總氮量的測定-微量凱氏定氮法

實驗四微量凱氏定氮法實驗類型：綜合項目學時：5目的掌握微量凱氏定氮法測定樣品總氮量和蛋白質(zhì)的原理和方法學會使用凱氏定氮儀原理凱氏(Kjeldahl)定氮法常用于測定天然有機物(如蛋白質(zhì)，核酸及氮基酸等)的含氮量。天然含氮有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫被分別氧化成CO2和H2O,而氮則變成氨，并進一步與硫酸作用生成硫酸銨，是為“消化”。該反應(yīng)進行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀/硫酸鈉以提高反應(yīng)的沸點，并加入硫酸銅作為催化劑促進反應(yīng)的進行。以甘氨酸為例，其消化過程可表示如下：CHCOOH+3HSO.2CO?+3SOJ4HO+NHt2242223INH22NH+HSOf(NH)SO324424濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量及一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結(jié)合，生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然后用標準無機酸滴定，直至恢復溶液中原來氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標準酸的當量數(shù)(相當于待測物中氨的當量數(shù))計算出待測物中的氮量。(NH4)SO+2NaOH-NaSO+2NHOHTOC\o"1-5"\h\z24244NHOHfHO+NH3T42NH+HBOfNHHBO333423NHHBO+HCLfNHCL+HBO423433滴定時用甲烯藍和甲基紅混合指示劑，其指示范圍為pH5.2~5.6，將NH4H2BO3的藍/綠色滴至原來H3BO3的藍紫色即為終點。本法適用范圍0.2?1.0mg氮，相對誤差應(yīng)小于2%。試劑與器具試劑濃硫酸（化學純）30%氫氧化鈉（分析純）溶液0.9%NaCl溶液硫酸鉀-硫酸銅混合物:硫酸鉀與硫酸銅以3:1（W/W）配比混合研磨成粉末2%硼酸混合指示劑（田氏）：0.1%甲烯藍乙醇溶液50ml與0.1%甲基紅乙醇溶液200ml混合配成（貯于棕色瓶備用，這種指示劑酸性時為紫色，堿性時為綠色，變色范圍窄且靈敏）0.0500MHCl硼酸-指示劑混合液：2%硼酸溶液100ml，滴加混合指示劑貯備液，搖勻后溶液呈現(xiàn)紫紅色即可（約加1ml左右混合指示劑）。標準硫酸銨溶液（0.3mgN/ml）卵清蛋白等含蛋白質(zhì)樣品器具凱氏燒瓶消化架吸量管（1ml,2ml）量筒（10ml）凱氏定氮蒸餾裝置容量瓶（50ml）微量滴定管（3ml,5ml,可讀至0.02ml）錐形瓶（50~100ml）操作步驟㈠樣品的處理血清樣品：取人血（或豬血）放于離心管中，于冰箱中放置過夜，次日離心除去凝血塊，上層黃色透明清液即為血清。準確吸取血清1.0ml加入0.9%NaCl4.0ml，仔細混勻備用。固體樣品：在稱量瓶中稱入一定量的磨碎的樣品，置105℃（非游離的水不能在100℃以下烘干）烘箱內(nèi)干燥4h至恒重。㈡消化取2個50ml凱氏燒瓶，向1號燒瓶內(nèi)加2ml稀釋血清溶液或0.1g干燥樣品（直接加至燒瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶頸上），向2號燒瓶加入2ml水作空白對照。在每個燒瓶內(nèi)加入硫酸鉀-硫酸銅混合物約0.2g，濃硫酸3ml,小瓷片兩粒，搖勻。將燒瓶約60度角固定在鐵架上，每個瓶口放一小漏斗，在通風廚內(nèi)的電爐上消化。在消化開始時，應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當加強火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明藍綠色為止。