生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)

第三章生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)掌握分光光度技術(shù)、離子選擇性電極分析技術(shù)、干化學(xué)分析技術(shù)、電泳分析技術(shù)的基本原理熟悉生化常規(guī)檢驗(yàn)儀器的使用方法，及其影響因素和有關(guān)注意事項(xiàng)了解各種生化常用技術(shù)的臨床應(yīng)用，關(guān)注生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)學(xué)習(xí)目標(biāo)：第一節(jié)光譜分析技術(shù)利用物質(zhì)具有吸收、發(fā)射或散射光譜譜系的特點(diǎn)，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量的分析技術(shù)光譜分析技術(shù)靈敏、準(zhǔn)確選擇性強(qiáng)快速、簡(jiǎn)便應(yīng)用范圍廣生物化學(xué)檢驗(yàn)中最基本和最常用的分析技術(shù)光譜分析技術(shù)分類(lèi)光譜分析技術(shù)吸收光譜分析可見(jiàn)光及紫外分光光度法原子吸收分光光度法紅外分光光度法發(fā)射光譜分析火焰光度法原子發(fā)射分光光度法熒光光譜法散射光譜分析散射比濁法透射比濁法第一節(jié)光譜分析技術(shù)一、吸收光譜分析法（一）分光光度法的基本原理

根據(jù)Lambert-Beer定律，當(dāng)一束平行單色光通過(guò)均勻的非散射樣品時(shí)，吸光度與溶液層厚度和溶液濃度成正比入射光I0透射光I第一節(jié)光譜分析技術(shù)式中A為吸光度；K為比例常數(shù)，稱(chēng)為吸光系數(shù)；L為溶液層厚度，稱(chēng)為光徑；C為溶液濃度根據(jù)Lambert－Beer定律，當(dāng)溶液層厚度單位為1cm，濃度單位為1mol/L時(shí)，吸光系數(shù)K稱(chēng)為摩爾吸光系數(shù)（ε）ε是物質(zhì)的特征性常數(shù)。在固定條件（入射光波長(zhǎng)、溫度等）下，特定物質(zhì)的ε不變，這是分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性的基礎(chǔ)第一節(jié)光譜分析技術(shù)應(yīng)用Lambert－Beer定律時(shí)必須符合3個(gè)條件：二是被測(cè)樣品必須是均勻介質(zhì)應(yīng)用Lambert－Beer定律時(shí)必須符合3個(gè)條件：三是在吸收過(guò)程中，吸收物質(zhì)之間不能發(fā)生相互作用一是入射光必須為單色光第一節(jié)光譜分析技術(shù)8Lambert－Beer定律的偏離現(xiàn)象：溶液本身發(fā)生化學(xué)變化引起的偏離儀器因素引起的偏離溶液不是稀溶液時(shí)會(huì)引起偏離非單色入射光會(huì)引起偏離光的散射、折射引起的偏離第一節(jié)光譜分析技術(shù)9空白溶液的選擇樣品空白溶劑空白不顯色空白平行操作空白試劑空白當(dāng)顯色劑及其它試劑均無(wú)色，被測(cè)試樣中又無(wú)其他有色粒子時(shí)，選用空白溶劑參比當(dāng)樣品基體溶液有顏色，而顯色劑無(wú)顏色且顯色劑也不與樣品基體顯色時(shí)，選用樣品空白當(dāng)顯色劑和被測(cè)試樣均有顏色時(shí)，選用不顯色空白與樣品分析完全相同的操作步驟，用不含待測(cè)元素的樣品溶液進(jìn)行平行操作當(dāng)顯色劑或其它試劑有顏色，而被測(cè)試樣中又無(wú)其他有色粒子時(shí)，選用試劑空白參比第一節(jié)光譜分析技術(shù)10（二）分光光度法在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用1.對(duì)未知化合物進(jìn)行定性分析2.對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法（2）比較法（3）其它分析方法一、吸收光譜分析法第一節(jié)光譜分析技術(shù)（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系待測(cè)溶液測(cè)定吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度第一節(jié)光譜分析技術(shù)制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：①當(dāng)測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品、更換光電池或光源以及試劑批號(hào)不同時(shí)），標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)重新繪制②標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制必須準(zhǔn)確③當(dāng)待測(cè)液吸光度超過(guò)線性范圍時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測(cè)定④標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致⑤標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)置的濃度范圍須足夠大，應(yīng)達(dá)到觀察拐點(diǎn)第一節(jié)光譜分析技術(shù)（二）比較法Cx=(Ax×Cs)/As

