植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件

第七章

植物原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)7.1原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義及分離技術(shù)—原生質(zhì)體制備7.2原生質(zhì)體的培養(yǎng)與植株再生，原生質(zhì)體的融合及體細(xì)胞雜種的鑒定與篩選第七章植物原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)7.1原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義及植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)概念及研究進(jìn)展原生質(zhì)體融合植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)概念及研究進(jìn)展原生質(zhì)體(protoplast)：

脫去細(xì)胞壁、裸露的細(xì)胞。又稱原生質(zhì)球

原生質(zhì)體是為質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。亞原生質(zhì)體(subprotoplast)在原生質(zhì)體分離過程中，有時(shí)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)含物的減少而形成的一些較小的原生質(zhì)體。它可以具有細(xì)胞核，也可不具有細(xì)胞核。核質(zhì)體(nuclearplast)由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原生質(zhì)體。胞質(zhì)體(cytoplast)不含細(xì)胞核，而僅含有細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。第一節(jié)

原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義及分離技術(shù)原生質(zhì)體(protoplast)：

脫去細(xì)胞壁、裸露的細(xì)胞ProtoplastsystemOrganogenesisRegenerativeabilityOntogenicprocessesCelldifferentiationSomaticgeneticsCellphysiologyCellcloningOrganelle,DNAuptakeCellfusion應(yīng)用ProtoplastsystemOrganogene植物細(xì)胞育種中的核質(zhì)替換細(xì)胞質(zhì)雜種的獲得遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)造新物種細(xì)胞細(xì)胞器的互作研究意義植物細(xì)胞育種中的核質(zhì)替換意義植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)材料預(yù)處理原生質(zhì)體分離的方法原生質(zhì)體純化原生質(zhì)體活力測定影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素原生質(zhì)體培養(yǎng)方法影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素原生質(zhì)體再生過程Flash植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)材料預(yù)處理Flash用于分離原生質(zhì)體的材料材料預(yù)處理用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。

☆龍膽試管苗的葉片用4℃處理較好。

☆甘蔗植株必須先在黑暗下培養(yǎng)12h后分離的原生質(zhì)體才能分裂。

☆馬鈴薯試管苗葉片需在黑暗下處理48h后分離原生質(zhì)體，才能獲得高產(chǎn)量。用于分離原生質(zhì)體的材料材料預(yù)處理用黑暗處理、低溫處理和不同光原生質(zhì)體分離的方法酶解分離法機(jī)械分離法原生質(zhì)體分離的方法酶解分離法機(jī)械分離法機(jī)械分離法：先將細(xì)胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形后，再用機(jī)械法磨碎組織，從傷口處可釋放出完整的原生質(zhì)體。缺點(diǎn)：獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少，能夠用此法產(chǎn)生原生質(zhì)體的植物種類受到限制。優(yōu)點(diǎn)：該方法可避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用。機(jī)械分離法：先將細(xì)胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)酶解分離法：指將材料放入能降解細(xì)胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時(shí)間，在酶液的作用下，細(xì)胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。常用的酶種類：纖維素酶類（纖維素酶、半纖維素酶、崩潰酶[Driselase]）、果膠酶類（果膠酶和離析酶[Macerozyme]）、蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶。酶解分離法：指將材料放入能降解細(xì)胞壁的混合等滲酶液中保溫一酶來源生產(chǎn)廠家纖維素酶類OnozukaR-10綠色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin綠色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan酶來源生產(chǎn)廠家纖維素酶類OnozukaR-10綠色木霉Ya酶來源生產(chǎn)廠家果膠酶類MacerozymeR-10根霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo.PectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纖維素酶RhozymeHP-150黑曲霉RohmandHassCo.,Rhiladelphia,UAS酶來源生產(chǎn)廠家果膠酶類MacerozymeR-10根霉Ya酶解法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：獲得量大，適用廣泛。缺點(diǎn)：商品酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)。 會(huì)影響所獲原生質(zhì)體的活力。酶解法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：獲得量大，適用廣泛。沉降法漂浮法不連續(xù)梯度法原生質(zhì)體純化的方法沉降法漂浮法不連續(xù)梯度法原生質(zhì)體純化的方法飄浮法Protoplast采用比原生質(zhì)體密度大的高滲溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生質(zhì)體漂浮在液體表層的純化方法。優(yōu)點(diǎn)：可以避免分離的原生質(zhì)體因震蕩被組織碎片撞擊而破損。所用藥品簡單，成本低。缺點(diǎn)及補(bǔ)救措施： 對離心力要求比較嚴(yán)格，掌握不好，原生質(zhì)體則不易漂浮?？刹捎貌煌瑵舛群筒煌x心速度分次漂浮的方法。飄浮法Protoplast采用比原生質(zhì)體密度大的高滲溶液（蔗沉降法利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進(jìn)行過濾然后低速離心，使純凈完整的原生質(zhì)體沉積于試管底部。優(yōu)缺點(diǎn)：

純化原生質(zhì)體比較簡單。由于原生質(zhì)體沉積于試管底部，造成相互擠壓，常引起原生質(zhì)體的破碎。沉降法利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進(jìn)行過濾又稱界面法，采用兩種密度不同的溶液形成不連續(xù)梯度，通過離心使原生質(zhì)體與破損細(xì)胞分別處于不同液相中，從而純化原生質(zhì)體的方法。優(yōu)點(diǎn)：可以收集到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時(shí)避免收集過程中原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎。12mL碎片帶含原生質(zhì)體帶0.6mL

0.45M蔗糖0.45M甘露醇不連續(xù)梯度法又稱界面法，采用兩種密度不同的溶液形成不連續(xù)梯度，通過離心使植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件原生質(zhì)體鑒定低滲爆破法熒光增白劑法(calcoflowerwhite0.1%)原生質(zhì)體鑒定低滲爆破法原生質(zhì)體活力測定形態(tài)識別

形態(tài)完整、富含細(xì)胞質(zhì)、顏色新鮮的正常球形，放入低滲溶液中，可正常膨大。原生質(zhì)體活力測定形態(tài)識別原生質(zhì)體活力測定熒光顯微鏡識別(FDA法)FDA(fluoresceindiacetate)

本身不發(fā)熒光也不具有極性，能自由穿過細(xì)胞質(zhì)膜?；罴?xì)胞內(nèi)FDA可以被酯酶裂解，將能發(fā)熒光的極性部分釋放出來。熒光素則不能自由穿越質(zhì)膜，在完整的活細(xì)胞內(nèi)積累。使用濃度：0.01%原生質(zhì)體活力測定熒光顯微鏡識別(FDA法)使用原生質(zhì)體活力測定酚藏花紅染色法（0.1%)酚藏花紅能使無活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原生質(zhì)體不著色。 伊凡藍(lán)(Evan’sblue)染色法(0.025%)有活力但受損傷的細(xì)胞和死細(xì)胞能夠攝取這種染料，活細(xì)胞不攝取。

