生物血清學反應

第九章血清學反應

第一節(jié)概述2022/11/242一血清學反應的概念及一般特點

抗原及相應抗體在體內或體外均能發(fā)生特異性結合，在體外結合能發(fā)生可見免疫反應。由于抗體主要存在于血清中，故稱為血清學反應。血清學反應根據(jù)抗原性質、反應條件、參與反應物質，則表現(xiàn)出反應有多種多樣。其反應的一般特點是：

2022/11/243（一）特異性和交叉性血清學反應具有高度特異性。由于抗原決定簇的組成、結構以及排列不同，所誘導產生的抗體也不同。抗原只能與相應抗體結合，而不能與其他抗體相結合。生物體的組成是復雜的，包含有多種抗原成分，在進化過程中形成不同的種類，有各不相同的特異性抗原，在親緣種系中往往含有部分相同的抗原成分，能引起交叉反應。2022/11/244

（二）結合的可逆性抗原抗體結合是分子表面結合，這一結合受理化因素的影響，當溫度超過60?C或pH降至3以下時，則抗原抗體復合物又重新離群。離群后的抗原、抗體，其理化性質、免疫活性保留。利用抗原抗體結合的可逆性，可進行免疫吸附層析，純化抗原或抗體。

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（三）最適比與帶現(xiàn)象抗原與抗體結合，其比例適當時才可出現(xiàn)可見反應。當抗原抗體比例適當時，兩者結合后，尚有未飽和的結合點，可以繼續(xù)與游離的抗體、抗原或與抗原抗體的結合物的未飽和點相聯(lián)結，逐漸形成愈來愈大的復合物，出現(xiàn)了肉眼可見反應。比例最適合，出現(xiàn)反應最快，反應產物愈多。如果抗原或抗體過多，抗體和抗原結合點的聚合一開始時即達到飽和，形成小的復合物則不能繼續(xù)與相鄰抗原、抗體結合，不出現(xiàn)可見反應，謂之區(qū)帶現(xiàn)象或帶現(xiàn)象。為了避免血清學反應的帶現(xiàn)象，需要將抗原或抗體作適當?shù)南♂尅?022/11/246

2022/11/247比例不適合—不能完成第二步反應—帶現(xiàn)象2022/11/248

（四）反應的階段性

抗原與抗體進行結合，可分為兩個階段：第一階段為抗原與抗體的特異性結合階段，反應快，幾秒鐘至幾分鐘即完成，但無可見反應；第二階段為抗原與抗體的反應可見階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補體結合等，反應進行較慢，需幾分鐘或更久。第二階段受電解質、溫度、pH值等影響。兩個階段在反應進行中無嚴格界限。2022/11/249

（五）影響反應的因素1.電解質血清學反應須在適當濃度的電解質參與下，才出現(xiàn)可見反應。在凝集、沉淀反應操作時，一般用生理鹽水或8%—10%高滲鹽水作稀釋，才出現(xiàn)較強反應。2022/11/24102.溫度

溫度升高，可增加抗原與抗體分子運動而碰撞接觸，加速反應的出現(xiàn)，故通常將抗原抗體混合后，放置37?C溫箱或水浴箱中，保持一定時間，促進反應。溫度高，加速反應；溫度低，反應時間延長，但反應結合充分，故在補體結合反應、免疫吸附實驗中，采用的低溫中放置過夜。3.酸堿度

血清學反應通常用pH6～8，過酸或過堿都可使復合物離群，pH值在等電點時，可引起非特異凝集。2022/11/2411二血清學反應的類型和參與成分

(見課本表9-1)

三血清學反應的應用方式和目的

抗原抗體反應是特異性的，在應用時必須有一個是已知的，通過反應來鑒定另一個未知的。例如鑒定某一病原微生物時，多用已知抗體。診斷傳染病時，對慢性病可用已知的抗原檢測未知的特異性抗體；診斷急性病則用已知的抗體檢測未知的抗原（病原），如炭疽病等。

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（一）抗原與抗體的快速檢測

在診斷傳染病、寄生蟲病、變態(tài)反應、腫瘤、自身免疫疾病時，均已廣泛應用血清學方法檢查抗體或抗原（細菌、病毒）的存在，作為診斷疾病的手段?，F(xiàn)已應用的間接血凝技術、對流電泳、標記抗體技術，均能快速、簡便的確診抗原或抗體。2022/11/2413