己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為：

其中Cx和Ax為標(biāo)本管濃度和吸光度，Cs和As分別為標(biāo)準(zhǔn)管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近

（三）其它分析方法包括差示法、多組分混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法第一節(jié)光譜分析技術(shù)二、發(fā)射光譜分析法分子、原子或離子在輻射能的作用下，由基態(tài)或低能態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)它們返回基態(tài)或低能態(tài)時(shí)，以輻射的形式釋放出能量，由此而產(chǎn)生的光譜發(fā)射光譜（一）火焰光度法（二）熒光分光光度法第一節(jié)光譜分析技術(shù)15火焰光度法基本原理：指在一定條件下，以火焰作為激發(fā)源提供熱能，使樣品中待測(cè)元素原子化，由于原子能級(jí)的變化，產(chǎn)生特征的發(fā)射譜線

火焰光度法臨床應(yīng)用：主要用于血清及尿液樣品中鈉、鉀的測(cè)定特征輻射基態(tài)元素M激發(fā)態(tài)M*熱能（火焰）E第一節(jié)光譜分析技術(shù)固定熒光的發(fā)射波長(zhǎng)而不斷改變激發(fā)光（即入射光）的波長(zhǎng)，并記錄相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，所得到的熒光強(qiáng)度對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)的譜圖稱(chēng)為熒光的激發(fā)光譜使激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度保持不變，不斷改變熒光的發(fā)射波長(zhǎng)并記錄相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，所得到的熒光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的譜圖稱(chēng)為熒光的發(fā)射光譜熒光的激發(fā)光譜熒光的發(fā)射光譜熒光光譜基本原理：熒光是分子吸收光能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷返回基態(tài)時(shí)所發(fā)射出的光熒光光譜臨床應(yīng)用：大量具有生物意義的物質(zhì)，都可采用熒光分光光度法進(jìn)行分析測(cè)定，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、酶和輔酶、嘌呤、嘧啶、卟啉、維生素等第一節(jié)光譜分析技術(shù)17三、散射光譜分析法利用懸浮顆?；鞚嵋旱纳⑸涔鈴?qiáng)度或?qū)θ肷涔鉁p弱的原理進(jìn)行定量分析的方法散射光譜分析法（一）散射比濁法（二）透射比濁法第一節(jié)光譜分析技術(shù)18散射比濁法基本原理：一定波長(zhǎng)的光沿水平軸照射，通過(guò)溶液時(shí)，遇到抗原抗體復(fù)合物粒子，光線被粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)和抗原抗體復(fù)合物顆粒大小和多少密切相關(guān)，光強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比透射比濁法基本原理：當(dāng)光線通過(guò)一定體積的溶液時(shí)，由于溶液中存在顆粒（抗原－抗體復(fù)合物）對(duì)光線的反射和吸收，引起透射光的減少，透射光的透光率和粒子的量成反比。通過(guò)測(cè)定透射光的透光率來(lái)反映粒子的量的方法即透射比濁法三、散射光譜分析法第一節(jié)光譜分析技術(shù)第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)利用物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)，測(cè)定化學(xué)電池的電流、電位、電導(dǎo)、電量等物理量的變化，從而測(cè)定物質(zhì)組成及含量的分析方法電化學(xué)分析技術(shù)靈敏、準(zhǔn)確儀器簡(jiǎn)單快速、簡(jiǎn)便價(jià)格低廉它是電化學(xué)和分析化學(xué)學(xué)科的重要組成部分21電化學(xué)分析法電位分析法測(cè)定原電池電動(dòng)勢(shì)以求物質(zhì)含量的分析方法電導(dǎo)法