原生質(zhì)體活力測定酚藏花紅染色法（0.1%)伊凡影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素供試材料及預(yù)處理方法酶解條件：酶質(zhì)量、組合、濃度、pH、光照和溫度滲透壓穩(wěn)定劑質(zhì)膜穩(wěn)定劑分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離純化持續(xù)時(shí)間。分離用具

影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素供試材料及預(yù)處理方法酶的種類、組合、濃度材料纖維素酶半纖維素酶崩潰酶果膠酶離析酶蝸牛酶研究者煙草葉片禾谷類葉片油菜花粉馬鈴薯子葉馬鈴薯花粉1.02.01.01.01.00.51.00.1~0.20.50.51.0UchimiyaScott李仕瓊戴朝曦王蒂幾種草本植物原生質(zhì)體分離使用的酶種類及濃度(%)酶的種類、組合、濃度材料纖維素酶半纖維素酶崩潰酶果膠酶離析酶材料纖維素酶半纖維素酶崩潰酶果膠酶離析酶研究者枸杞愈傷組織檀香幼葉檀香愈傷組織榆幼葉山毛櫸幼葉胡楊懸浮細(xì)胞0.52.01.00.1~0.21.00.50.50.50.20.50.050.50.50.01~0.030.11.00.20.50.5孫勇如等LakshmiLakshmiDorinAhuja諸葛強(qiáng)幾種木本植物原生質(zhì)體分離使用的酶種類及濃度(%)材料纖維素酶半纖維素酶崩潰酶果膠酶離析酶研究者枸杞愈傷組織0pH分離原生質(zhì)體時(shí)，酶液的pH值是值得注意的問題。因?yàn)榻到饷傅幕盍图?xì)胞活力最適pH值是不一致的。如制備菜豆葉片原生質(zhì)體時(shí)：低pH（<4.5），酶的活力強(qiáng)，原生質(zhì)體分離速度快，但細(xì)胞活力差，被破壞的細(xì)胞較多;pH值偏高（7.0），酶活力差，原生質(zhì)體分離速度慢，完整的原生質(zhì)體數(shù)目較多。pH分離原生質(zhì)體時(shí)，酶液的pH值是值得注意的問題。因?yàn)榻到饷腹庹蘸蜏囟戎苽湓|(zhì)體時(shí)，在細(xì)胞中加入酶液、滲透壓穩(wěn)定劑、質(zhì)膜穩(wěn)定劑后，還需在一定時(shí)間內(nèi)保持一定的溫度，原生質(zhì)體方能釋放。脫壁的原生質(zhì)體對光非常敏感，分離原生質(zhì)體一般是在黑暗條件下進(jìn)行的。在28℃條件下，每分鐘40轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)4h后，葉片組織可完全分離。懸浮細(xì)胞需在25℃～33℃條件下酶解24h。光照和溫度制備原生質(zhì)體時(shí)，在細(xì)胞中加入酶液、滲透壓穩(wěn)定劑、質(zhì)滲透壓穩(wěn)定劑原生質(zhì)體由于細(xì)胞壁的解除和壁壓的消失將引起細(xì)胞破碎。因而在酶液、原生質(zhì)體洗滌液、培養(yǎng)液中必須調(diào)整滲透壓，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，防止細(xì)胞漲破或過分收縮而破壞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。常用的滲透壓穩(wěn)定劑：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，濃度約在0.40M~0.80M。滲透壓穩(wěn)定劑還可促進(jìn)分離的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁并繼續(xù)分裂。滲透壓穩(wěn)定劑原生質(zhì)體由于細(xì)胞壁的解除和壁壓的消失將引起細(xì)胞破質(zhì)膜穩(wěn)定劑目的：增加完整原生質(zhì)體的數(shù)量，防止質(zhì)膜破壞，促進(jìn)原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生和細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)。常用的質(zhì)膜穩(wěn)定劑 葡聚糖硫酸鉀、2-（N-嗎啉）-乙烷磺酸、氯化鈣、磷酸二氫鉀。質(zhì)膜穩(wěn)定劑目的：增加完整原生質(zhì)體的數(shù)量，防止質(zhì)膜破壞，促進(jìn)原原生質(zhì)體培養(yǎng)方法原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：原生質(zhì)體在液體環(huán)境中有較強(qiáng)的吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力。操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。缺點(diǎn)：原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育情況。液體淺層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：雙層培養(yǎng)法——液體-固體雙層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可能吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。缺點(diǎn)：不易觀察細(xì)胞的發(fā)育過程。雙層培養(yǎng)法——液體-固體雙層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：固體薄層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：使原生質(zhì)體處于固定位置，避免了原生質(zhì)體的漂浮游動(dòng)，有利于對單個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞壁再生及細(xì)胞團(tuán)形成的全過程進(jìn)行定點(diǎn)觀察。缺點(diǎn)：培養(yǎng)基溫度對薄層質(zhì)量和原生質(zhì)體分布有一定影響；另外，固體中單細(xì)胞生活能力弱，通氣狀況不良，第一次細(xì)胞分裂時(shí)間會(huì)推遲2d左右。固體薄層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：瓊脂糖珠培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50ml一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，通過調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進(jìn)一步的生長和發(fā)育，這種方法由于改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進(jìn)了原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。瓊脂糖珠培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素原生質(zhì)體的活力原生質(zhì)體的起始密度適宜密度在104~105個(gè)／ml左右。在煙草葉原生質(zhì)體培養(yǎng)中，密度低于103個(gè)／ml時(shí)，細(xì)胞只能分裂一、二次，密度在104個(gè)／ml以上，植板率常顯著提高。滲透壓穩(wěn)定劑培養(yǎng)基營養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)經(jīng)常使用的KM-P培養(yǎng)基就是以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)；N6培養(yǎng)基則以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)改進(jìn)的。影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素原生質(zhì)體的活力影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素培養(yǎng)條件溫度，光照植物材料和基因型柑桔，葡萄，桃供體細(xì)胞的生長同步性影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素培養(yǎng)條件原生質(zhì)體再生過程原生質(zhì)體再生過程是指分離、純化的原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方法和良好的培養(yǎng)條件下，很快恢復(fù)細(xì)胞壁，再生細(xì)胞持續(xù)分裂形成細(xì)胞團(tuán)，最后或通過愈傷組織或通過胚狀體分化出完整植株的過程。細(xì)胞壁再生細(xì)胞分裂和愈傷組織或胚狀體形成植株再生原生質(zhì)體再生過程原生質(zhì)體再生過程是指分離、純化的原生質(zhì)體在適細(xì)胞壁再生是細(xì)胞分裂的先決條件再生所需時(shí)間與植物種類和起源細(xì)胞的分化程度及生理狀態(tài)有關(guān)。再生過程：先是質(zhì)膜合成細(xì)胞壁主要成分微纖維，然后在質(zhì)膜表面進(jìn)行聚合作用，形成多片層的結(jié)構(gòu)，以后在質(zhì)膜和片層結(jié)構(gòu)之間或在膜上產(chǎn)生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團(tuán)，最后形成完整的細(xì)胞壁。檢測新壁合成的方法熒光增白劑法(calcoflowerwhite0.1%)和電鏡技術(shù)細(xì)胞壁再生是細(xì)胞分裂的先決條件再生所需時(shí)間與植物種類和起源細(xì)細(xì)胞分裂植株再生愈傷組織或胚狀體形成細(xì)胞分裂植株再生愈傷組織或胚狀體形成原生質(zhì)體類型第一次分裂時(shí)間%植板率(%)細(xì)胞分裂情況愈傷組織分化速度原生質(zhì)體到再生植株煙草葉片4d

