第二章微生物藥物生物合成與調(diào)控第一節(jié)(發(fā)酵工藝學(xué)夏煥章第三)3

學(xué)習(xí)目標(biāo)熟悉微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)和次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的控制。掌握微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成過程及其調(diào)節(jié)機(jī)制。了解微生物藥物的生物合成及其調(diào)節(jié)機(jī)制的指導(dǎo)意義。第一頁，共二十五頁。前言各種代謝反應(yīng)和代謝途徑錯(cuò)綜復(fù)雜：

代謝網(wǎng)絡(luò)（metabolicnetwork）

多代謝作用（pleometabolism）

代謝柵欄（metabolicgrid）生物合成既涉及初級(jí)代謝又涉及次級(jí)代謝微生物藥物（這里指微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物）的合成是在微生物體內(nèi)酶催化下將小分子物質(zhì)逐步合成分子量較大產(chǎn)物的生化反應(yīng)過程。第二頁，共二十五頁。生物合成過程中，嚴(yán)格地受到微生物細(xì)胞內(nèi)存在的代謝調(diào)節(jié)，以及外界環(huán)境條件的調(diào)節(jié)。人們利用已知或可能存在的生物合成途徑及其代謝調(diào)控理論，已成功地解決了微生物藥物生產(chǎn)過程中菌種產(chǎn)量、發(fā)酵工藝、產(chǎn)品質(zhì)量等關(guān)鍵問題。微生物藥物的生物合成及其調(diào)控理論在微生物藥物的生產(chǎn)中起著非常重要的指導(dǎo)作用。第三頁，共二十五頁。學(xué)習(xí)內(nèi)容第一節(jié)微生物代謝調(diào)節(jié)（3學(xué)時(shí)）第二節(jié)次級(jí)代謝與次級(jí)代謝產(chǎn)物（1學(xué)時(shí)）第三節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成（2學(xué)時(shí)）第四節(jié)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)節(jié)與控制（2學(xué)時(shí)）第四頁，共二十五頁。第一節(jié)微生物代謝調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)存在著嚴(yán)密、精確、靈敏的代謝調(diào)節(jié)體系。這種自我調(diào)節(jié)作用使細(xì)胞經(jīng)濟(jì)有效地利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與能量，合理地進(jìn)行各種代謝活動(dòng)，以適應(yīng)微生物自身的正常生長(zhǎng)繁殖和外界環(huán)境的變化，達(dá)到微生物代謝活動(dòng)和外界環(huán)境高度統(tǒng)一。微生物代謝調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，具有多系統(tǒng)、多層次特點(diǎn)，但主要通過控制酶來實(shí)現(xiàn)，即酶合成的調(diào)節(jié)（誘導(dǎo)和阻遏）和酶活性的調(diào)節(jié)（激活或抑制）。研究微生物代謝調(diào)節(jié)的實(shí)際意義在于打破微生物原有的代謝調(diào)控系統(tǒng)，過量積累目標(biāo)產(chǎn)物，提高生產(chǎn)效率。第五頁，共二十五頁。本節(jié)學(xué)習(xí)內(nèi)容一、代謝調(diào)節(jié)的部位二、酶活性調(diào)節(jié)三、酶合成調(diào)節(jié)四、代謝調(diào)控

第六頁，共二十五頁。四、代謝調(diào)控

掌握微生物代謝調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)方式及其調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，就可以人為地對(duì)微生物代謝過程、代謝途徑、代謝產(chǎn)物等方面進(jìn)行調(diào)節(jié)控制。如提供較多的底物、誘導(dǎo)物、前體物、降低終產(chǎn)物濃度或移走終產(chǎn)物、阻斷支路途徑來到達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物的過量合成。微生物代謝調(diào)節(jié)控制方法主要有以下4個(gè)方面。第七頁，共二十五頁。

產(chǎn)能代謝控制：能荷調(diào)節(jié)

細(xì)胞滲透性調(diào)控菌種遺傳特性改變發(fā)酵工藝條件的控制營(yíng)養(yǎng)缺陷型滲漏缺陷型解除反饋調(diào)節(jié)突變株解除分解代謝產(chǎn)物阻遏突變株組成型突變株各種抗性突變株增加有關(guān)基因數(shù)量的工程菌株控制培養(yǎng)基成分控制發(fā)酵條件添加前體添加誘導(dǎo)劑發(fā)酵與分離過程耦合第八頁，共二十五頁。

