElusysTherapeutics公司的抗吸入性炭疽感染的Anthim（Obiltoxaximab）；美國禮來公司的抗中重度銀屑病藥物Taltz（Ixekizumab）；以色列梯瓦公司的血液嗜酸性粒細(xì)胞水平升高重度哮喘成人患者用藥Cinqair（Reslizumab）；瑞士羅氏公司的抗膀胱癌治療藥物Tecentriq（Atezolizumab），瑞士羅氏和Biogen的復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥藥物Zinbryta（Daclizumab）；美國禮來的抗軟組織肉瘤藥物L(fēng)artruvo（Olaratumab）；美國默沙東的降低梭菌毒素B感染風(fēng)險(xiǎn)藥物Zinplava（Bezlotoxumab）。2016年，美國FDA批準(zhǔn)了22個(gè)新藥，其中抗體藥占七席，3生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件（6）抗體制藥－國內(nèi)市場1.利妥昔單抗銷售額領(lǐng)先

TOP5品種依次是利妥昔單抗、曲妥珠單抗、貝伐珠單抗、雷珠單抗和重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白，TOP5品種用藥金額約占據(jù)抗體市場的近四分之三。2.廣州地區(qū)銷量最大

廣州是最大的抗體藥物市場，占有總市場份額的30％，其次是北京和上海。（6）抗體制藥－國內(nèi)市場1.利妥昔單抗銷售額領(lǐng)先

TOP53.羅氏產(chǎn)品占絕對(duì)優(yōu)勢上海羅氏制藥操控著整個(gè)國內(nèi)抗體藥物市場。巴利昔單抗是北京諾華的獨(dú)家產(chǎn)品3.羅氏產(chǎn)品占絕對(duì)優(yōu)勢（6）抗體制藥－國內(nèi)生產(chǎn)研究現(xiàn)狀CFDA到2015年底共批準(zhǔn)了10個(gè)抗體藥物上市，國內(nèi)形成了三個(gè)抗體藥物的中試及產(chǎn)業(yè)化基地。產(chǎn)業(yè)化基地：北京基地（百泰生物藥業(yè)）；上海基地（中信國健藥業(yè)）；中試：第四軍醫(yī)大學(xué)和成都華神集團(tuán)合作形成西安基地。

（6）抗體制藥－國內(nèi)生產(chǎn)研究現(xiàn)狀CFDA到2015年底共批準(zhǔn)泰欣生(尼妥珠單抗,Nimotuzumab，百泰藥業(yè))：重組人源化抗人表皮因子受體(EGFR)單克隆抗體注射液，2008年6月上市，人源化程度95%，是世界上第三個(gè)用于治療實(shí)體瘤的單克隆抗體。目前定價(jià):50mg/10ml（3680元）泰欣生上市不僅代表我國在單抗藥物人源化技術(shù)領(lǐng)域取得了重大突破,更重要的意義在于突破了哺乳動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)這一生物技術(shù)瓶頸

泰欣生(尼妥珠單抗,Nimotuzumab，百泰藥業(yè))：重組碘［131I］美妥昔單抗注射液（西安基地）［131I］人鼠嵌合型腫瘤細(xì)胞核單抗注射液（上?；兀┳⑸溆弥亟M人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白”（商品名為“益賽普”）（上海基地）碘［131I］美妥昔單抗注射液（西安基地）抗體制藥的國內(nèi)狀態(tài)隨著生物單抗專利到期，國內(nèi)已進(jìn)行了仿制生物制品的研究開發(fā)。據(jù)CFDA最新數(shù)據(jù)，國內(nèi)有多家獲得臨床批文。利妥昔單抗2016年已由正大天晴藥業(yè)獲得臨床批文（利妥昔單抗CXSL1500056蘇）華蘭的重組CD20單抗(利妥昔單抗)獲得臨床批文（CXSL1400096豫）曲妥珠單抗2016年國內(nèi)已有兩家企業(yè)獲得臨床批文，分別是正大天晴的注射用曲妥珠CXSL1400013蘇），華蘭的重組抗人表皮生長因子受體2(HER2)單抗(曲妥珠單抗)注射用藥（CXSL1400077豫）?？贵w制藥的國內(nèi)狀態(tài)隨著生物單抗專利到期，國內(nèi)已進(jìn)行了仿制生物瓶頸：大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝，而此類工藝屬于歐美嚴(yán)禁出口的技術(shù)，長期以來對(duì)我國實(shí)行封鎖。

成都基地瓶頸：大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝，而此類工藝屬于歐美嚴(yán)禁出口的技（1）概念抗原決定族

（Epitope,Antigenicdeterminant）●一個(gè)抗原分子上可能有數(shù)個(gè)抗原決定基●

每個(gè)抗原決定族至少誘生一種專一性抗體●蛋白質(zhì)性質(zhì)抗原決定基含有六個(gè)以上氨基酸第二節(jié)、單克隆抗體及其制備（1）概念抗原決定族（Epitope,Antigeni多價(jià)抗原單克?。ㄖ旅舻腂細(xì)胞）單克隆抗體多價(jià)抗原單克隆單克隆抗體單克隆抗體

基本原理

細(xì)胞工程抗體----雜交瘤----單克隆抗體單克隆抗體基本原理細(xì)胞工程抗體----雜交（2）多克隆抗體

(Polyclonalantibody)（2－1）概念給動(dòng)物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物,它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的,稱為多克隆抗體.（2）多克隆抗體