602周—20個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)1m形成芽3m胡蘿卜培養(yǎng)細(xì)胞6d

8~10d形成細(xì)胞團(tuán)，4周后形成胚狀體胚狀體3周后成苗4m矮牽牛愈傷組織4d2周后形成20~25個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)8~10周出芽3m油菜葉片2~3d15d形成細(xì)胞團(tuán)28d愈傷組織10d分化出芽3m馬鈴薯子葉48h9~10d形成16個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)2m馬鈴薯花粉2h15d形成細(xì)胞團(tuán)幾種不同類型的原生質(zhì)體分裂和發(fā)育速度比較6010-205-301046.1原生質(zhì)體類型第一次分裂植板率細(xì)胞分裂情況愈傷組織分化速度原生第二節(jié)原生質(zhì)體融合及培養(yǎng)原生質(zhì)體融合方法原生質(zhì)體融合類型第二節(jié)原生質(zhì)體融合及培養(yǎng)原生質(zhì)體融合方法植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件原生質(zhì)體融合（protoplastfusion)

體細(xì)胞雜種：雜種細(xì)胞可進(jìn)一步發(fā)育成雜種植物體。由融合細(xì)胞培養(yǎng)成的植株稱為體細(xì)胞雜種植株。兩種異源（種、屬間）原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互接觸從而發(fā)生膜融合，胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的過程。原生質(zhì)體融合（protoplastfusion)體細(xì)胞誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法化學(xué)融合(chemicalfusion)定義：利用化學(xué)融合劑，促使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合的方法。主要種類：鹽類融合法（NaNO3融合）高pH-高濃度鈣離子融合法PEG融合法電融合(electrofusion)利用改變電場來誘導(dǎo)原生質(zhì)體彼此連接成串，再施以瞬間強(qiáng)脈沖使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿而使原生質(zhì)體融合的方法。誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法化學(xué)融合(chemicalfusioNaNO3融合法機(jī)理：

NaNO3能誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的原因是鈉離子能中和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷，使凝聚的原生質(zhì)體質(zhì)膜緊密接觸，促進(jìn)細(xì)胞融合原生質(zhì)體表面帶有負(fù)電荷(-10～-30mV)，同性質(zhì)電荷彼此凝聚的原生質(zhì)體質(zhì)膜無法靠近到足以融合的程度。融合率0.1%~4%。例子：Power（1970），玉米與燕麥原生質(zhì)體融合NaNO3融合法機(jī)理：高pH-高濃度鈣離子融合法Keller和Melchers(1972，1974)首先發(fā)現(xiàn)高pH-高濃度鈣離子的誘發(fā)融合效應(yīng)。機(jī)理：鈣離子濃度決定著細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和可塑性，影響原生質(zhì)體膜的結(jié)合；高pH又能改變質(zhì)膜的表面電荷，有利于細(xì)胞融合鈣離子濃度和pH范圍因植物種類不同而異。（例：煙草原生質(zhì)體融合－－pH10.5，0.05mMCaCl2）高pH-高濃度鈣離子融合法Keller和Melchers(1PEG融合法誘導(dǎo)融合的機(jī)理PEG具有分子橋的作用

原生質(zhì)體－水、蛋白質(zhì)和碳水化合物－（氫鍵）PEG（氫鍵）－原生質(zhì)體 打破電荷平衡 再經(jīng)高濃度Ca2＋和高pH溶液處理并用培養(yǎng)液清洗，可能使一種原生質(zhì)體上的帶正電荷的基團(tuán)連到另一種原生質(zhì)體的帶負(fù)電荷的基團(tuán)上，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。PEG融合法誘導(dǎo)融合的機(jī)理PEG融合技術(shù)的要點(diǎn)融合液配置A液：CaCl2 2~8mM KH2PO4 0.5~0.7mM

