新型抗鈣化無(wú)支架生物心臟瓣膜組織材料研究

縮寫(xiě) 中 英 前 實(shí)驗(yàn)研 第一部分瓣臘材料浸提液的及毒性試 第二部分體外細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)研 第三部分瓣膜材料組織穩(wěn)定性、力學(xué)性能實(shí)驗(yàn)研 結(jié) 文獻(xiàn)回 參考文 附 附錄：在讀期間及撰寫(xiě)的致 rheumaticheart風(fēng)濕性心bioprostheticheart生物心臟porcine豬牛心包戊二epoxy環(huán)氧氯polyepoxy環(huán)氧化AmericanSocietyof材料實(shí)驗(yàn)最低基礎(chǔ)培導(dǎo) 易定華教心臟瓣膜病是一種常見(jiàn)病，心臟瓣膜置換為其主要治療，但目前無(wú)機(jī)瓣還生瓣未達(dá)理程度機(jī)械置后需凝，遠(yuǎn)期血栓栓塞、、心肌梗死及腦血管意外等并發(fā)癥仍較高。與機(jī)械瓣相比，由豬主動(dòng)脈瓣或牛心包瓣制成的生物瓣為中心血流型，無(wú)需終身抗凝，可享受較高生活質(zhì)量。但異種生物瓣存在遠(yuǎn)期鈣化和衰壞的問(wèn)題，而同種生物瓣來(lái)源。新型抗鈣化異種生物瓣移植后可明顯近年來(lái)，在國(guó)外無(wú)支架瓣的研制與臨床應(yīng)用引起了廣泛關(guān)注，無(wú)支架生物瓣的推廣應(yīng)用是瓣膜外科發(fā)展的一個(gè)重要方向。在以往生物瓣抗鈣化和研制方面的工作基礎(chǔ)上，改進(jìn)抗鈣化方法，即把戊二醛處理的豬TritonX-100⑴.2.L-1TritonX-100磷酸緩沖液處理8天，然后3mL.L-1戊二醛溶液保存⑵.分 GA組：?jiǎn)渭兾於┨幚淼陌闑C組 戊二醛+環(huán)氧氯丙烷處理的瓣EC+Tr組:戊二醛+環(huán)氧氯丙烷+TritonX-100處理的瓣膜陽(yáng)性對(duì)照：乳膠橡膠或4.5mL.L-1苯酚水溶液⑴.參考ASTM《醫(yī)用裝置標(biāo)準(zhǔn)》試驗(yàn)方法和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)該生物瓣膜制⑵.參考ASTM《醫(yī)用裝置標(biāo)準(zhǔn)》試驗(yàn)方法，對(duì)生物瓣膜采用直接接觸細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)其細(xì)胞毒性，并采用MTT法，對(duì)該材料的浸提液進(jìn)行體外.組織穩(wěn)定性研究：利用熱皺縮溫度測(cè)定儀測(cè)定瓣膜組織的熱皺縮5℃2處理的瓣膜用Instron1122萬(wàn)能拉力儀測(cè)量最大抗張強(qiáng)度。生物相容性試驗(yàn)。溶血試驗(yàn)：EC+Tr組溶血指數(shù)1.78%，GA數(shù)2.77%，EC組溶血指數(shù)1.98%，均低于《ASTM醫(yī)用裝置標(biāo)準(zhǔn)》及5%,EC組、EC+Tr組比GA組吸光度明顯減低，P值<0.0550ml/kg,小鼠尾靜脈注射后，72小時(shí)內(nèi)40只小鼠無(wú)論GA組、EC組、EC+Tr組以及對(duì)照組無(wú)一用裝置標(biāo)準(zhǔn)》EC組、EC+Tr組和GA組相比，生物毒性評(píng)分明顯降低，P值<0.05。直接接觸法細(xì)胞毒性試驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照：材料下方及周圍8－12mm范圍內(nèi)出現(xiàn)大量細(xì)胞溶解、壞死，細(xì)胞及其碎片懸浮增加，殘留貼壁細(xì)胞形態(tài)畸形，透光度降低；對(duì)照：材料周圍及下方細(xì)胞生長(zhǎng)良好，數(shù)量無(wú)減少，無(wú)畸形、壞死出現(xiàn)；GA組：瓣膜材料周圍出現(xiàn)少量細(xì)胞畸形、懸浮，細(xì)胞數(shù)量減少，有壞死、溶解，細(xì)胞碎片增加；EC組和EC+Tr組：瓣膜材料周圍細(xì)胞生長(zhǎng)同對(duì)照材料相似，生長(zhǎng)良好，數(shù)量無(wú)減少，無(wú)畸形、壞死出現(xiàn)。表明該種生物瓣膜對(duì)L-929小鼠成纖維細(xì)胞株的生長(zhǎng)無(wú)明顯毒性作用，戊二醛處理的豬主動(dòng)脈瓣，經(jīng)環(huán)氧氯丙烷和聯(lián)合化學(xué)改性后，毒性較單純戊二醛處理的豬主動(dòng)脈瓣減輕。MTT法結(jié)果環(huán)氧氯丙烷的對(duì)體外細(xì)胞培養(yǎng)的毒性小與戊二醛，而TritonX-10070.2±0.5℃增加到89.78±1.33℃，差異顯著,P值<0.01,也優(yōu)于單純戊二醛處理的瓣膜熱皺縮溫度87.06±1.98℃，P值<0.05。