通過(guò)測(cè)定電阻以求物質(zhì)含量的分析法電容量分析法借助某些物理量的突變作為滴定分析終點(diǎn)的指示第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)22電位分析法基本原理：利用電極電位和濃度之間的關(guān)系來(lái)確定物質(zhì)含量的分析方法，表示電極電位的基本公式是Nernst方程式電極電位測(cè)量：由于單個(gè)電極電位的絕對(duì)值無(wú)法測(cè)量，必須將ISE與參比電極共同浸入待測(cè)樣品中組成一個(gè)原電池，通過(guò)測(cè)量原電池電動(dòng)勢(shì)（E電池）來(lái)測(cè)定EISE值參比電極：通常為負(fù)極，常用的有甘汞電極和銀－氯化銀電極，其電極電位不隨測(cè)定溶液和濃度變化而變化一、電位分析法第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)23ISE基本結(jié)構(gòu)①電極腔體：玻璃或高分子聚合物材料做成②內(nèi)參比電極：通常為Ag/AgCl電極③內(nèi)參比溶液：由氯化物及響應(yīng)離子的強(qiáng)電解質(zhì)溶液組成④敏感膜（電極膜）離子選擇性電極分析法(ionselectiveelectrode，ISE)是電位分析法中發(fā)展最為迅速、最為活躍的分支第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)常用的離子選擇性電極（ISE）玻璃膜電極敏感膜由玻璃材料制成，最常見(jiàn)為pH玻璃電極氣敏電極氣敏電極是基于界面化學(xué)反應(yīng)對(duì)氣體敏感而設(shè)計(jì)的一類(lèi)敏化電極。如氨氣敏電極酶電極酶電極是另一種敏化電極，其原理是將含酶的凝膠涂布于離子選擇性電極的敏感膜上組成酶電極第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)離子選擇性電極的分析方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法配置一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)測(cè)得的系列電動(dòng)勢(shì)(E)值與濃度對(duì)數(shù)(lgC)作圖，得E－lgC標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)比較法在相同條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液的Es和Ex值，由于標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度Cs是已知的，根據(jù)比較法即可測(cè)出待測(cè)物質(zhì)濃度Cx標(biāo)準(zhǔn)加入法該方法適用于體系比較復(fù)雜，且與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度有較大差別的待測(cè)液第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)直接法指樣品不經(jīng)稀釋直接由電極測(cè)量離子活度優(yōu)點(diǎn)是可采用全血測(cè)定，它迅速方便，結(jié)果準(zhǔn)確，不會(huì)因血清中水體積所占比例的改變而影響結(jié)果間接法指樣品經(jīng)一定離子強(qiáng)度緩沖溶液稀釋后由電極測(cè)量離子活度優(yōu)點(diǎn)是樣品用量少；由于樣品預(yù)先進(jìn)行稀釋?zhuān)灰锥氯艿?；降低了血脂、不溶性蛋白質(zhì)對(duì)電極的污染及損耗，使電極的壽命延長(zhǎng)樣品測(cè)定方法：第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)離子選擇性電極對(duì)任何標(biāo)本的測(cè)量，都可能存在離子強(qiáng)度、絡(luò)合劑及干擾物質(zhì)的影響，不同的分析方法其影響的大小不同通常在標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)本溶液中加入與待測(cè)離子無(wú)干擾的濃度較大的電解質(zhì)溶液，作為總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖液（totalionicstrengthadjustmentbuffer，TISAB）TISAB可保持較大且相對(duì)穩(wěn)定的離子強(qiáng)度，使活度系數(shù)恒定；維持溶液在適宜的pH范圍內(nèi)，滿足離子電極的要求；還能掩蔽干擾離子電極分析法的影響因素：第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)電極分析法在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用—電解質(zhì)分析儀第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)二、電導(dǎo)分析法將被分析溶液放在固定面積、固定距離的兩個(gè)電極所構(gòu)成的電導(dǎo)池中，通過(guò)測(cè)定電導(dǎo)池中電解質(zhì)溶液的電導(dǎo)值來(lái)確定物質(zhì)的含量電導(dǎo)分析法檢測(cè)紅細(xì)胞壓積紅細(xì)胞由于其具有脂質(zhì)雙分子層的膜結(jié)構(gòu)而被認(rèn)為是電的絕緣體血細(xì)胞計(jì)數(shù)