甘露醇或山梨醇 0.1~0.2mM PEG（分子量6000） 25%~30% pH 5.8 B液：CaCl2 2~8mM KH2PO4 0.5~0.7mM

甘露醇或山梨醇 0.1~0.2mM pH 7.0~10.0 PEG融合技術(shù)的要點(diǎn)融合液配置PEG融合技術(shù)的要點(diǎn)融合原生質(zhì)體的密度和比例密度：1×105個(gè)/毫升比例：1:1融合融合原生質(zhì)體溶液0.1~0.5ml，靜置3～5min融合液A0.1~0.5ml，保持15~20min，25℃融合液B0.1~0.5ml，保持10~20min，25℃培養(yǎng)液洗滌（3～4次），離心（100×g，5min）PEG融合技術(shù)的要點(diǎn)融合原生質(zhì)體的密度和比例植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件電融合基本原理：在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接、融合，形成融合體。電融合基本原理：電融合將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室微電極型平行多電極兩個(gè)電極的端部同時(shí)與兩個(gè)靠近的原生質(zhì)體膜表面接觸，原生質(zhì)體由于脈沖電流間斷刺激，兩層膜間產(chǎn)生小孔，連接成橋，經(jīng)點(diǎn)連接到面連接，最后形成融合體。平行多電極通過1MHz交流電場發(fā)生雙向電脈沖，原生質(zhì)體在電場力作用下，極化產(chǎn)生偶極子，原生質(zhì)體緊密排開成串珠狀。此時(shí)，加入直流電脈沖，質(zhì)膜被擊穿，進(jìn)一步形成融合體電融合將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室微電極型平行植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件電融合與PEG融合比較起來，電融合的優(yōu)點(diǎn)：不存在對細(xì)胞的毒害問題融合效率高融合技術(shù)操作簡便電融合參數(shù)（例：馬鈴薯，融合率>40%）交變電場的振幅頻率 100V/cm交變電場處理時(shí)間 20s直流高頻電壓 1100V/cm脈沖寬度 60us脈沖次數(shù) 1電融合與PEG融合比較起來，電融合的優(yōu)點(diǎn)：融合類型自發(fā)融合誘發(fā)融合對稱融合非對稱融合核失活細(xì)胞質(zhì)失活Flash融合類型自發(fā)融合Flash影響原生質(zhì)體融合的因素原生質(zhì)體質(zhì)量至關(guān)重要，高質(zhì)量的原生質(zhì)體是細(xì)胞融合的首要條件。融合方法融合參數(shù)，包括各種融合液都應(yīng)選擇適當(dāng)。影響原生質(zhì)體融合的因素原生質(zhì)體質(zhì)量至關(guān)重要，高質(zhì)量的原生質(zhì)體融合體類型異核體(heterokaryon)或異核細(xì)胞基因型不同的原生質(zhì)體融合成雜交細(xì)胞同核體(homokaryon)基因型相同的原生質(zhì)體融合成的雜交細(xì)胞非對稱雜種或細(xì)胞質(zhì)雜種融合體類型異核體(heterokaryon)或異核細(xì)(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物體細(xì)胞雜交過程示意圖標(biāo)志去壁(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物體細(xì)胞雜交過程示意圖植物體細(xì)胞的雜交過程植物體細(xì)胞的雜交過程細(xì)胞質(zhì)工程

(cytoplasmicengineering)細(xì)胞質(zhì)工程又稱細(xì)胞拆合工程是通過物理或化學(xué)方法將細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分開，再進(jìn)行不同細(xì)胞間核質(zhì)的重新組合，重建成新細(xì)胞。可用于研究細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的關(guān)系的基礎(chǔ)研究和育種工作。

細(xì)胞質(zhì)工程

(cytoplasmicengineering細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)雜種應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)，使兩種來源不同的核外遺傳物質(zhì)與一個(gè)特定的核基因組結(jié)合在一起細(xì)胞質(zhì)雜種獲得途徑（4條）：一個(gè)正常原生質(zhì)體與一個(gè)去核原生質(zhì)體融合；Lorz等（1981）用密度梯度離心（5％~50%Percoll，20000~40000g，40~90min）獲得高純度的去核原生質(zhì)體。細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)雜種細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)雜種獲得途徑一個(gè)正常原生質(zhì)體和一個(gè)核失活原生質(zhì)體融合使核失活的方法：X射線，碘乙酰胺，羅丹明異核體形成后，兩個(gè)核中有一個(gè)消失；較晚時(shí)期，染色體選擇性消失。細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)雜種獲得途徑體細(xì)胞雜種產(chǎn)生的其它途徑細(xì)胞器移植葉綠體移植葉綠體的來源 葉片－－－機(jī)械法－低速離心 原生質(zhì)體－低滲漲破－低速離心葉綠體的純化

Percoll或蔗糖密度梯度離心葉綠體的轉(zhuǎn)移

夾層離心法和PEG誘導(dǎo)融合應(yīng)用PEG誘導(dǎo)胡蘿卜原生質(zhì)體攝入藻類葉綠體利用葉綠體的轉(zhuǎn)移使低光效作物的原生質(zhì)體通過攝取高光效作物的葉綠體而提高其光合效率。體細(xì)胞雜種產(chǎn)生的其它途徑細(xì)胞器移植細(xì)胞器移植細(xì)胞核移植細(xì)胞核的來源 植物組織－機(jī)械法（加TritonX-100）－過濾離心 原生質(zhì)體－低滲漲破(加TritonX-100)－過濾離心細(xì)胞核的純化

Percoll或蔗糖密度梯度離心細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移

夾層離心法：原生質(zhì)體－核－原生質(zhì)體－核???PEG誘導(dǎo)

電場誘導(dǎo)和微注射體細(xì)胞雜種產(chǎn)生的其它途徑細(xì)胞器移植體細(xì)胞雜種產(chǎn)生的其它途徑體細(xì)胞雜種產(chǎn)生的其它途徑微生物移植內(nèi)吞作用攝入固氮根瘤菌外源染色體和DNA的攝入染色體分離細(xì)胞－同步化處理－原生質(zhì)體－漲破－差速離心（200g,10min；1000g，20min）轉(zhuǎn)移方法PEG誘導(dǎo)，顯微注射農(nóng)桿菌介導(dǎo)，基因搶，電穿孔，超聲波，激光穿孔體細(xì)胞雜種產(chǎn)生的其它途徑微生物移植體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定根據(jù)可見標(biāo)記性狀的機(jī)械選擇法體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定根據(jù)可見標(biāo)記性狀的機(jī)械選擇法體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定。

FITC(異硫氰酸熒光素)在熒光顯徽鏡下呈綠色RITC(異硫氰酸羅丹明)