消化完畢，待燒瓶內(nèi)容物冷卻后，加蒸餾水10ml（注意慢加，邊加邊搖）。冷卻后將瓶內(nèi)容物轉(zhuǎn)入50ml容量瓶，并用蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度搖勻，做上記號備用。㈢蒸餾1、儀器的洗滌：儀器應(yīng)先經(jīng)一般洗滌，再經(jīng)水蒸氣洗滌。使用方法如下：開放自來水龍頭，使水E進入G，從K管流出（水不宜開得過大以免水從G管溢出）。開放P3,使水進入A室，漏斗D中加蒸餾水約10ml入B室。用拇指將管口按緊，同時開放P1，則B室中的水先從Y型管口沖出，隨后A室中水經(jīng)K管流出，一般情況下如此重復洗滌兩次即可。若蒸餾器內(nèi)有氨存在，則應(yīng)加入蒸餾水后，不加樣品蒸餾一次方可使用（可用pH試紙檢查）。A為蒸氣發(fā)生室，P3為其開關(guān)，P1為出水開關(guān)，B為蒸餾室，與出氣管M相接，M管插入盛有定量硼酸液的錐形瓶，B室內(nèi)有Y型管，一端與A室相通，另一端經(jīng)P4與漏斗D相連，可經(jīng)此將樣品及試劑加入B室，F(xiàn)為冷凝管，E為進水管，水經(jīng)F、G、K而流出，蒸餾時依次在B室加入消化好的樣品及NaOH,二者反應(yīng)產(chǎn)生氨，經(jīng)M管進入錐形瓶由硼酸吸收。E-—圖1-1凱氏微量定氮蒸儲裝置2、蒸儲標準樣品先用標準硫酸鏤溶液試驗2?3次。蒸儲器洗凈后，開放水龍頭P3,使水進入A室，水放至A室球部即可。取3個50ml錐形瓶，各準確加入10ml硼酸（加指示劑1-2滴，溶液呈淡紫色或灰色），用表面皿復蓋備用。加樣：用移液管吸取1ml標準硫酸鏤溶液，細心地由漏斗D傾入蒸儲室，再用蒸儲水1ml清洗漏斗。取一個盛有硼酸+混合指示劑的錐形瓶，置于M管下，使管口恰好接觸硼酸溶液，用量筒從漏斗D加入30%氫氧化鈉8mL隨即將P4夾緊，并往漏斗加入少量蒸儲水封閉（水封）。蒸儲：用酒精燈加熱（應(yīng)用擋風板將燈圍攏，維持火力恒定）；待第一滴蒸儲液從冷凝柱F頂端滴下后繼續(xù)蒸儲5min（或待硼酸+指示劑變綠時開始計時約3min）,然后將錐形瓶放低，使導管離開液面再蒸2min,最后用蒸儲水洗導管外壁。蒸儲完畢，取下錐形瓶，隨即將蒸儲器洗凈。3、樣品及空白蒸餾：用移液管分別吸取兩個1ml樣品和1ml蒸餾水按上述操作步驟進行蒸餾。(2samples+1blank)/group(2students)4、滴定：蒸餾完畢，用0.0500N標準鹽酸溶液滴定錐瓶內(nèi)溶液至淡紫色或灰色，記錄所用鹽酸的量。計算樣品的總氮含量氮％)=A—B"0.0100-14*I。。Cx1000若測定的樣品含氮量部分只是蛋白性，(如血清)則：(A—B)x0.0100x14x6.25樣品的總蛋白含量(克蛋白％)=x100Cx1000式中：A為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)；B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)；C為稱量樣品的克數(shù)(0.4g)；0.0100為鹽酸的當量濃度(即本實驗使用鹽酸的實際濃度)；14為氮的原子量；6.25為常數(shù)。若樣品中除有蛋白外，尚有其他含氮物質(zhì)，則樣品蛋白質(zhì)含量的測定要更復雜一些。首先需向樣品中加入三氯乙酸，使其最終濃度為5%，然后測定未加三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后的樣品的上清液中的含氮量，從而計算出蛋白氮，再進一步算出蛋白質(zhì)的含量。蛋白氮=總氮—非蛋白氮蛋白質(zhì)含量(克/%)=蛋白氮X6.25注意事項1、凱氏法的優(yōu)點是適用范圍廣，可用于動植物的各種組織，器官及食品等成組復雜樣品的測定，只要細心操作都能得到精確的結(jié)果。其缺點是操作比較復雜，含有大量堿性氨基酸的蛋白質(zhì)測定結(jié)果偏高。2、普通實驗室中的空氣中常含有少量的氨