組織濕度(%)EC+Tr組(89.78±1.33)和GA組(87.06±1.98)相比，明顯增加(P力學(xué)性能研究最大抗張強(qiáng)度和新鮮瓣膜相比，由504.7±23.46g/mm21273.4±142.56g/mm2，差異顯著,P值<0.01醛處理的瓣膜(988.7±48.65g/mm2P<0.01材料溶血實(shí)驗(yàn)指數(shù)均低于國(guó)際和國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，以環(huán)氧氯丙烷和TritonX-100聯(lián)合處理的無(wú)支架生物瓣材料為最低。TritonX-100聯(lián)合處理組小TritonX-100聯(lián)合處理的新型無(wú)支架生物瓣材料符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，明MTT法細(xì)胞毒性試驗(yàn)應(yīng)用環(huán)氧氯丙烷和TritonX-100聯(lián)合處理的新型無(wú)支架生物瓣材料毒性明顯小于戊二醛TritonX-100聯(lián)合處理組的無(wú)支架生物瓣材料能保TritonX-100聯(lián)合處理的無(wú)支架生物瓣是一種：氯丙烷；TritonX-100ExperimentalStudyForBiomaterialofaNewType YiCardiacvalvulardiseaseisverycommoninhumanbeing.Themostpopulartherapeuticprocedureforthecardiacvalvulardiseaseisvalvereplacement.Althoughremarkableadvancestowardanoptimalvalvereplacementhavebeenmadeoverthepastmanyyears,theidealprosthesishasnotbeenachieved.Mechanicalprosthesisesare paniedbyahigherincidenceofthromboembolism,bleeding,myocardialinfarctionandcerebrovascularaccident.Biologicalvalvularprosthesises,constructedfromporcineaorticvalvesorbovinepericardium,canprovidecentralbloodflow,andfreedomfromlife-longanticoagulation.Howeverthedurabilityofbioprosthesisremainsunsatisfactory.Structuralvalvedeteriorationprimaryduetodystrophiccalcificationandstress-relatedtearsorperforationsisthemostseriousvalve-relatedcomplicationofbioprosthesis.Homograftvalvesalsohavealimitedresourcesanddurability.Biochemicalfixationorcross-linkedtreatmenthassignificantimpactsonvalvularcalcification.Calcificationofbioprosthesisisrelatedtocommissuralbendingstrains.Stentlessdesigncouldreducesuchtissuestress,andalsoimprovehemodynamicperformance.Soanticalcificationtreatmentandstentlessdesignaretwomainmethodsforimprovementofbioprosthesis.Basedonourproceedstudiesofbioprostheticvalveanticalcification,weusedepoxychloropropaneandTritonX-100treatporcineaorticvalvepretreatedbyglutaraldehyde,andalsoadoptedanewtypestentlessvalvedesign.Earlystudieshadconfirmedthatthisbioprosthesishadverygoodperformanceinanticalcification.Sointhisexperimentlacedemphasisonresearchingcytotoxicity,hemolysisandotherphysicalandchemicalpropertiesofthebioprosthesisbeforeclinicaluse.Materialand⑴.Thevalvularmaterialscamefromporcineaorticvalve,whichistreatedby3mL.L-1glutaraldehyde48hours,20mL.L-1epoxychloropropane48hoursand12mL.L-1TritonX-1008daysinorder,andperseveredby3mL.L-1glutaraldehyde.