（二）生物活性物質的超微定量應用酶聯(lián)免疫吸附實驗、放射免疫等技術，抗原抗體檢測的敏感度均大為提高，已達到能精確測出Pg的水平，其敏感度已大大超過了常規(guī)的化學分析。此類技術已應用于測定動物體內的激素、維生素、藥物及其他病理過程中的微量產物。（三）抗原或抗體在細胞與亞細胞水平的定位用熒光抗體、酶標抗體技術，可以檢測病毒或細菌在動物各種組織細胞中的分布。應用免疫酶組化法及鐵蛋白標記技術進行免疫電鏡觀察，可以測定病毒在亞細胞水平的定位，也可測定淋巴細胞表面免疫球蛋白及抗體的產生情況。據(jù)此可分析傳染病發(fā)生的機制及對免疫機理的探討。

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（四）微生物的鑒定與分析應用交叉凝集實驗、凝集吸收實驗、沉淀實驗等血清學實驗，進行微生物的鑒定及區(qū)別微生物的血清型，從而確定微生物的類型及其親緣關系。還可應用瓊脂擴散實驗、免疫電泳等技術，對微生物的抗原組分進行分析。（五）血型鑒定用細胞直接凝集實驗、血凝抑制實驗、溶血實驗、Coomb實驗等技術，可作血型鑒定、親子關系的確定、新生兒和出生幼畜溶血病的診斷。2022/11/2415第二節(jié)沉淀試驗

可溶性抗原與相應抗體結合，在適量電解質存在下，形成肉眼可見的絮狀白色沉淀，稱之為沉淀試驗?？扇苄钥乖?免疫血清出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象

(病毒等)（抗體）比例適合沉淀原沉淀素比例不適合無沉淀現(xiàn)象容易過多前帶現(xiàn)象

0.85%NaCl2022/11/2416

一液相沉淀試驗

1．環(huán)狀沉淀試驗原理：小試管內，下層沉淀素與上層沉淀原在液界面應形成白色沉淀環(huán)。用途：檢測皮毛中的炭疽桿菌抗原（Ascoli試驗）

2．絮狀沉淀試驗抗原與抗體在試管內混合，在電解質的存在下抗原抗體復合物可形成絮狀凝聚物。此法多用于毒素和抗毒素測定。2022/11/2417二瓊脂擴散試驗

瓊脂是一種含有硫酸基的多糖，加熱溶解于水，冷卻后凝固成凝膠，瓊脂凝膠是一種多孔結構，其孔徑大小與瓊脂含量有關，1%瓊脂凝膠孔徑為85nm，能使許多可溶性抗原與抗體在凝膠中擴散。當抗原與抗體在凝膠中的一定位置上相遇時，則兩者結合形成沉淀線。沉淀線的位置與抗原、抗體顆粒的大小、濃度，沉淀線的數(shù)目和所含抗原組分有關。瓊脂擴散可分為單擴散（抗原或抗體中一種成分擴散）和雙擴散。根據(jù)其擴散的方向可分為單向單擴、單向雙擴、雙向單擴、雙向雙擴，其中雙向雙擴應用最廣。2022/11/24181．單向單擴散

亦稱Oudin。將0.6%-1%瓊脂加熱熔化后，加入定量經預熱的稀釋抗血清，混合均勻后，加入小試管中，待凝固后加入0.5ml抗原于其上，直立，置于37?C中，2-3h后出現(xiàn)沉淀線。由于抗原的擴散，使沉淀線不斷向下推移，而最初形成的沉淀帶隨抗原的擴散而向下推移，最后穩(wěn)定。沉淀帶距抗原愈近，其濃度愈大，可作抗原濃度測定。2022/11/24192

．單向雙擴散亦稱Oakley。基本作法同上，但在抗原與抗體之間加一層不含抗體的鹽水瓊脂，抗原與抗體均向中間瓊脂擴散，形成沉淀帶。主要用于抗原成分的分析。

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．雙向單擴散亦稱輻射擴散。在平皿或玻板上進行。用2%緩沖瓊脂鹽水，加熱融化，待冷后加入經預熱的抗血清（用1：5-10倍稀釋），混合后倒入平皿或玻板上，厚2-3mm。凝固后在凝膠板上打孔，孔徑2-3mm，孔內滴加抗原液，放置濕盒中37?C下擴散。抗原在孔內向四周擴散，與凝膠中的抗體接觸，形成白色沉淀環(huán)，白環(huán)的大小隨抗原的濃度而增大。此法在獸醫(yī)臨床上用于蛋白質定量實驗。2022/11/2420