能荷（energycharge）即衡量細(xì)胞（或線粒體）能量狀態(tài)的參數(shù)。它

是產(chǎn)生或者利用ATP代謝途徑的主要調(diào)節(jié)因素。（一）產(chǎn)能代謝控制：能荷調(diào)節(jié)能荷=（[ATP]+0.5[ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]）

能荷調(diào)節(jié)也稱腺苷酸調(diào)節(jié)，系指細(xì)胞通過改變ATP、ADP、AMP三者

（它們所含能荷依次遞減）比例來調(diào)節(jié)其代謝活動(dòng)。

能荷數(shù)值在0-1之間：

全部為AMP時(shí)，能荷值為0；

全部為ATP時(shí)，能荷值為1；

全部為ADP時(shí)，能荷值為0.5。第九頁，共二十五頁。ATP合成的酶系統(tǒng)：磷酸果糖激酶（PFK）

異檸檬酸脫氫酶（ID）

檸檬酸合成酶等ATP消耗的酶系統(tǒng)：檸檬酸裂解酶

磷酸核糖焦磷酸合成酶等

能荷即可調(diào)節(jié)形成ATP的分解代謝酶類的活性，也可調(diào)節(jié)利用ATP的生物

合成酶類的活性。ID、PFK等分解酶類受高能荷的抑制；

丙酮酸羧化酶、乙酰CoA羧化酶、AK等高能荷下被活化。第十頁，共二十五頁。圖2-32受能荷調(diào)節(jié)的酶系反應(yīng)速度0.85曲線R代表ATP合成的酶系統(tǒng)能荷RU曲線U代表ATP消耗的酶系統(tǒng)1.0

能荷即可調(diào)節(jié)形成ATP的分解代謝酶類的活性，也可調(diào)節(jié)利用ATP的生物合成酶類的活性。

當(dāng)能荷在0.75以上時(shí)，ATP合成酶系受到抑制，合成ATP的酶系活性迅速下降，而消耗ATP的酶系活性急速上升。呈抑制與活化的中間狀態(tài)的能荷大約是0.85，此時(shí)兩種酶系到達(dá)平衡。第十一頁，共二十五頁。

將ATP視為糖分解代謝的終產(chǎn)物，當(dāng)ATP過量時(shí)對(duì)糖的分解代謝途徑具

有反饋抑制作用，而當(dāng)ATP分解為ADP和AMP時(shí)上述反饋抑制被解除。

巴斯德效應(yīng)（Pasteureffect）是能荷調(diào)節(jié)的一個(gè)好的實(shí)例。

巴斯德在研究酵母的酒精發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)，在通氧的情況下，由于進(jìn)行呼吸

作用，酒精產(chǎn)量大大下降，糖的消耗速度也減慢，這種有氧呼吸抑制發(fā)

酵的作用被后人稱之為巴斯德效應(yīng)。第十二頁，共二十五頁。

細(xì)胞滲透性調(diào)控可分為細(xì)胞膜調(diào)控與細(xì)胞壁調(diào)控兩類。（二）細(xì)胞滲透性調(diào)控

通過改變細(xì)胞滲透性，可使細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物迅速滲透到細(xì)胞

外，消除反饋控制，方便產(chǎn)物分離，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)量。

增加細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的通透性，對(duì)某些胞外酶的分泌也有一

定的作用，如在里氏木霉發(fā)酵過程中加入吐溫80（Tween80），可以提高纖維素酶的產(chǎn)量。第十三頁，共二十五頁。1.限制培養(yǎng)基中生物素濃度在1～5mg/L，這樣可以控制細(xì)胞

膜中脂質(zhì)的合成，從而控制代謝物產(chǎn)量。如谷氨酸發(fā)酵。提高細(xì)胞滲透性的幾種方法2.通過誘變育種的方法，篩選細(xì)胞透性突變株。

如生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型、油酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型、甘油營(yíng)養(yǎng)缺陷型等。3.添加表面活性劑或脂溶劑如棕櫚酸（C18）、十七烷酸

（C17）、硬脂酸（C16）、吐溫80等，將脂類從細(xì)胞壁中溶

解出來，使細(xì)胞壁疏松，通透性增加。第十四頁，共二十五頁。4.添加作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的物質(zhì)。如纈氨霉素和短桿菌肽（影響細(xì)胞膜）；

青霉素、頭孢菌素、D-環(huán)絲氨酸、磷霉素（影響細(xì)胞壁）。5.控制Mn2+、Zn2+的濃度，干擾細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的形成。曾獲得細(xì)胞膜透性改變的青霉素高產(chǎn)菌株，攝取無機(jī)硫酸鹽