⑵.GroupGAgroup:MaterialonlytreatedbyECgroup:MaterialtreatedbyglutaraldehydeandepoxychloropropaneEC+Trgroup:Materialtreatedbyglutaraldehyde,epoxychloropropaneandTritonX-Positivecontrol:4.5mL.L-1hydroxyberzeneorlactepreneNegativecontrol:SalineorPolyethyleneAccordingtothemethodsofAmerican《ASTMstandardsformedicaldevicesandtheinternationalstandards,wemadeexperimentsofpracticesforevaluationtoxicityofthevalvesbyassessmentofhemolyticproperties,systemicinjectioninthemouse,andprimaryskinirritationinrabbitsthroughevaluatingmaterialextracts.AccordingtothemethodsoftheASTMstandards,wemadeexperimentsofdirectcontactcellcultureandMTTtestswithmaterialextractstoevaluatethecytotoxicityofthevalvematerial. patibilityresearch.Wemeasuredthevalvularshrinkagetemperaturewithourself-madeshrinkagetemperaturemeter,andmeasureddegreeoftissuewetnessbycomparingweightofvalvesofbeforeandafter105℃,2hourstreatment.Mechanicalpropertyresearch.Wemearsuredtheumofstrengthofthevalvematerialwithinstron1122tensileforcemetertoevaluatetheirmechanicalcharacteristics. patibilitystudies.HemolyticindexesofGAgroup,ECgroup,andEC+Trgroupare2.77%,1.98%and1.78%,respectively,lowerthanASTMstandardorourernmentstandard.Inthetestsofsystemicinjectioninthemouse,thereisnomousedeadandnosignificantabnormalreaction.PrimaryskinirritationtestsinrabbitsalsoindicatedthatthevalvematerialfittheASTMstandards.Directcontactcellculturetest.Inpositivecontrolgroup,therearemanyfragmentsandadecreaseinthenumberoftheL-929cells,whichindicatesseverecellnecrosis.Innegativecontrol,thegrowthofthecellisnormal.InECgroupandEC+Trgroup,therearenoapparentchangesofcellnecrosis,however,inGAgroup,thenumberofthecellshasdecreased,butnotsevereaspositivecontrolgroup.MTTcytotoxicitytestsalsoindicatedthatECgroupandEC+TrgrouphadlowercytotoxicitythanGAgroup,andalsoconfirmedthatGAhasthemostseverecytotoxicityinthethreechemicals. patibilityresearch.EpoxychloropropaneandTritonX-100chemicaltreatmentcanimprovethephysicalandchemicalpropertiesofthebioprosthesis.Shrinkagetemperature:EC+Trgroup(89.78±1.33℃)ishigherthanfreshvalvegroup(70.2±0.5℃),P<0.01andalsohigherthanGAgroup(87.06±1.98℃),P<0.05.Degreeoftissuewetness(%):EC+Trgroup(89.78±1.33)ishigherthanGAgroup(87.06±1.98),P<0.05.Physicalpropertyresearch.EpoxychloropropaneandTritonX-100chemicaltreatmentcanimprovethe