(Polyclonalantibody（2－2

）實(shí)驗(yàn)室制備多克隆抗體研究、診斷用所用動(dòng)物：1Balb/c小鼠，6－8周齡；雄性

2大鼠3兔子生后約12周?？乖?純化的抗原（線性抗原或構(gòu)型抗原）

2非純化抗原技術(shù)關(guān)鍵：抗原制備應(yīng)用：免疫學(xué)檢測

（2－2）實(shí)驗(yàn)室制備多克隆抗體所用動(dòng)物：1Balb/c小抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234B細(xì)胞抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234B細(xì)（2－3）制備多克隆抗體藥物－緊急被動(dòng)免疫和及緊急預(yù)防1234馬血清抗原（破傷風(fēng)毒素）破傷風(fēng)抗毒素血清一頭成年馬反復(fù)采血可獲得10000ml以上的抗血清

（2－3）制備多克隆抗體藥物1234馬血清抗原（破傷風(fēng)毒素）類毒素毒素馬血清抗毒素超敏反應(yīng)抗體抗原類毒素毒素馬血清抗毒素超敏反應(yīng)抗體抗原馬血清抗毒素的兩重性：(1)特異性抗體----中和毒素(2)異種抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗馬血清抗體馬血清具有立即提供保護(hù)的優(yōu)勢，但異種gamma-球蛋白只是短期有效，常常導(dǎo)致病理合并癥（血清病）和過敏反應(yīng)。馬血清抗毒素的兩重性：人源多克隆抗體－血液制品

人的gamma-球蛋白是最理想的(同源性免疫球蛋白)，但具有傳播肝炎和愛滋病的風(fēng)險(xiǎn)。獻(xiàn)血員免疫（白喉毒素、狂犬病疫苗等）少量采血測效價(jià)大量采血制備抗體是人源多克隆抗體－血液制品

人的gamma-球蛋白是最理（3）單克隆抗體

(Monoclonalantibody,McAb)（3－1）概念:通過B細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體.特點(diǎn):單一特異;可重復(fù);大量供應(yīng)不需純抗原;靈敏度高

（3）單克隆抗體

(Monoclonalantibody,骨髓瘤細(xì)胞致敏的B淋巴細(xì)胞雜交瘤骨髓瘤細(xì)胞致敏的B淋巴細(xì)胞雜交瘤HAT:次黃嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)HGPRT：次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶HAT:次黃嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)

(3-2)、抗原與動(dòng)物免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原不需純化;化學(xué)合成或者提純微生物或細(xì)胞可直接作為抗原免疫動(dòng)物：BALB/c小鼠和Lou大鼠Balb/c小鼠，8-12周齡；雄性動(dòng)物與骨髓瘤同品系P183頁佐劑:弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑(3-2)、抗原與動(dòng)物免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原免疫方法：體內(nèi)免疫:免疫原性強(qiáng),抗原量多.皮下注射,腹腔注射免疫體外免疫:不能用體內(nèi)免疫的雜交瘤細(xì)胞株不穩(wěn)定

初步免疫和加強(qiáng)免疫測定抗體效價(jià)處死小鼠,去脾細(xì)胞

免疫方法：生物技術(shù)制藥：抗體工程制藥1課件基本方法：取適量脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行混合，在PEG作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。其他融合方法:電融合等細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷型）應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交率高。（3－3）免疫及細(xì)胞融合基本方法：取適量脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行混合，在PEG作用下誘飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其他活細(xì)胞則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的細(xì)胞稱飼養(yǎng)細(xì)胞。常用的有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。用于細(xì)胞融和的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備融和率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定等特點(diǎn)飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長漿細(xì)胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體一個(gè)

Bcell只產(chǎn)生一種抗體癌細(xì)胞漿細(xì)胞融合瘤YYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)兩組1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+癌細(xì)胞各抗體分開1234mmmm12341234單抗細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+各抗細(xì)胞融合后存在脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞融合后存在脾細(xì)胞HAT培養(yǎng)液：次黃嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)，氨基蝶呤可阻斷DNA的合成。胸腺嘧啶激酶（TK）、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）。如細(xì)胞含有此兩種酶則可啟動(dòng)補(bǔ)救（應(yīng)急）途徑。次黃嘌呤,胸腺嘧啶在次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶作用下合成DNA的合成，并可克服氨基蝶呤的阻斷．（3－4）篩選及抗體檢測HAT培養(yǎng)液：次黃嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T)在HAT培養(yǎng)液中，骨髓瘤細(xì)胞缺乏TK或HGPRT而不能生長，而脾細(xì)胞能生長但不能長期增殖而死亡，只有雜交瘤細(xì)胞具有以上兩種酶故能生長。脾細(xì)胞（HGPRT+,TK+,不能長期生長）骨髓瘤細(xì)胞（HGPRT-,TK-，不能生長）雜交瘤細(xì)胞（HGPRT+,TK+，能夠生長）在HAT培養(yǎng)液中，骨髓瘤細(xì)胞缺乏TK或HGPRT而不能生長，雜交瘤的克隆化指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。作用:分開抗體分泌細(xì)胞和非分泌細(xì)胞及其他抗體分泌細(xì)胞，非分泌細(xì)胞比分泌細(xì)胞生長快，可抑制分泌細(xì)胞的生長。方法：常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。（3－5）雜交瘤的克隆化雜交瘤的克隆化指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。（3－5）雜交瘤的克有限稀釋法：把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。第一次克隆化時(shí)也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入0.5%的瓊脂糖凝膠，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)