其原理基于血細(xì)胞的電導(dǎo)率低于作為懸浮介質(zhì)的鹽溶液的電導(dǎo)率（“庫(kù)爾特原理”）應(yīng)用第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)三、電容量分析法根據(jù)滴定過(guò)程中電極電位的變化來(lái)確定滴定終點(diǎn)的分析方法。滴定過(guò)程中，隨著滴定劑的加入，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，待測(cè)離子或與之有關(guān)的離子活度（濃度）發(fā)生變化，指示電極的電極電位（或電池電動(dòng)勢(shì)）也隨著發(fā)生變化，在化學(xué)計(jì)量點(diǎn)附近，電位（或電動(dòng)勢(shì)）發(fā)生突躍，由此確定滴定的終點(diǎn)電容量分析法第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)指將液態(tài)樣品如血漿、血清、尿液等置于含有試劑的固相載體上發(fā)生反應(yīng)，依照反應(yīng)結(jié)果定量測(cè)定樣品中特定成分的濃度或活度的一項(xiàng)技術(shù)干化學(xué)分析是一種專(zhuān)門(mén)使用固相載體試劑進(jìn)行臨床化學(xué)檢驗(yàn)的分析儀，它通過(guò)反射光度法、差示電位法等方法定量測(cè)出樣品中特定成分的濃度或活度干化學(xué)分析儀33干式化學(xué)的多層膜試劑載體

基于反射光度法的多層膜基于差示電位法的離子選擇電極的多層膜基于熒光技術(shù)和競(jìng)爭(zhēng)免疫技術(shù)的熒光反射光度法多層膜干化學(xué)技術(shù)普遍采用多層膜固相試劑技術(shù)，即干式化學(xué)的多層膜試劑載體，它集中現(xiàn)代化學(xué)、光學(xué)、酶工程學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體，已使其作為定量方法一、干化學(xué)分析技術(shù)的基本原理第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)34理論基礎(chǔ)：遵從Kubelka-Munk理論光反射率與固相層的厚度、單位厚度的光吸收系數(shù)以及固相反應(yīng)層的散射系數(shù)有關(guān)系，當(dāng)固相層厚度和固相反應(yīng)層的散射系數(shù)固定時(shí)，光吸收系數(shù)同待測(cè)物的濃度成正比（一）反射光度法第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)35多層膜干片結(jié)構(gòu)（1）樣本擴(kuò)散層（2）反射層（3）輔助試劑層（4）試劑層（5）透明支持層基于反射光度法的多層膜干片結(jié)構(gòu)示意圖第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)基于傳統(tǒng)濕化學(xué)分析的離子選擇電極原理，用于測(cè)定無(wú)機(jī)離子（二）差示電位法多層膜結(jié)構(gòu)（1）離子選擇性敏感膜（2）參比層（3）氯化銀層（4）銀層（5）支持層第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)37干化學(xué)自動(dòng)分析儀已廣泛應(yīng)用于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的各個(gè)方面，檢測(cè)的項(xiàng)目已多達(dá)70余項(xiàng)，包括常規(guī)生化、內(nèi)分泌激素、毒素、藥物濃度分析以及特種蛋白等免疫學(xué)檢驗(yàn)干化學(xué)分析儀的分類(lèi)反射光度法系統(tǒng)膠片涂層技術(shù)分析系統(tǒng)袋式分析儀二、干化學(xué)分析技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)38干化學(xué)分析法的特點(diǎn)：速度快，靈敏度和準(zhǔn)確度與典型的分離式儀器相近應(yīng)用Lambert－Beer定律時(shí)必須符合3個(gè)條件：超微量，操作簡(jiǎn)單，占用空間小，使用過(guò)程中靈活機(jī)動(dòng)性強(qiáng)脫離了傳統(tǒng)的分析方法，所有的測(cè)定參數(shù)均存儲(chǔ)于儀器的信息磁場(chǎng)塊中第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)39區(qū)別點(diǎn)干化學(xué)濕化學(xué)試劑固相，大多無(wú)需定標(biāo)，穩(wěn)定周期長(zhǎng)（數(shù)月），全血可直接上機(jī)檢測(cè)液體，需要定標(biāo)，穩(wěn)定周期短，全血不可直接上機(jī)檢測(cè)儀器磁卡校正，無(wú)需排水系統(tǒng)，分析前后無(wú)需清洗每次測(cè)試原則上需要校正，需要排水系統(tǒng)，測(cè)試前后需清潔反應(yīng)載體固相介質(zhì)反應(yīng)杯檢測(cè)方法反射光度法透射光度法電解質(zhì)測(cè)定差示電位法離子選擇性電極法理論基礎(chǔ)Kubelka-Munk理論和Williams-Clapper公式Lambert-Beer定律干化學(xué)和濕化學(xué)生化檢測(cè)的主要區(qū)別第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)401.