umoftensilestrength:EC+Trgroup(273.4±142.56g/mm2)ishigherthanfreshvalvegroup(504.7±23.46g/mm2),P<0.01,andalsohigherthanGAgroup(988.7±48.65g/mm2),P<0.01.Inhemolysistests,thehemolysisindexesoftheporcinevalvestreatedby,epoxychloropropane,orepoxychloropropaneandTritonX-100arealllowerthanASTMstandardsandnationalstandards.ThematerialtreatedbyepoxychloropropaneandTritonX-100hasthelowesthemolysisindex.Inthetestsofsystemicinjectioninthemouse,thereisnomousedeadandnoabnormalreactionofallgroups.PrimaryskinirritationtestsinrabbitsalsoindicatedthattheprosthesistreatedbyepoxychloropropaneandTritonX-100haslowesttoxicity.DirectcontactcellculturetestandMTTcytotoxicitytestsindicatedthatthismaterialtreatedbyepoxychloropropaneandTritonX-100hasnoobviouscytotoxicity,andobviouslybetterthanthevalveonlytreatedbyThematerialtreatedbyepoxychloropropaneandTritonX-100canmaintaingoodshrinkagetemperature,degreeoftissuewetnessandtheumoftensilestrength,hasgoodphysicalproperties.ThenewtypestentlessbioprosthesiswhichtreatedbyepoxychloropropaneandTritonX-100isaverygoodbiomaterialforvivotransplantation.Thisstudyprovidedaimportantreferenceforthestentlessbioprosthesisclinicaluse.Keyword:heartvalvebioprosthesis;stentless;anticalcification;cytotoxicity;hemolysis;epoxychloropropane;TritonX-100前風(fēng)濕性心臟?。≧heumaticHeartDisease,RHD）是我國(guó)最常見(jiàn)的心血管系統(tǒng)疾病之一，心臟瓣膜置換已成為主要治療。但目前無(wú)論機(jī)械生物心臟瓣膜（bioprostheticHeartValve,BHV）由于其保持了自然血流動(dòng)力學(xué)以及不需抗凝等優(yōu)點(diǎn)，使其臨床應(yīng)用和研究受到人們的關(guān)注。1962年Ross首先應(yīng)用新鮮的同種主動(dòng)脈瓣（allogeneticBioprosthesisAorticValve）進(jìn)行主動(dòng)脈瓣置換并取得成功，從而開(kāi)創(chuàng)了1968Carpentier首先提出用戊二醛（glutaraldehyde）處理生物瓣的新方法，使生物瓣的機(jī)械力學(xué)性能和得到了明顯的提高。1976年開(kāi)始1530－40％，我國(guó)80年代的使用率曾高達(dá)70％。但是生物瓣膜衰壞而引起的耐久性問(wèn)題TritonX-100CarpentierATritonX-100本實(shí)驗(yàn)的目的是對(duì)本單位研制的新型抗鈣化無(wú)支架生物瓣按照美國(guó)材料試驗(yàn)（ASTM）的醫(yī)用裝置及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生物毒性、生物2小時(shí)以內(nèi)，依次經(jīng)L-1TritonX-1008天，然3mL.L-1戊二醛溶液保存。⑵分組GAEC組 戊二醛+環(huán)氧氯丙烷處理的瓣EC+Tr組:戊二醛+環(huán)氧氯丙烷+TritonX-100處理的瓣膜陽(yáng)性對(duì)照材料：4.5mL.L-1苯酚水溶液⑴Hanks液：NaCl8.0g,KCl0.4g,CaCl20.14g,MgSO4·7H2O0.2g, 0.06g,KH2PO40.06g,NaHCO30.35g,葡萄糖1.0g,酚紅0.02g,加三蒸水至1000ml,高壓，-20℃保存0.06g,NaHCO30.35g,酚紅0.02g,加三蒸水至1000ml,高壓，Na2HPO4·12H2O11.9g,NaH2PO4·2H2O5.2g加入三蒸水至1000ml，高壓，-20℃保存。蒸餾水稀釋至1000ml。⑶水浴箱（蘇州儀器廠，中國(guó)，每個(gè)浸提容器中加入20ml的浸提介質(zhì)生理鹽水，用光電分析天平分別稱取4克的各組瓣膜樣品，每組4例，3例加入瓣膜材料，1例作空白對(duì)照。