RITC在熒光顯徽鏡下呈紅色體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定。

FITC(異硫氰酸熒光素體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定根據(jù)其遺傳和生理生化特性的互補(bǔ)選擇法體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定根據(jù)其遺傳和生理生化特性的互補(bǔ)選互補(bǔ)選擇法互補(bǔ)選擇法是指利用兩個(gè)親本具有不同遺傳和生理特性,在特定培養(yǎng)條件下,只有發(fā)生互補(bǔ)作用的雜種細(xì)胞才能生長的選擇方法。抗性互補(bǔ)選擇法營養(yǎng)代謝互補(bǔ)選擇法生長互補(bǔ)選擇法 矮牽牛+爬山虎融合體的選擇互補(bǔ)選擇法互補(bǔ)選擇法是指利用兩個(gè)親本具有不同遺傳和生理特性,原生質(zhì)體矮牽牛爬山虎冠癭混合體融合處理矮牽牛+爬山虎細(xì)胞團(tuán)愈傷組織（異核體）NT培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基(無激素)NT培養(yǎng)基NT培養(yǎng)基細(xì)胞團(tuán)MS培養(yǎng)基(無激素)死亡MS培養(yǎng)基(有激素)愈傷組織原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)MS培養(yǎng)基(無激素)死亡愈傷組織原生質(zhì)體矮牽牛爬山虎冠癭混合體融合處理矮牽牛+爬山虎細(xì)胞團(tuán)愈體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定利用染色體顯帶技術(shù)，以親本染色體為對照，對細(xì)胞雜種的染色體數(shù)目、形態(tài)和帶型進(jìn)行觀察。體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定同功酶鑒定根據(jù)親本和雜種同功酶譜的差異來鑒別雜種。有的呈雙親譜帶的總和、有的出現(xiàn)新譜帶或丟失部分親本譜帶。常用的鑒定酶為：乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶、過氧化物酶、酯酶等。體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定同功酶鑒定體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定DNA分子標(biāo)記鑒定是在DNA水平上對親本和雜種植株遺傳差異進(jìn)行鑒定的一種技術(shù)。依據(jù)DNA的多態(tài)性（polymorphism）RandomAmplifiedPolymorphicDNA體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定DNA分子標(biāo)記鑒定Random體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定體細(xì)胞雜種選擇及雜種植株鑒定主要原因：生物基因的表達(dá)不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控、相互影響的，所以馬鈴薯—番茄雜交植株的細(xì)胞中雖然具備兩個(gè)物種的遺傳物質(zhì)，但這些遺傳物質(zhì)的表達(dá)受到相互干擾，不能再像馬鈴薯或番茄植株中的遺傳物質(zhì)一樣有序表達(dá)，雜交植株不能地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯就是很自然的了。為什么“番茄—馬鈴薯”超級雜種植株沒有如科學(xué)家所想像的那樣，地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯？主要原因：為什么“番茄—馬鈴薯”超級雜種植株沒有如科學(xué)家所想形似白菜味近甘藍(lán)生長期短耐熱性強(qiáng)易于儲(chǔ)存形似白菜味近甘藍(lán)生長期短P38思考與探究2P38思考與探究2小結(jié)原生質(zhì)體是植物除去細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，是進(jìn)行各種細(xì)胞操作的理想系統(tǒng)。原生質(zhì)體的分離和純化是對其操作和培養(yǎng)的前提。分離的原生質(zhì)體活性受供體材料和分離條件的影響。原生質(zhì)體培養(yǎng)是細(xì)胞工程精細(xì)技術(shù)，培養(yǎng)技術(shù)成熟程度直接影響體系的應(yīng)用。小結(jié)原生質(zhì)體是植物除去細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，是進(jìn)行各種細(xì)胞操作的小結(jié)原生質(zhì)體融合是獲得胞質(zhì)雜種的理想途徑。體細(xì)胞雜交在遠(yuǎn)緣育種和新物種、新資源創(chuàng)造中具有深遠(yuǎn)意義。原生質(zhì)體融合技術(shù)主要有PEG融合及電融合提高融合效率和融合細(xì)胞培養(yǎng)重復(fù)性是該技術(shù)研究的重點(diǎn)小結(jié)原生質(zhì)體融合是獲得胞質(zhì)雜種的理想途徑。思考題1．原生質(zhì)體、亞原生質(zhì)體、微小原生質(zhì)體和原生質(zhì)球的概念。2．為什么原生質(zhì)體要培養(yǎng)在等滲培養(yǎng)基中？3．影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素。4．原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法有哪些？各有何優(yōu)缺點(diǎn)5．為什么說原生質(zhì)體培養(yǎng)系統(tǒng)是現(xiàn)代生物技術(shù)的載體？思考題1．原生質(zhì)體、亞原生質(zhì)體、微小原生質(zhì)體和原生質(zhì)球的概念思考題6．植物體細(xì)胞雜交的概念和類型。7.什么是細(xì)胞質(zhì)工程？8．對稱融合和非對稱融合的概念及非對稱融合的作用。9．PEG融合與電融合的原理及影響因素。10．雜種細(xì)胞的獲得和選擇方法。思考題6．植物體細(xì)胞雜交的概念和類型。第七章

植物原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)7.1原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義及分離技術(shù)—原生質(zhì)體制備7.2原生質(zhì)體的培養(yǎng)與植株再生，原生質(zhì)體的融合及體細(xì)胞雜種的鑒定與篩選第七章植物原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)7.1原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義及植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)概念及研究進(jìn)展原生質(zhì)體融合植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)概念及研究進(jìn)展原生質(zhì)體(protoplast)：

脫去細(xì)胞壁、裸露的細(xì)胞。又稱原生質(zhì)球

原生質(zhì)體是為質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。亞原生質(zhì)體(subprotoplast)在原生質(zhì)體分離過程中，有時(shí)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)含物的減少而形成的一些較小的原生質(zhì)體。它可以具有細(xì)胞核，也可不具有細(xì)胞核。核質(zhì)體(nuclearplast)由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原生質(zhì)體。胞質(zhì)體(cytoplast)不含細(xì)胞核，而僅含有細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。第一節(jié)

原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義及分離技術(shù)原生質(zhì)體(protoplast)：

脫去細(xì)胞壁、裸露的細(xì)胞ProtoplastsystemOrganogenesisRegenerativeabilityOntogenicprocessesCelldifferentiationSomaticgeneticsCellphysiologyCellcloningOrganelle,DNAuptakeCellfusion應(yīng)用ProtoplastsystemOrganogene植物細(xì)胞育種中的核質(zhì)替換細(xì)胞質(zhì)雜種的獲得遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)造新物種細(xì)胞細(xì)胞器的互作研究意義植物細(xì)胞育種中的核質(zhì)替換意義植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)材料預(yù)處理原生質(zhì)體分離的方法原生質(zhì)體純化原生質(zhì)體活力測定影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素原生質(zhì)體培養(yǎng)方法影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素原生質(zhì)體再生過程Flash植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)材料預(yù)處理Flash用于分離原生質(zhì)體的材料材料預(yù)處理用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。