4．雙向瓊脂擴散（瓊擴）此法系采用1%瓊脂倒于平皿或玻片上，制成凝膠板，可按需要打孔。將抗原、抗體分別滴入孔內，放置濕盒中，在37?C濕箱中24-72h后觀察。在抗原與抗體孔間形成沉淀帶。每一種抗原成分出現(xiàn)一條沉淀帶。結果判斷：如兩個相鄰孔之間抗原相同，則沉淀帶融合；抗原則不同，則互相交叉；部分相同則部分融合，另外不同部分則交叉。特點：簡便、敏感性低、耗時、應用最廣用途：常用于細菌、病毒的鑒定，抗血清效價的測定，抗原組分的分析及傳染病的診斷等，如馬傳染性貧血病的診斷。2022/11/2421

三、免疫電泳

瓊脂擴散與電泳技術結合起來稱免疫電泳。由于抗原顆粒帶電荷不同，在同一電場中其泳動速度不同，故起遷移率不同，因而通過電泳可將抗原成分分開。停止電泳后加抗血清進行擴散，如有一隊抗原抗體出現(xiàn)一條沉淀線，因而大大加強了免疫擴散的分辨率及敏感性。此法可應用于抗原成分及含量成分的分析、免疫球蛋白純度的鑒定，以及傳染病的快速診斷等。

1．微量免疫電泳用pH8.6的巴比妥緩沖液（VB液）配成1%的瓊脂液，制成凝膠板。在凝膠板1/3處打孔2個，孔徑2-3mm，兩孔間距10-12mm?？變鹊渭涌乖糜陔娪静凵?，兩端用濾紙或紗布做橋，連接電泳液。電泳時，按凝膠板寬度測電流，電泳45min-2h。電泳完畢，滴加抗血清，進行擴散。抗原成分不同，泳動速度不同，與抗血清形成數(shù)條清晰的沉淀弧。本法用于血清成分分析及提取的Ig純度鑒定。2022/11/2422

正常人血清蛋白的免疫圖象2022/11/24232．對流免疫電泳試驗時在凝膠板上打孔，兩孔為一組，并排打孔兩組，然后加樣。抗原滴入負極端孔內，抗體滴入正極端孔內，進行電泳。泳動30-90min，觀察結果。在兩孔之間出現(xiàn)沉淀帶，為陽性反應。結果判斷：AgAb特點：反應時間短，敏感性提高用途：定性，已不多用（水貂阿留申病，以病原Ag檢測病貂血清中的抗體）2022/11/24243．火箭電泳將雙向單擴散與電泳技術結合起來，其沉淀線似火箭，故稱火箭電泳。本法將瓊脂融化、冷卻，在融化的瓊脂中加入一定量的已知抗血清，制成凝膠板。在其一端打一小列孔，分別在孔中加入待檢抗原或已知抗原，放置電泳槽中，加樣品端位于負極，用雙層濾紙連接瓊脂板的槽內緩沖液，接通電源，板端電壓4V/cm，電流3mA/cm，電泳2-10h。電泳后，抗原在有抗血清瓊脂板內向正極遷移，前端與抗體接觸，形成火箭狀況沉淀弧。在同一抗體濃度下形成峰的高低，與抗原濃度大小成正比。本法用于抗原量的測定（先用已知抗原濃度測定制成曲線）。2022/11/2425火箭電泳圖①②③為標本；④⑤⑥為標準抗原2022/11/2426

第三節(jié)凝集試驗

細菌、紅細胞等顆粒狀態(tài)的抗原與相應的抗體結合后，在電解質存在時相互凝集成絮片狀團塊，這種試驗稱為凝集試驗（Agglutiationtest）。參與反應的抗原叫凝集原；參與反應的抗體稱為凝集素，主要有IgG、IgM。凝集實驗有直接凝集試驗和間接凝集試驗兩種。2022/11/2427基本原理：生理鹽水顆粒性抗原+相應抗血清抗原顆粒凝集