50℃下在烘箱內(nèi)持續(xù)72小時(shí)，去掉熱源，冷卻容器，但不能低于22℃，冷卻后，強(qiáng)有力地?fù)u動(dòng)容器30秒，然后把浸提液倒入過(guò)的干燥容器，24小時(shí)內(nèi)備用。用分光光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)為540nm處的吸光度值①。入對(duì)照生理鹽水和陽(yáng)性對(duì)照4.5mL.L-1苯酚水溶液，37℃下在標(biāo)準(zhǔn)血液混合器中振動(dòng)1h，離心15min(100-200轉(zhuǎn))，血漿成份再離心5min(700-800轉(zhuǎn))，測(cè)懸浮液的540nm處吸光度值③。50只巴比斯小鼠，雌雄不限，隨機(jī)分為5AECE+Tr組、陽(yáng)性對(duì)照組、對(duì)照組，注射前每個(gè)小鼠稱重、記錄并標(biāo)記，浸提液強(qiáng)烈搖勻，然后將各組材料浸提液以50mL/kg，小鼠尾靜脈注射，以生以4.5mL.1液照間隔721反 描 機(jī)能減退、腹瀉，體重下降15－17克之間。 呼吸等癥狀，體重迅速下降，低于15克。 每種材料5只兔子，脊柱一側(cè)10個(gè)部位注射0.2mL樣品浸提液或陽(yáng)4.5mLL-150.2mL生理鹽水作對(duì)照，在間隔72小時(shí)內(nèi)觀察動(dòng)物有無(wú)紅斑，水腫及壞死。2012343水腫癥 分級(jí)沒(méi)有水 EC+Tr1.78%，GA2.77%，EC組溶血指數(shù)1.98%，均低于《ASTM醫(yī)用裝置標(biāo)準(zhǔn)》及的5%,EC組、EC+Tr組比GA組吸光度明顯減低，P值<0.05。GAEC EC+Tr0.0394±0.8480.827 吸光吸光0GA EC GA+EC 血 全 陽(yáng)性對(duì) 對(duì) 圖 72小時(shí)內(nèi)40只小鼠無(wú)論GA組、EC組、EC+Tr組以及對(duì)照組無(wú)一例，無(wú)不良反應(yīng)，符合標(biāo)準(zhǔn)。而陽(yáng)性對(duì)照組7只小鼠出現(xiàn)明顯體重迅速下降，低于15克。ECEG+Tr組瓣膜材料浸提液的兔皮內(nèi)注射評(píng)價(jià)試驗(yàn)紅斑均限于無(wú)或輕微紅斑，而GA組則分別有4例明顯或中度紅斑，經(jīng)等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)，ECEG+TrGA組生物毒性明現(xiàn)2例輕度紅斑，均符合試驗(yàn)要求。4兔皮內(nèi)注射評(píng)價(jià)試驗(yàn)紅斑結(jié)果（例GAEG+Tr組 34000400000340004000000012340 2ECEG+Tr組瓣膜材料浸提液的兔皮內(nèi)注射毒性度水腫，經(jīng)等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)，ECEG+TrGA組生物毒9例重度水腫，27例中度水腫，4例輕度水腫；對(duì)照僅出現(xiàn)2例很輕的水腫，均符合試驗(yàn)要求。5兔皮內(nèi)注射評(píng)價(jià)試驗(yàn)水腫結(jié)果（例GAEG+Tr組對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照37000400009GA組相比aP值0012340GA EC 陽(yáng)性對(duì) 圖 兔皮內(nèi)注射評(píng)價(jià)試驗(yàn)水腫結(jié)食品藥品管理局（FDA）把醫(yī)用裝置分為三類理．人工心臟瓣膜作為長(zhǎng)期植入的裝置，屬于第Ⅲ類，這類材料要制定了對(duì)醫(yī)用裝置安全性評(píng)價(jià)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。心臟瓣膜植入后與ASTM標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)經(jīng)抗鈣化處理的豬主動(dòng)脈機(jī)械破壞有關(guān)，也與瓣膜材料擴(kuò)散于血液中的物質(zhì)對(duì)紅細(xì)胞的化學(xué)破壞有關(guān)，ASTM標(biāo)準(zhǔn)提供了一種的模擬體內(nèi)條件的實(shí)驗(yàn)方法，即動(dòng)態(tài)ASTM標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。原聯(lián)膠原氨基端，增加機(jī)械強(qiáng)度，以及在瓣膜的保存過(guò)程中保持無(wú)菌等方面具有極其重要的作用，因此，仍然用戊二醛首先處理了（0.3%環(huán)氧氯丙烷、TritonX-100以不同的機(jī)制，對(duì)生物瓣膜進(jìn)行抗鈣化處理效丙烷、TritonX-100聯(lián)合處理的無(wú)支架瓣膜符合該標(biāo)準(zhǔn)要求的生物毒性標(biāo)準(zhǔn)，而且，環(huán)氧氯丙烷、TritonX-100能明顯減輕戊二醛的生物毒性，為2小時(shí)以內(nèi)，依次經(jīng)L-1TritonX-1008天，然3mL.L-1戊二醛溶液保存。