儀器監(jiān)測(cè)2.校準(zhǔn)頻度3.質(zhì)控物4.干片試劑的儲(chǔ)存與使用5.工作環(huán)境溫度和濕度三、干化學(xué)分析技術(shù)的影響因素第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)第四節(jié)電泳分析技術(shù)第四節(jié)電泳分析技術(shù)1937年瑞典的Tiselius創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，最早建立了研究蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳方法1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法1950年Durrum用紙電泳進(jìn)行了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳由80年代發(fā)展起來(lái)的新的毛細(xì)管電泳技術(shù)由90年代至今，電流分析儀的最大變化特點(diǎn)為自動(dòng)化程度日益提高，應(yīng)用領(lǐng)域大大增加一、電泳分析技術(shù)的基本原理溶液中帶電粒子在電場(chǎng)中定向移動(dòng)的現(xiàn)象稱(chēng)為電泳電泳利用電泳現(xiàn)象對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)叫電泳技術(shù)電泳技術(shù)第四節(jié)電泳分析技術(shù)(一)蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）：如果在某一pH值溶液中，蛋白質(zhì)所帶的正負(fù)電荷相等，即蛋白質(zhì)的凈電荷為零，蛋白質(zhì)電離為兼性離子時(shí)，該溶液的pH值稱(chēng)為該物質(zhì)的等電點(diǎn)粒子的荷電量可以通過(guò)調(diào)節(jié)pH值與pI之間的差值加以控制，差值越大，粒子荷電量越多第四節(jié)電泳分析技術(shù)(二)電泳遷移率電泳遷移率是指在單位電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)帶電粒子的遷移速度帶電粒子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過(guò)程中具有不同的遷移速度，形成了依次排列的不同區(qū)帶而被分開(kāi)。即使兩個(gè)粒子具有相似的電荷，如果它們的分子大小不同，所受的阻力不同，因此遷移速度也不同，在電泳過(guò)程中就可以被分離遷移率與帶電粒子所帶凈電荷成正比，與粒子的大小和緩沖液的黏度成反比第四節(jié)電泳分析技術(shù)血清蛋白等電點(diǎn)電泳遷移率（cm2/s·V）清蛋白4.845.9×10-5α1-球蛋白5.065.1×10-5α2-球蛋白5.064.1×10-5β-球蛋白5.122.8×10-5γ-球蛋白6.85～7.301.0×10-5血清蛋白等電點(diǎn)和電泳遷移率第四節(jié)電泳分析技術(shù)影響因素分子的形狀與性質(zhì)球形移動(dòng)速度快纖維狀移動(dòng)速度慢電場(chǎng)強(qiáng)度高電場(chǎng)強(qiáng)度,電泳速度加快，電流強(qiáng)度也增大，產(chǎn)熱增多低電場(chǎng)強(qiáng)度,電泳速度減慢。電泳時(shí)間增長(zhǎng)，增加了標(biāo)本的擴(kuò)散電泳緩沖液pH值:一般設(shè)在4.5～9.0為宜緩沖溶質(zhì):化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、緩沖容量大、電導(dǎo)率低、離子移動(dòng)性好離子強(qiáng)度:緩沖液的導(dǎo)電能力,以0.05～0.1mol/L為宜支持介質(zhì)吸附作用：吸附作用可阻滯標(biāo)本的移動(dòng)，出現(xiàn)區(qū)帶拖尾現(xiàn)象電滲作用：電場(chǎng)中液相對(duì)固相的相對(duì)移動(dòng)稱(chēng)為電滲蒸發(fā)(三)影響電泳的因素第四節(jié)電泳分析技術(shù)支持介質(zhì)的電滲作用第四節(jié)電泳分析技術(shù)二、常用電泳分析技術(shù)及應(yīng)用按電泳方式分類(lèi)移動(dòng)界面電泳區(qū)帶電泳穩(wěn)態(tài)電泳第四節(jié)電泳分析技術(shù)BEAF以醋酸纖維素薄膜作為支持介質(zhì)的一項(xiàng)電泳技術(shù)以瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的一項(xiàng)電泳技術(shù)利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一項(xiàng)電泳技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳醋酸纖維素薄膜電泳等電聚焦電泳按電泳支持物分類(lèi)第四節(jié)電泳分析技術(shù)二、常用電泳分析技術(shù)及應(yīng)用1.