☆龍膽試管苗的葉片用4℃處理較好。

☆甘蔗植株必須先在黑暗下培養(yǎng)12h后分離的原生質(zhì)體才能分裂。

☆馬鈴薯試管苗葉片需在黑暗下處理48h后分離原生質(zhì)體，才能獲得高產(chǎn)量。用于分離原生質(zhì)體的材料材料預(yù)處理用黑暗處理、低溫處理和不同光原生質(zhì)體分離的方法酶解分離法機(jī)械分離法原生質(zhì)體分離的方法酶解分離法機(jī)械分離法機(jī)械分離法：先將細(xì)胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形后，再用機(jī)械法磨碎組織，從傷口處可釋放出完整的原生質(zhì)體。缺點(diǎn)：獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少，能夠用此法產(chǎn)生原生質(zhì)體的植物種類受到限制。優(yōu)點(diǎn)：該方法可避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用。機(jī)械分離法：先將細(xì)胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)酶解分離法：指將材料放入能降解細(xì)胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時(shí)間，在酶液的作用下，細(xì)胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。常用的酶種類：纖維素酶類（纖維素酶、半纖維素酶、崩潰酶[Driselase]）、果膠酶類（果膠酶和離析酶[Macerozyme]）、蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶。酶解分離法：指將材料放入能降解細(xì)胞壁的混合等滲酶液中保溫一酶來源生產(chǎn)廠家纖維素酶類OnozukaR-10綠色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin綠色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan酶來源生產(chǎn)廠家纖維素酶類OnozukaR-10綠色木霉Ya酶來源生產(chǎn)廠家果膠酶類MacerozymeR-10根霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo.PectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纖維素酶RhozymeHP-150黑曲霉RohmandHassCo.,Rhiladelphia,UAS酶來源生產(chǎn)廠家果膠酶類MacerozymeR-10根霉Ya酶解法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：獲得量大，適用廣泛。缺點(diǎn)：商品酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)。 會(huì)影響所獲原生質(zhì)體的活力。酶解法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：獲得量大，適用廣泛。沉降法漂浮法不連續(xù)梯度法原生質(zhì)體純化的方法沉降法漂浮法不連續(xù)梯度法原生質(zhì)體純化的方法飄浮法Protoplast采用比原生質(zhì)體密度大的高滲溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生質(zhì)體漂浮在液體表層的純化方法。優(yōu)點(diǎn)：可以避免分離的原生質(zhì)體因震蕩被組織碎片撞擊而破損。所用藥品簡單，成本低。缺點(diǎn)及補(bǔ)救措施： 對離心力要求比較嚴(yán)格，掌握不好，原生質(zhì)體則不易漂浮?？刹捎貌煌瑵舛群筒煌x心速度分次漂浮的方法。飄浮法Protoplast采用比原生質(zhì)體密度大的高滲溶液（蔗沉降法利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進(jìn)行過濾然后低速離心，使純凈完整的原生質(zhì)體沉積于試管底部。優(yōu)缺點(diǎn)：

純化原生質(zhì)體比較簡單。由于原生質(zhì)體沉積于試管底部，造成相互擠壓，常引起原生質(zhì)體的破碎。沉降法利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進(jìn)行過濾又稱界面法，采用兩種密度不同的溶液形成不連續(xù)梯度，通過離心使原生質(zhì)體與破損細(xì)胞分別處于不同液相中，從而純化原生質(zhì)體的方法。優(yōu)點(diǎn)：可以收集到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時(shí)避免收集過程中原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎。12mL碎片帶含原生質(zhì)體帶0.6mL

0.45M蔗糖0.45M甘露醇不連續(xù)梯度法又稱界面法，采用兩種密度不同的溶液形成不連續(xù)梯度，通過離心使植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件原生質(zhì)體鑒定低滲爆破法熒光增白劑法(calcoflowerwhite0.1%)原生質(zhì)體鑒定低滲爆破法原生質(zhì)體活力測定形態(tài)識別

形態(tài)完整、富含細(xì)胞質(zhì)、顏色新鮮的正常球形，放入低滲溶液中，可正常膨大。原生質(zhì)體活力測定形態(tài)識別原生質(zhì)體活力測定熒光顯微鏡識別(FDA法)FDA(fluoresceindiacetate)

本身不發(fā)熒光也不具有極性，能自由穿過細(xì)胞質(zhì)膜?；罴?xì)胞內(nèi)FDA可以被酯酶裂解，將能發(fā)熒光的極性部分釋放出來。熒光素則不能自由穿越質(zhì)膜，在完整的活細(xì)胞內(nèi)積累。使用濃度：0.01%原生質(zhì)體活力測定熒光顯微鏡識別(FDA法)使用原生質(zhì)體活力測定酚藏花紅染色法（0.1%)酚藏花紅能使無活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原生質(zhì)體不著色。 伊凡藍(lán)(Evan’sblue)染色法(0.025%)有活力但受損傷的細(xì)胞和死細(xì)胞能夠攝取這種染料，活細(xì)胞不攝取。

原生質(zhì)體活力測定酚藏花紅染色法（0.1%)伊凡影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素供試材料及預(yù)處理方法酶解條件：酶質(zhì)量、組合、濃度、pH、光照和溫度滲透壓穩(wěn)定劑質(zhì)膜穩(wěn)定劑分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離純化持續(xù)時(shí)間。分離用具