⑵分組GAEC組:戊二醛+陽(yáng)性對(duì)照：乳膠橡膠和0.45%苯酚水溶液L-929TritonX-100：Sigma⑷10％小牛：保泰克公司，中LMTT：⑴Hanks液：NaCl8.0g,KCl0.4g,CaCl20.14g,MgSO4·7H2O0.2g,Na2HPO4·H2O0.06g,KH2PO40.06g,NaHCO30.35g,1.0g,酚紅0.02g,加三蒸水至1000ml,高壓，-20℃保存0.06g,NaHCO30.35g,酚紅0.02g,加三蒸水至1000ml,高壓：Na2HPO4·12H2O11.9g,NaH2PO4·2H2O5.2g加入三蒸水至1000ml。PBSNaCl8.0g,KCl0.2g,KH2PO40.02g,Na2HPO4·12H2O⑴孵箱：nuaire公司MPS60AEICA公司，⑷酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（ELISA儀：華東電子，中⑴樣品：把經(jīng)抗鈣化處理的瓣膜用模具刀切割成8×15mm2的平滑⑵含10％小牛的最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)小鼠L929成纖維細(xì)胞株，在150cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細(xì)胞融合形成單層，吸出0.5mlnk’5ml1％胰蛋白酶孵育5－10分鐘，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，1300轉(zhuǎn)下離6分鐘，拋掉上清液，用10ml新鮮培養(yǎng)基再次懸浮混合細(xì)胞，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入2ml培養(yǎng)基和細(xì)胞懸液5－7滴，孵育3－5天直至近似融合⑶接觸培養(yǎng)：顯微鏡檢查細(xì)胞培養(yǎng)，舍棄任何融合不好或已顯示有顆四唑鹽（MTT）比色試⑴接種細(xì)胞：用含10％小牛的MEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103－104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)液中孔加材料浸提液或生理鹽水對(duì)照液體5ul，每孔總體積200ul。37℃、5%CO2150ulDMSO，10以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。1－2）死出現(xiàn)。（3－4）死、溶解，細(xì)胞碎片增加。（5－6）良好，數(shù)量無(wú)減少，無(wú)畸形、壞死出現(xiàn)。（7－8）四唑鹽（MTT）比色試驗(yàn)結(jié)1MTT（ODxGAECEC+TrEC+Tr值值0 8圖1MTT法體外細(xì)胞培養(yǎng)材料浸提液的毒性試表 MTT法體外細(xì)胞培養(yǎng)材料處理液的毒性試驗(yàn)結(jié)果（OD值,x0.3‰GA2‰EC1.2‰Tr0.3‰GA1.2‰TrODOD0 Earle1948年分離出來(lái)的。具有繁殖迅速、傳代容易、體外培養(yǎng)條件低和易保存等優(yōu)點(diǎn)，1982年標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)將該細(xì)胞為細(xì)胞毒為，瓊脂覆蓋具有試驗(yàn)周期短、48小時(shí)可觀察結(jié)果，操作簡(jiǎn)單，可同時(shí)ASTM標(biāo)準(zhǔn)，但即使是低濃度的戊二醛，長(zhǎng)時(shí)間處理的生物生物心臟瓣膜植入后的耐久性問(wèn)題迄今尚未解決，嚴(yán)重阻礙生能防止生物材料鈣化是生物心臟瓣膜研究的新思路。內(nèi)皮細(xì)胞具有加速血栓素滅活，前列環(huán)素，參與纖維蛋白溶解等重要功能。要使韓波等戊二醛與環(huán)氧交聯(lián)處理的牛心包材料和浸出液對(duì)培養(yǎng)L-929細(xì)胞無(wú)影響，材料的直接細(xì)胞脈徹底沖洗后每克24h仍13.8ppm戊二醛直至一個(gè)月。極微量的戊MTT比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活情況的新方法，主要原理是活細(xì)胞中的線粒體脫氫酶將MTT分子還原，產(chǎn)生紫色結(jié)晶物。所表達(dá)的信息類似于活細(xì)胞計(jì)數(shù)和同位素?fù)饺氲确椒āＳ煤嚇咏n液的培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后加入MTT，用二甲基亞砜溶解紫色結(jié)晶體，經(jīng)比色測(cè)定吸收值（OD，反映材料的浸漬液對(duì)細(xì)胞數(shù)量及活性的影響。此法與細(xì)胞增殖度不同之處是選用了酶的活性作為觀察指標(biāo)，因此其敏感性較以細(xì)胞計(jì)數(shù)作為觀察指標(biāo)之增殖法高。