(細菌、紅細胞)比例適合凝集原凝集素過多后帶現(xiàn)象（稀釋血清）一、直接凝集試驗顆粒性抗原與相應抗體在電解質的參與下，直接結合，凝集成團的現(xiàn)象，稱直接凝集試驗。按其操作方法可分為玻片發(fā)和試管法。2022/11/24281．玻片凝集試驗將已知的抗血清1-2滴，滴于清潔玻片上，取待檢菌液（抗原）加于其上，混合均勻，數(shù)分鐘后可出現(xiàn)顆粒狀或絮片狀凝集，謂之陽性反應。。

特點：簡單、快速

用途：定性，細菌鑒定、血型鑒定。如用已知的沙門氏菌血清，鑒定沙門氏桿菌的抗原組分以定型。此法也用于畜禽傳染病診斷，如用已知的雞白痢有色平板抗原，檢查雞血清中有無相應抗體，進行雞白痢檢疫2022/11/24292．試管凝集試驗

是一種定性與定量相結合的方法。試驗時用一列試管，將待檢血清用0.5%石炭酸生理鹽水作10倍遞進稀釋，每管維持量為0.5ml，一管不加血清作對照。每管中加入一定濃度的抗原0.5ml，混合均勻，在37?C或室溫下靜置數(shù)小時，觀察液體的亮度及沉淀物，視不同的凝集程度記錄為++++（100%菌體凝集），+++（75%凝集），+（25%凝集）。凡能與一定量抗原發(fā)生50%凝集（++）的血清最高稀釋度，為血清的凝集價或效價（滴度）。在試驗時，必須建立陰性、陽性血清對照管。

特點：準確、耗時

用途：診斷布氏桿菌病，測定抗體的凝集價(定量)2022/11/2430

二、間接凝集試驗

基本原理：可溶性抗原+惰性載體（聚苯乙烯乳膠微粒、炭粒、綿羊紅細胞等）抗原致敏載體

抗原致敏載體+相應免疫血清(抗體)電解質被動載體凝集(間接乳膠凝集、間接炭素凝集、間接紅細胞凝集等)2022/11/2431特點：敏感(在微量反應板中進行試驗)、快速。用途：用已知抗原致敏的載體可檢測血清中的特異抗體及其效價。若用已知免疫血清（Ab）致敏的紅細胞，則可檢測病毒等可溶性抗原——稱為反向間接血凝試驗。2022/11/2432

2022/11/2433（正向）間接凝集反應原理示意圖2022/11/2434（反向）間接凝集反應原理示意圖2022/11/2435間接凝集抑制反應原理示意圖

A：標本中含抗原B：標本中不含抗原2022/11/2436三、抗球蛋白試驗

抗球蛋白試驗系Coombs等首先創(chuàng)立，故又稱Coombs試驗。試驗主要用于測定單價抗體（不完全抗體）。在正常凝集試驗時，應用本法可提高其敏感度。單價抗體與顆?？乖嘟Y合，不出現(xiàn)可見的凝集反應，但該抗原表面決定簇已被單價抗體所封閉，不能與相應的完全抗體相結合而發(fā)生凝集現(xiàn)象，故謂之阻斷試驗。阻斷試驗特異性不高，故很少使用，現(xiàn)多用抗球蛋白試驗。由于抗體本身就是一種良好的抗原，用該動物的正常免疫球蛋白免疫異種動物，可獲得抗球蛋白的抗體。抗球蛋白的抗體與已吸附單價抗體的顆粒抗原相結合，即可發(fā)生凝集，其實質也是一種間接凝集。本法用于人Rh血型測定及布氏桿菌單價抗體的檢測。2022/11/2437第四節(jié)與補體有關的試驗

一、補體的性質補體是存在于正常動物血清中的一組蛋白質。補體沒有特異性，它能與任何抗原抗體復合物相結合，但不能與游離的抗原或抗體相結合。補體與抗原抗體的復合物結合后，可出現(xiàn)溶血反應、溶菌反應、補體結合反應、凝集反應、免疫黏膜試驗等。由于補體具有這一特性，故常用其來檢驗抗原或抗體是否發(fā)生特異性結合，特異性抗原或抗體是否存在。2022/11/2438

二、溶解試驗1.溶血試驗紅細胞與相應的抗體（溶血素）相結合后，在補體的參與下，可發(fā)生溶血反應（直接溶血反應），以作補體結合反應的指示系統(tǒng)。吸附抗原的紅細胞與抗體結合后，在補體存在下可以引起溶血反應，這種反應稱為間接溶血反應。間接溶血反應只能用新鮮紅細胞，而新鮮紅細胞不易保存，限制了本法的應用。