的能力要比低產(chǎn)菌株增加2～3倍。舉例第十五頁，共二十五頁。

谷氨酸發(fā)酵加入青霉素：阻礙了細(xì)胞壁的完全合成，在細(xì)胞內(nèi)滲透壓比環(huán)境滲透壓高得多的情況下，沒有完全合成的細(xì)胞壁無法使細(xì)胞保持原來的體積，細(xì)胞膨脹伸長(zhǎng)，表面積增大，從而使膜脂質(zhì)雙分子層的分子密度下降，增加了膜對(duì)某些化學(xué)物質(zhì)的通透性。加入青霉素可促進(jìn)谷氨酸分泌胞外，降低胞內(nèi)谷氨酸濃度，

解除谷氨酸引起的反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致谷氨酸高產(chǎn)。舉例第十六頁，共二十五頁。通過誘變劑處理、細(xì)胞融合及基因操作技術(shù)使菌種遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，獲得各種突變株，從根本上打破微生物原有的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，積累目標(biāo)產(chǎn)物，為生產(chǎn)提供高產(chǎn)高質(zhì)量菌種。（三）菌種遺傳特性改變營(yíng)養(yǎng)缺陷型滲漏缺陷型解除反饋調(diào)節(jié)突變株解除分解代謝產(chǎn)物阻遏突變株組成型突變株各種抗性突變株增加有關(guān)基因數(shù)量的工程菌株遺傳特性改變的菌株：第十七頁，共二十五頁。舉例

棒桿菌素（carynecin）是氯霉素的類似物，抗氯霉素的解烴棒桿菌（C.hydrocarbaclastus）突變體比親本產(chǎn)生的棒桿菌素要高出3倍。

衣霉素抑制細(xì)胞膜糖蛋白的合成，可改變細(xì)胞的分泌能力，有助于胞內(nèi)物質(zhì)分泌到胞外。篩選枯草芽孢桿菌的衣霉素抗性突變株，使α-淀粉酶的產(chǎn)量比親本提高了5倍。在大腸埃希菌中引入一個(gè)攜帶β-半乳糖苷酶的質(zhì)粒后，可以增加3倍的β-半乳糖苷酶產(chǎn)量。第十八頁，共二十五頁。Ganeana等將與淀粉酶產(chǎn)量有關(guān)的調(diào)節(jié)基因，通過逐步轉(zhuǎn)化的方法，組入到同一菌株的染色體上，從而構(gòu)建得到一個(gè)高產(chǎn)菌株N2T26，30℃培養(yǎng)72h，α-淀粉酶產(chǎn)量高達(dá)25000U/mL，比原始菌株提高2000倍。舉例第十九頁，共二十五頁。（四）發(fā)酵工藝條件的控制

控制培養(yǎng)基成分

控制發(fā)酵條件

添加前體

添加誘導(dǎo)劑

發(fā)酵與分離過程耦合第二十頁，共二十五頁。發(fā)酵工藝條件的控制——控制培養(yǎng)基成分

避免和減少使用易引起分解代謝產(chǎn)物阻遏的營(yíng)養(yǎng)成分如葡萄糖，硫酸銨等。

適量的速效和遲效碳源、氮源的配比。

采取補(bǔ)料工藝。

根據(jù)菌種遺傳背景控制某種物質(zhì)加入的濃度。如生物素、氨基酸、表面活性劑、抗生素、結(jié)構(gòu)類似物等。第二十一頁，共二十五頁。發(fā)酵工藝條件的控制——控制培養(yǎng)基成分

采用葡萄糖和乳糖為混合碳源

生長(zhǎng)停止后限量流加葡萄糖青霉素發(fā)酵糖的緩慢利用是青霉素合成的關(guān)鍵因素。舉例第二十二頁，共二十五頁。發(fā)酵工藝條件的控制——控制發(fā)酵條件

同一種微生物在同樣的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，只要控制不同的發(fā)酵條件（pH、溫度、溶解氧等），就可能獲得不同的代謝產(chǎn)物。

控制不同的發(fā)酵條件，實(shí)際上是影響微生物自身的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)而改變其代謝方向，使之按人們所需要的方向進(jìn)行，進(jìn)而達(dá)到獲得高濃度積累所需要產(chǎn)物的目標(biāo)。30℃以下合成金霉素增多；35℃時(shí)只產(chǎn)生四環(huán)素。金霉素鏈霉菌：第二十三頁，共二十五頁。舉例谷氨酸發(fā)酵控制通氣：乳酸或琥珀酸谷氨酸適量不足NH4+：α-酮戊二酸谷氨酸適量不足谷氨酰胺適量過量pH：谷氨酰胺