此法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、迅T10TT40riton0性極小。豬主動(dòng)脈瓣的方法ASTM標(biāo)準(zhǔn)，且降低了戊二醛的細(xì)胞毒性，有第三部 瓣膜材料的組織穩(wěn)定性、力學(xué)性能實(shí)驗(yàn)研1.TritonX-100：SigmaInstron1122：Instron.L-1TritonX-100磷酸緩沖液處理8天，然后3mL.L-1戊二醛溶液保存⑵分 GA組：?jiǎn)渭兾於┨幚淼陌闑C組 Tr組：戊二醛＋TritonX-100處理的瓣EC+Tr組 小燒杯于105℃烤箱內(nèi)恒重。各取8片，分別用濾紙吸干水份后放入燒杯稱重，得每片瓣葉濕重；105℃下2小時(shí)后再次恒重后稱量得瓣葉干重；新鮮瓣膜、GA組、EC組、EC+Tr組瓣膜各取8片，采的熱皺縮溫度測(cè)定儀，以蒸餾水為介質(zhì)，溫度每分鐘上升2℃，以指針開(kāi)始將新鮮瓣膜、GA組、EC組、EC+Tr組的豬主動(dòng)脈瓣按如下模式圖⑴瓣膜含水量（：新鮮瓣膜經(jīng)戊二醛處理后組織的含水量下降(<0.01)，再TritonX-100或環(huán)氧氯丙烷和TritonX-100處理后，含水量增加，即Tr組、EC+Tr組和EC組或GA組相比，瓣膜含水量增加(P<0.05)，和新鮮瓣膜組比組織含水量無(wú)明顯差異(P﹥0.05)。1瓣膜含水量12345678新鮮GAECTrEC+Tr熱皺熱皺縮溫度新鮮瓣 GA EC Tr EC+Tr 圖1瓣膜材料熱皺縮溫度（℃）<0.01)，TritonX-100皺縮溫度又有所增加，即GA組、Tr組、EC組以及EC+Tr組和新鮮瓣膜組相比，熱皺縮溫度明顯升高(P<0.01)；EC組、EC+TrGA組212345678均值新鮮 GA EC Tr EC+Tr 含水量含水量新鮮 GA EC Tr EC+Tr ⑴厚度：GA組、EC組、Tr組、EC+Tr（p>0.05（p<0.01），EC組、EC+Tr組比GA組瓣膜斷裂強(qiáng)度明顯增強(qiáng)組相比，亦無(wú)顯著差異(P﹥0.05)3（mm）和斷裂強(qiáng)度（g/mm2）測(cè)定(n=6，xGAECTrEC+Tr度斷裂強(qiáng)度（g/mm斷裂強(qiáng)度（g/mm0新鮮豬 GA EC Tr EC+Tr 圖 熱皺縮溫度(shrinkagetemperature（EC+Tr組）,以及環(huán)氧氯丙烷處理的瓣膜（EC組）的熱皺縮溫度和單純戊℃vs67.9℃,p>0.05TritonX-100顯著性差異，TrintonX-100TrintonX-100、環(huán)氧氯丙烷和戊二醛聯(lián)合處理的豬主動(dòng)脈瓣其含水量有所增加，可能是Trinton處理后仍保持較好的抗張強(qiáng)度,有利于增加瓣膜的和保持良好的血部位所致的機(jī)械性磨損使膠原纖維露或，可能是瓣膜鈣化的不斷受到交變、彎曲、變形的應(yīng)力作用而形成瓣膜組織的疏松、、瓣葉失功有關(guān)：①瓣膜支架頂部巨大的張力；②支架下的擠壓力；③瓣架外組織的磨擦力；④瓣葉在開(kāi)放時(shí)中的彎曲應(yīng)力（BendingStressThubriker（MembraneStress）與彎曲應(yīng)力的加和在形，常導(dǎo)致。因此目前無(wú)支架（stentless）的生物瓣的應(yīng)用正引起重 TritonX-100聯(lián)合處理組小TritonX-100聯(lián)合處理的新型無(wú)支架生物瓣材料符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，明顯優(yōu)于MTT法細(xì)胞毒性試驗(yàn)應(yīng)用環(huán)氧氯丙烷和TritonX-100聯(lián)合處理的新型無(wú)支架生物瓣材料毒性明顯小于戊二醛對(duì)照TritonX-100聯(lián)合處理組的無(wú)支架生物瓣材料能保TritonX-100聯(lián)合處理的無(wú)支架生物瓣是一種Jorge-Herrero,Femandez,Gutierrez,etal.Studyofthecalcificationofbovinepericardium.Biomaterials,1991;12(9):683Granbenwoger,Grimm,Eybl,etal.Newaspectsofthedegenerationofbioprostheticheartvalvesafterlong-termimplantation.JThoracCardiovascSurg.1992;104(1):14San-Martin,Garcia-Paez,Millan,etal.Behaviourofthebovinepericardiumusedincardiacbioprostheseswhensubjectedtoarealfatigueassay.Biomaterials,1993;14(1):76Levy,Schoen,Anderson,etal.Cardiovascularimplantcalcification:asurveyandupdate.Biomaterials,1991;12(10):707Golomb,Ezra.alentbindingofprotaminebyglutaraldehydetobioprosthetictissue:characterizationandanticalcificationeffect.BiomatArtCells&lmmobBiotech,1992;20(1):31Song,Vesely,Boughner.Effectsofdynamicfixationonshearbehaviourofporcinexenograftvalves.Biomaterials,19910;11(4);191Roe,Milthorpe,Schindhelm,etal.Collagencrosslinkingandresorption:effectofglutaraldehydeconcentration.ArtificialOrgans,1990;14(6):443Dahm,Prufer,Dohmen,etal.Pathophysiologyofearlyfailureofautologousaorticheartvalves(ATCV).Thorac-Cardiovasc-Surg.1998Dec;46(6):344-7Dahm,Prufer,Krummenauer,etal.Invitroeffectsofanticalcificationtreatmentonthecalciumuptakeofbioprostheticmaterials.J-Heart-Valve-Dis.1998May;7(3):336-9Flameng,Ozaki,Yperman,etal.Calcificationcharacteristicsofporcinestentedvalvesinajuvenilesheepmodel.Ann-Thorac-Surg.2001May;7(5Suppl):Legarra,Llorens,Catalan,etal.Eighteen-yearfollowupafterHancockIIbioprosthesisinsertion.J-Heart-Valve-Dis.1999Jan;8(1):16-24DavidArmstrong,Sun.TheHancockIIbioprosthesisat12Ann-Thorac-Surg.1998Dec;66(6Suppl):S95-Carpentier,Dubost,Lane.Continuingimprovementsinvalvularbioprostheses.JThoracCardiovascSurg,1982,83:27金磊，朱，宋來(lái)鳳等。羥基鉻減緩生物瓣鈣化的實(shí)驗(yàn)研究。中國(guó)胸心Duarte,MacDonald,Cooper,etal.Invivohemodynamic,histologic,andantimineralizationcharacteristicsoftheMosaicbioprosthesis.Ann-Thorac-Surg.2001Jan;71(1):92-9Gabbay.PossiblemechanismofcalcificationoftheBioCorstentlessmitralvalvetreatedwiththeNo-Reactformula.J-Thorac-Cardiovasc-Surg.1999Oct;118(4):771-3Herijgers,Ozaki,Verbeken,etal.Calcificationcharacteristicsofporcinestentlessvalvesinjuvenilesheep.Eur-J-Cardiothorac-Surg.1999Feb;15(2):134-42Vyavahare,Hirsch,Lerner.Preventionofcalcificationofglutaraldehyde-crosslinkedporcineaorticcuspsbyethanolpreincubation:mechanisticstudiesofproteinstructureWalther;Falk,Diegeler.Effectivenessofdifferentanticalcificationtreatmentsforstentlessaorticbioprostheses.Thorac-Cardiovasc-Surg.1999Feb;47(1):23-5Grabenwoger,Sider,Fitzal,etal.lmpactofglutaraldehydeoncalcificationofpericardialbioprostheticheartvalvematerial.AnnThoracSurg,1996;62(3):772Bengtsson,Phillips,Haegerstarand,etal.Invitroendotheliazationofphotooxidativelystabilizedxenogeneicpericardium.AnnThoracSurg,1995;（5，30-David,Feindel,Bos,etal.Aorticvalvereplacementwithastentlessporcineaorticvalve.JThor