醋酸纖維素薄膜電泳優(yōu)點(diǎn)：醋酸纖維素幾乎不帶電荷，吸附作用和電滲作用都很微弱；分辨率高，區(qū)帶清晰；不吸附染料，區(qū)帶周?chē)玖峡赏耆锤蓛?；極易透明，便于區(qū)帶掃描定量；透明后的薄膜易于干燥，電泳區(qū)帶可長(zhǎng)期保存缺點(diǎn)：吸水性較差，較脆，電泳時(shí)水分容易蒸發(fā)。因此要求電泳槽密閉性能要好，始終維持水蒸氣飽和，電流強(qiáng)度不宜過(guò)大，一般保持在0.4～0.6mA/cm寬為宜第四節(jié)電泳分析技術(shù)2.瓊脂糖凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)：瓊脂糖凝膠透明度好，便于區(qū)帶掃描。適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化，在臨床生化檢驗(yàn)中常用于LDH、CK等同工酶的檢測(cè)缺點(diǎn)：電泳完畢后區(qū)帶易擴(kuò)散，可及時(shí)固定第四節(jié)電泳分析技術(shù)3.聚丙烯酰胺凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)：1.既有電荷效應(yīng)又有分子篩效應(yīng)，分離效果好2.化學(xué)穩(wěn)定性高，是一種穩(wěn)定的親水膠體3.幾乎沒(méi)有吸附和電滲作用4.機(jī)械強(qiáng)度好，無(wú)色透明，可直接光密度掃描5.可調(diào)節(jié)凝膠孔徑以適合不同分子量的分離第四節(jié)電泳分析技術(shù)4.等電聚焦電泳是利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)等電聚焦（isoelectricfocusing，IEF）優(yōu)點(diǎn)：IEF是一種簡(jiǎn)便、快速、高效的分離分析方法，特別適用于氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶類(lèi)和抗體等的分離分析，能夠滿足組分定量、雜質(zhì)檢出、質(zhì)量控制、臨床診斷等方面的要求第四節(jié)電泳分析技術(shù)(三)電泳區(qū)帶的測(cè)定電泳區(qū)帶的定性、定量測(cè)定直接法用紫外光掃描儀直接掃描電泳區(qū)帶染色法將電泳區(qū)帶用染料染色，洗脫背景，然后將區(qū)帶一一剪下用溶劑洗脫比色第四節(jié)電泳分析技術(shù)(三)電泳區(qū)帶的測(cè)定1.區(qū)帶定性分析主要觀察有無(wú)異常區(qū)帶出現(xiàn)2.區(qū)帶定量分析區(qū)帶定量分析常用光密度掃描法或洗脫比色法第四節(jié)電泳分析技術(shù)三、自動(dòng)電泳儀分析技術(shù)自動(dòng)電泳儀的電泳過(guò)程，包括加樣→遷移→染色→去色→烘干，都依次按程序自動(dòng)進(jìn)行自動(dòng)電泳儀分類(lèi)全自動(dòng)熒光/可見(jiàn)光雙系統(tǒng)電泳儀全自動(dòng)醋纖維膜電泳儀全自動(dòng)瓊脂糖電泳儀第四節(jié)電泳分析技術(shù)第五節(jié)基因擴(kuò)增技術(shù)第五節(jié)基因擴(kuò)增技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法。能使人們?cè)趲仔r(shí)內(nèi)從試管中獲得大量的特異的核酸片段。臨床實(shí)驗(yàn)室主要用于對(duì)病毒、細(xì)菌、支原體及其它病原體的檢測(cè)一、PCR反應(yīng)基本原理PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制基本相似。每一次循環(huán)復(fù)制包括3個(gè)步驟：

1.變性2.退火3.延伸2.退火（annealing）即在較低的溫度(40～70℃)下使加入的引物與待擴(kuò)增的DNA區(qū)域特異性結(jié)合，以提供DNA復(fù)制起始的3’-OH端3.延伸（extension）即在適當(dāng)?shù)臏囟认拢?0℃～75℃），DNA聚合酶特異性結(jié)合到DNA模板上的引物的3’-OH端，以dNTP為反應(yīng)原料，以靶序列為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，進(jìn)行DNA鏈的延伸，即合成DNA新鏈1.變性（denature）通過(guò)加熱至95℃左右，使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成DNA單鏈模板而游離于反應(yīng)體系中，此過(guò)程稱(chēng)為變性第五節(jié)基因擴(kuò)增技術(shù)61上述3個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)，使得特定長(zhǎng)度的靶D