2022/11/24392.溶菌試驗

某些細菌（如霍亂弧菌）與抗體結合后，如有補體存在，可發(fā)生細菌溶解或被殺死，這種反應稱為溶菌反應或殺菌反應。本試驗的測定可用比濁法。也可用菌落計數(shù)法；。本法敏感性高，但細菌抗原容易被溶解，且操作時間較長。2022/11/2440三．補體參與的試驗—補體結合試驗1．參與反應：抗原抗體反應系統(tǒng)、補體（豚鼠血清）、指示系統(tǒng)（綿羊紅細胞、溶血素）。2．反應原理：（如下圖所示）。3．特點：敏感性特異性高。正式試驗前要進行下列測定，操作較繁（溶血素效價、補體效價、抗原效價）。4．用途：用于牛肺疫、副結核、布氏桿菌病、錐蟲病、馬傳貧、鼻疽等的檢疫。2022/11/24412022/11/2442中和試驗（病毒、毒素中和試驗）原理：病毒與抗血清中抗體特異結合后失去感染易感動物、雞或雞胚、細胞的活性。例1

NDV9～11d雞胚24～48h雞胚死亡NDV+抗血清9～11d雞胚雞胚不死亡

第四節(jié)中和試驗2022/11/2443例2

口蹄疫病毒(FMDV)4～7d乳鼠乳鼠死亡FMDV+抗血清4～7d乳鼠乳鼠不死亡

用途：1.用已知血清鑒定病毒——診斷病毒病2.用已知病毒檢測血清抗體——診斷病毒感染，測定病毒免疫血清效價（中和價）。2022/11/2444第六節(jié)免疫標記技術

免疫標記技術即是將某一個特定的易于檢測的分子或原子，聯(lián)結在抗體或抗原上，利用抗體（或抗原）能與相應的抗原（或抗體）結合的特性，從而檢測抗原或抗體的存在及所在部位（定位）。免疫標記技術是近年來研究血清學反應的一項新技術。這項技術大大開拓了免疫學的應用范疇，使血清學反應進入了一個新的天地。它不僅可以用于抗原抗體的定性、定量，還可用于抗原抗體的定位。由于其反應的特異性敏感性高，不但在診斷疾病時廣為應用，亦可應用于生物領域其他方面。2022/11/24451.熒光標記抗體技術（免疫熒光技術）

免疫熒光技術是將熒光染料標記在抗體球蛋白分子上，制成熒光抗體。當熒光抗體與相應抗原結合時，就形成帶有熒光的抗原抗體復合物，在熒光顯微鏡下，可觀察到此復合物發(fā)出的熒光?？蓹z測標本中某種抗原的存在或抗原所在的部位（定位）。

原理：熒光素（F）+AbAbF(FITC）)AbF+AgAg-AbF紫外光Ag-AbF

用途：用AbF檢測抗原（定性、定位）

特點：敏感，需熒光顯微鏡2022/11/2446方法：直接法間接法

FFAgAg比較：檢測一種抗原標記一種動物的γ

就須標記特異球蛋白AbF，就能的一種AbF檢測多種抗原較特異較敏感

2022/11/24472.酶標記抗體技術（酶免疫測定技術）（1）間接法（2）雙抗體夾心法原理：用途：已知抗原、酶標已知血清抗體、酶抗體測血清抗體標抗體測抗原2022/11/24483.放射免疫測定法原理：Ag+AbRAg-AbR

或AgR+AbAgR-Ab

用液相閃爍儀測R放出的射線量特點：敏感性極高，需高級閃爍儀同位素對人有放射性危害用途：用于藥物、激素、酶、腫瘤抗原等測定2022/11/2449四、其他免疫標記技術（一）免疫電鏡技術將免疫學技術與電鏡技術結合起來，發(fā)展成一種血清學反應超微技術，應用于抗原或抗體的定位，達到亞細胞水平。（二）生物素-親和素標記技術生物素即維生素H，在動物體內廣泛存在，以蛋白、肝、腎等組織中的含量為最高。親和素又稱抗生物素，對生物素有較強的親和力，結合常數(shù)高。近年來，利用生物素與親和素結合，成為一種生物素-親和素系統(tǒng)。2022/11/2450（三）核酸探針