影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素供試材料及預(yù)處理方法酶的種類、組合、濃度材料纖維素酶半纖維素酶崩潰酶果膠酶離析酶蝸牛酶研究者煙草葉片禾谷類葉片油菜花粉馬鈴薯子葉馬鈴薯花粉1.02.01.01.01.00.51.00.1~0.20.50.51.0UchimiyaScott李仕瓊戴朝曦王蒂幾種草本植物原生質(zhì)體分離使用的酶種類及濃度(%)酶的種類、組合、濃度材料纖維素酶半纖維素酶崩潰酶果膠酶離析酶材料纖維素酶半纖維素酶崩潰酶果膠酶離析酶研究者枸杞愈傷組織檀香幼葉檀香愈傷組織榆幼葉山毛櫸幼葉胡楊懸浮細(xì)胞0.52.01.00.1~0.21.00.50.50.50.20.50.050.50.50.01~0.030.11.00.20.50.5孫勇如等LakshmiLakshmiDorinAhuja諸葛強(qiáng)幾種木本植物原生質(zhì)體分離使用的酶種類及濃度(%)材料纖維素酶半纖維素酶崩潰酶果膠酶離析酶研究者枸杞愈傷組織0pH分離原生質(zhì)體時(shí)，酶液的pH值是值得注意的問題。因?yàn)榻到饷傅幕盍图?xì)胞活力最適pH值是不一致的。如制備菜豆葉片原生質(zhì)體時(shí)：低pH（<4.5），酶的活力強(qiáng)，原生質(zhì)體分離速度快，但細(xì)胞活力差，被破壞的細(xì)胞較多;pH值偏高（7.0），酶活力差，原生質(zhì)體分離速度慢，完整的原生質(zhì)體數(shù)目較多。pH分離原生質(zhì)體時(shí)，酶液的pH值是值得注意的問題。因?yàn)榻到饷腹庹蘸蜏囟戎苽湓|(zhì)體時(shí)，在細(xì)胞中加入酶液、滲透壓穩(wěn)定劑、質(zhì)膜穩(wěn)定劑后，還需在一定時(shí)間內(nèi)保持一定的溫度，原生質(zhì)體方能釋放。脫壁的原生質(zhì)體對光非常敏感，分離原生質(zhì)體一般是在黑暗條件下進(jìn)行的。在28℃條件下，每分鐘40轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)4h后，葉片組織可完全分離。懸浮細(xì)胞需在25℃～33℃條件下酶解24h。光照和溫度制備原生質(zhì)體時(shí)，在細(xì)胞中加入酶液、滲透壓穩(wěn)定劑、質(zhì)滲透壓穩(wěn)定劑原生質(zhì)體由于細(xì)胞壁的解除和壁壓的消失將引起細(xì)胞破碎。因而在酶液、原生質(zhì)體洗滌液、培養(yǎng)液中必須調(diào)整滲透壓，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，防止細(xì)胞漲破或過分收縮而破壞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。常用的滲透壓穩(wěn)定劑：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，濃度約在0.40M~0.80M。滲透壓穩(wěn)定劑還可促進(jìn)分離的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁并繼續(xù)分裂。滲透壓穩(wěn)定劑原生質(zhì)體由于細(xì)胞壁的解除和壁壓的消失將引起細(xì)胞破質(zhì)膜穩(wěn)定劑目的：增加完整原生質(zhì)體的數(shù)量，防止質(zhì)膜破壞，促進(jìn)原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生和細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)。常用的質(zhì)膜穩(wěn)定劑 葡聚糖硫酸鉀、2-（N-嗎啉）-乙烷磺酸、氯化鈣、磷酸二氫鉀。質(zhì)膜穩(wěn)定劑目的：增加完整原生質(zhì)體的數(shù)量，防止質(zhì)膜破壞，促進(jìn)原原生質(zhì)體培養(yǎng)方法原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：原生質(zhì)體在液體環(huán)境中有較強(qiáng)的吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力。操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。缺點(diǎn)：原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育情況。液體淺層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：雙層培養(yǎng)法——液體-固體雙層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可能吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。缺點(diǎn)：不易觀察細(xì)胞的發(fā)育過程。雙層培養(yǎng)法——液體-固體雙層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：固體薄層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：使原生質(zhì)體處于固定位置，避免了原生質(zhì)體的漂浮游動(dòng)，有利于對單個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞壁再生及細(xì)胞團(tuán)形成的全過程進(jìn)行定點(diǎn)觀察。缺點(diǎn)：培養(yǎng)基溫度對薄層質(zhì)量和原生質(zhì)體分布有一定影響；另外，固體中單細(xì)胞生活能力弱，通氣狀況不良，第一次細(xì)胞分裂時(shí)間會(huì)推遲2d左右。固體薄層培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：瓊脂糖珠培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50ml一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，通過調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進(jìn)一步的生長和發(fā)育，這種方法由于改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進(jìn)了原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。瓊脂糖珠培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素原生質(zhì)體的活力原生質(zhì)體的起始密度適宜密度在104~105個(gè)／ml左右。在煙草葉原生質(zhì)體培養(yǎng)中，密度低于103個(gè)／ml時(shí)，細(xì)胞只能分裂一、二次，密度在104個(gè)／ml以上，植板率常顯著提高。滲透壓穩(wěn)定劑培養(yǎng)基營養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)經(jīng)常使用的KM-P培養(yǎng)基就是以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)；N6培養(yǎng)基則以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)改進(jìn)的。影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素原生質(zhì)體的活力影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素培養(yǎng)條件溫度，光照植物材料和基因型柑桔，葡萄，桃供體細(xì)胞的生長同步性影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素培養(yǎng)條件原生質(zhì)體再生過程原生質(zhì)體再生過程是指分離、純化的原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方法和良好的培養(yǎng)條件下，很快恢復(fù)細(xì)胞壁，再生細(xì)胞持續(xù)分裂形成細(xì)胞團(tuán)，最后或通過愈傷組織或通過胚狀體分化出完整植株的過程。細(xì)胞壁再生細(xì)胞分裂和愈傷組織或胚狀體形成植株再生原生質(zhì)體再生過程原生質(zhì)體再生過程是指分離、純化的原生質(zhì)體在適細(xì)胞壁再生是細(xì)胞分裂的先決條件再生所需時(shí)間與植物種類和起源細(xì)胞的分化程度及生理狀態(tài)有關(guān)。再生過程：先是質(zhì)膜合成細(xì)胞壁主要成分微纖維，然后在質(zhì)膜表面進(jìn)行聚合作用，形成多片層的結(jié)構(gòu)，以后在質(zhì)膜和片層結(jié)構(gòu)之間或在膜上產(chǎn)生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團(tuán)，最后形成完整的細(xì)胞壁。檢測新壁合成的方法熒光增白劑法(calcoflowerwhite0.1%)和電鏡技術(shù)細(xì)胞壁再生是細(xì)胞分裂的先決條件再生所需時(shí)間與植物種類和起源細(xì)細(xì)胞分裂植株再生愈傷組織或胚狀體形成細(xì)胞分裂植株再生愈傷組織或胚狀體形成原生質(zhì)體類型第一次分裂時(shí)間%植板率(%)細(xì)胞分裂情況愈傷組織分化速度原生質(zhì)體到再生植株煙草葉片4d

602周—20個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)1m形成芽3m胡蘿卜培養(yǎng)細(xì)胞6d

8~10d形成細(xì)胞團(tuán)，4周后形成胚狀體胚狀體3周后成苗4m矮牽牛愈傷組織4d2周后形成20~25個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)8~10周出芽3m油菜葉片2~3d15d形成細(xì)胞團(tuán)28d愈傷組織10d分化出芽3m馬鈴薯子葉48h9~10d形成16個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)2m馬鈴薯花粉2h15d形成細(xì)胞團(tuán)幾種不同類型的原生質(zhì)體分裂和發(fā)育速度比較6010-205-301046.1原生質(zhì)體類型第一次分裂植板率細(xì)胞分裂情況愈傷組織分化速度原生第二節(jié)原生質(zhì)體融合及培養(yǎng)原生質(zhì)體融合方法原生質(zhì)體融合類型第二節(jié)原生質(zhì)體融合及培養(yǎng)原生質(zhì)體融合方法植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件原生質(zhì)體融合（protoplastfusion)

體細(xì)胞雜種：雜種細(xì)胞可進(jìn)一步發(fā)育成雜種植物體。由融合細(xì)胞培養(yǎng)成的植株稱為體細(xì)胞雜種植株。兩種異源（種、屬間）原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互接觸從而發(fā)生膜融合，胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的過程。原生質(zhì)體融合（protoplastfusion)體細(xì)胞誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法化學(xué)融合(chemicalfusion)定義：利用化學(xué)融合劑，促使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合的方法。主要種類：鹽類融合法（NaNO3融合）高pH-高濃度鈣離子融合法PEG融合法電融合(electrofusion)利用改變電場來誘導(dǎo)原生質(zhì)體彼此連接成串，再施以瞬間強(qiáng)脈沖使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿而使原生質(zhì)體融合的方法。誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法化學(xué)融合(chemicalfusioNaNO3融合法機(jī)理：

NaNO3能誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的原因是鈉離子能中和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷，使凝聚的原生質(zhì)體質(zhì)膜緊密接觸，促進(jìn)細(xì)胞融合原生質(zhì)體表面帶有負(fù)電荷(-10～-30mV)，同性質(zhì)電荷彼此凝聚的原生質(zhì)體質(zhì)膜無法靠近到足以融合的程度。融合率0.1%~4%。例子：Power（1970），玉米與燕麥原生質(zhì)體融合NaNO3融合法機(jī)理：高pH-高濃度鈣離子融合法Keller和Melchers(1972，1974)首先發(fā)現(xiàn)高pH-高濃度鈣離子的誘發(fā)融合效應(yīng)。機(jī)理：鈣離子濃度決定著細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和可塑性，影響原生質(zhì)體膜的結(jié)合；高pH又能改變質(zhì)膜的表面電荷，有利于細(xì)胞融合鈣離子濃度和pH范圍因植物種類不同而異。（例：煙草原生質(zhì)體融合－－pH10.5，0.05mMCaCl2）高pH-高濃度鈣離子融合法Keller和Melchers(1PEG融合法誘導(dǎo)融合的機(jī)理PEG具有分子橋的作用

原生質(zhì)體－水、蛋白質(zhì)和碳水化合物－（氫鍵）PEG（氫鍵）－原生質(zhì)體 打破電荷平衡 再經(jīng)高濃度Ca2＋和高pH溶液處理并用培養(yǎng)液清洗，可能使一種原生質(zhì)體上的帶正電荷的基團(tuán)連到另一種原生質(zhì)體的帶負(fù)電荷的基團(tuán)上，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。PEG融合法誘導(dǎo)融合的機(jī)理PEG融合技術(shù)的要點(diǎn)融合液配置A液：CaCl2 2~8mM KH2PO4 0.5~0.7mM

甘露醇或山梨醇 0.1~0.2mM PEG（分子量6000） 25%~30% pH 5.8 B液：CaCl2 2~8mM KH2PO4 0.5~0.7mM

甘露醇或山梨醇 0.1~0.2mM pH 7.0~10.0 PEG融合技術(shù)的要點(diǎn)融合液配置PEG融合技術(shù)的要點(diǎn)融合原生質(zhì)體的密度和比例密度：1×105個(gè)/毫升比例：1:1融合融合原生質(zhì)體溶液0.1~0.5ml，靜置3～5min融合液A0.1~0.5ml，保持15~20min，25℃融合液B0.1~0.5ml，保持10~20min，25℃培養(yǎng)液洗滌（3～4次），離心（100×g，5min）PEG融合技術(shù)的要點(diǎn)融合原生質(zhì)體的密度和比例植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件電融合基本原理：在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接、融合，形成融合體。電融合基本原理：電融合將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室微電極型平行多電極兩個(gè)電極的端部同時(shí)與兩個(gè)靠近的原生質(zhì)體膜表面接觸，原生質(zhì)體由于脈沖電流間斷刺激，兩層膜間產(chǎn)生小孔，連接成橋，經(jīng)點(diǎn)連接到面連接，最后形成融合體。平行多電極通過1MHz交流電場發(fā)生雙向電脈沖，原生質(zhì)體在電場力作用下，極化產(chǎn)生偶極子，原生質(zhì)體緊密排開成串珠狀。此時(shí)，加入直流電脈沖，質(zhì)膜被擊穿，進(jìn)一步形成融合體電融合將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室微電極型平行植物原生質(zhì)體組織培養(yǎng)課件電融合與PEG融合比較起來，電融合的優(yōu)點(diǎn)：不存在對細(xì)胞的毒害問題融合效率高融合技術(shù)操作簡便電融合參數(shù)（例：馬鈴薯，融合率>40%）交變電場的振幅頻率 100V/cm交變電場處理時(shí)間 20s直流高頻電壓 1100V/cm脈沖寬度 60us脈沖次數(shù) 1電融合與PEG融合比較起來，電融合的優(yōu)點(diǎn)：融合類型自發(fā)融合誘發(fā)融合對稱融合非對稱融合核失活細(xì)胞質(zhì)失活Flash融合類型自發(fā)融合Flash影響原生質(zhì)體融合的因素原生質(zhì)體質(zhì)量至關(guān)重要，高質(zhì)量的原生質(zhì)體是細(xì)胞融合的首要條件。融合方法融合參數(shù)，包括各種融合液都應(yīng)選擇適當(dāng)。影響原生質(zhì)體融合的因素原生質(zhì)體質(zhì)量至關(guān)重要，高質(zhì)量的原生質(zhì)體融合體類型異核體(heterokaryon)或異核細(xì)胞基因型不同的原生質(zhì)體融合成雜交細(xì)胞同核體(homokaryon)基因型相同的原生質(zhì)體融合成的雜交細(xì)胞非對稱雜種或細(xì)胞質(zhì)雜種融合體類型異核體(heterokaryon)或異核細(xì)(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物體細(xì)胞雜交過程示意圖標(biāo)志去壁(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物體細(xì)胞雜交過程示意圖植物體細(xì)胞的雜交過程植物體細(xì)胞的雜交過程細(xì)胞質(zhì)工程

(cytoplasmicengineering)細(xì)胞質(zhì)工程又稱細(xì)胞拆合工程是通過物理或化學(xué)方法將細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分開，再進(jìn)行不同細(xì)胞間核質(zhì)的重新組合，重建成新細(xì)胞?？捎糜谘芯考?xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的關(guān)系的基礎(chǔ)研究和育種工作。

細(xì)胞質(zhì)工程

(cytoplasmicengineering細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)雜種應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)，使兩種來源不同的核外遺傳物質(zhì)與一個(gè)特定的核基因組結(jié)合在一起細(xì)胞質(zhì)雜種獲得途徑（4條）：一個(gè)正常原生質(zhì)體與一個(gè)去核原生質(zhì)體融合；Lorz等（1981）用密度梯度離心（5％~50%Percoll，20000~40000g，40~90min）獲得高純度的去核原生質(zhì)體。細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)雜種細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)雜種獲得途徑一個(gè)正常原生質(zhì)體和一個(gè)核失活原生質(zhì)體融合使核失活的方法：X射線，碘乙酰胺，羅丹明異核體形成后，兩個(gè)核中有一個(gè)消失；較晚時(shí)期，染色體選擇性消失。細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)雜種獲得途徑體細(xì)胞雜種產(chǎn)生的其它途徑細(xì)胞器移植葉綠體移植葉綠體的來源 葉片－－－機(jī)械法－低速離心 原生質(zhì)體－低滲漲破－低速離心葉綠體的純化

Percoll或蔗糖密