制藥過程與工藝(完整精致資料)-武漢科技大學(xué)課件

制藥過程與工藝主講教師：左振宇武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院生物工程專業(yè)二零年十月1制藥過程與工藝主講教師：左振宇武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)課程介紹制藥工藝學(xué)是研究藥物的工業(yè)生產(chǎn)過程共性規(guī)律及其應(yīng)用，包括制備原理、工藝路線、質(zhì)量控制。制藥工藝學(xué)是綜合應(yīng)用化學(xué)系列、生物系列、機械設(shè)備與工程單元操作等課程的專門知識，深化理解并掌握工藝原理，充分考慮藥品的特殊性，針對生產(chǎn)條件、所需環(huán)境等的具體要求，研究藥物制造原理、工藝路線與過程優(yōu)化、中試放大、生產(chǎn)技術(shù)與質(zhì)量控制，從而分析和解決生產(chǎn)過程的實際問題。從工業(yè)生產(chǎn)角度，改造、設(shè)計和開發(fā)藥物的生產(chǎn)工藝，制定相應(yīng)的操作規(guī)程。制藥工藝學(xué)課程的知識體系由三個知識領(lǐng)域、眾多知識單元和知識點三個層次組成。第一領(lǐng)域為生物技術(shù)制藥工藝；第二領(lǐng)域為化學(xué)制藥工藝；第三領(lǐng)域為制藥工藝的共性基礎(chǔ)。每個知識領(lǐng)域進一步分解成若干個知識單元，每個知識單元又包涵若干個知識點，最后形成的制藥工藝學(xué)課程體系。2課程介紹制藥工藝學(xué)是研究藥物的工業(yè)生產(chǎn)過程共性規(guī)律及其應(yīng)用，課程介紹課程內(nèi)容第1章導(dǎo)論第2章微生物發(fā)酵制藥工藝第3章基因工程制藥工藝第4章動物細胞培養(yǎng)制藥工藝第5章化學(xué)藥物工藝路線的設(shè)計和選擇第6章合成藥物工藝研究第7章典型化學(xué)制藥工藝第8章手性藥物合成第9章中試放大與生產(chǎn)工藝規(guī)程

共30學(xué)時，講授28學(xué)時，答疑2學(xué)時考核方法理論考試占80%；平時占20%3課程介紹課程內(nèi)容3課程介紹參考書元英進.現(xiàn)代制藥工藝學(xué)，化學(xué)工業(yè)出版社，2004年齊香君.生物制藥工藝學(xué)，化學(xué)工業(yè)出版社，2003年HeinrichKlefenz.IndustrialPharmaceuticalBiotechnology.Wiley-VCH,20024課程介紹參考書4第一章緒論5第一章緒論5本章內(nèi)容1.1制藥工藝學(xué)課程地位和性質(zhì)1.2天然提取制藥技術(shù)發(fā)展1.3生物技術(shù)制藥發(fā)展1.4化學(xué)合成制藥技術(shù)發(fā)展1.5制藥工業(yè)的發(fā)展1.6制藥技術(shù)展望6本章內(nèi)容1.1制藥工藝學(xué)課程地位和性質(zhì)61.1制藥工藝學(xué)課程地位和性質(zhì)71.1制藥工藝學(xué)課程地位和性質(zhì)7一課程性質(zhì)和地位制藥業(yè)發(fā)展與挑戰(zhàn)?90年1752億USD?00年4775億USD?增長大于8%全球?4496億元,年增長大于12％?制藥業(yè)集中度↑?原料藥生產(chǎn)大國?制藥技術(shù)和裝備整體水平低中國8一課程性質(zhì)和地位制藥業(yè)發(fā)展與挑戰(zhàn)?90年1752億USD全國外制藥工程教育1995年，NSF—新澤西州立大學(xué)Rutgers分校—制藥工程研究生教育密西根大學(xué)等高校也相繼設(shè)立制藥工程專業(yè)：TheCaliforniaStateUniversity,Fullerton;NewJerseyInstituteofTechnology;ColumbiaUniversity,NewYork;EcolePolytechniqueofMontreal;TheUniversityofLeeds;UniversityofPennsylvania;UniversityofAlabama除美國外，加拿大、英國和德國、日本和印度等國家的部分高校也已設(shè)立制藥工程教育計劃。9國外制藥工程教育1995年，NSF—新澤西州立大學(xué)Rutg國內(nèi)制藥工程教育1998年中國教育部調(diào)整新設(shè)置《制藥工程》工科本科專業(yè)化學(xué)制藥生物制藥中藥制藥……制藥工程10國內(nèi)制藥工程教育1998年中國教育部調(diào)整新設(shè)置《制藥工程》工制藥工程制藥工藝學(xué)、制藥分離工程、藥品質(zhì)量管理工程、制藥設(shè)備等厚基礎(chǔ)，寬口徑，注重培養(yǎng)全面素質(zhì)與創(chuàng)新能力制藥過程共性規(guī)律、技術(shù)、學(xué)科基礎(chǔ)、發(fā)展需求化學(xué)制藥生物制藥微生物制藥中藥制藥工業(yè)制劑生物化工制藥工程專業(yè)與原專業(yè)的關(guān)系11制藥工程制藥工藝學(xué)、制藥分離工程、藥品質(zhì)量管理工程、制藥設(shè)備二研究對象與內(nèi)容制藥工藝：從發(fā)現(xiàn)-藥物上市發(fā)現(xiàn)臨床前臨床毒理注冊生產(chǎn)GLPGCPGMP化學(xué)化學(xué)生物生物中藥劑型開發(fā)過程開發(fā)工業(yè)制藥工業(yè)制藥技術(shù)開發(fā)技術(shù)開發(fā)GLP—藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范GCP—藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范GMP—藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范12二研究對象與內(nèi)容制藥工藝：從發(fā)現(xiàn)-藥物上市發(fā)現(xiàn)臨床前臨床毒1研究對象藥物生產(chǎn)過程共性規(guī)律及其應(yīng)用，包括制備原理+工藝路線+質(zhì)量控制重要性：“安全、有效、均勻、可控”的保證藥物產(chǎn)業(yè)化的橋梁與瓶頸貫穿整個藥物研發(fā)過程131研究對象藥物生產(chǎn)過程共性規(guī)律及其應(yīng)用，包括制備原理+工2主要內(nèi)容綜合應(yīng)用化學(xué)系列、生物系列、機械設(shè)備與工程單元操作等課程的專門知識深化理解并掌握工藝原理，去分析和解決研發(fā)和生產(chǎn)過程的實際問題。從工業(yè)生產(chǎn)角度，改造、設(shè)計和開發(fā)藥物的生產(chǎn)工藝，制定相應(yīng)的操作規(guī)程。142主要內(nèi)容綜合應(yīng)用化學(xué)系列、生物系列、機械設(shè)備與工程單元操主要內(nèi)容實驗室（小試）工藝中試放大工藝在車間生產(chǎn)若干批號后，制定生產(chǎn)工藝規(guī)程15主要內(nèi)容實驗室（小試）工藝15制藥工藝的類別（藥物分類）化學(xué)合成藥物(syntheticdrug)布洛芬、雷尼替丁、氧氟沙星…生物合成藥物(biosyntheticdrug)重組人胰島素、重組人紅細胞生成素…中藥(traditionalchinesemedicine)速效救心丸、復(fù)方丹參滴丸…16制藥工藝的類別（藥物分類）化學(xué)合成藥物(synthetic按照典型藥物生產(chǎn)過程,分為4類：化學(xué)制藥工藝學(xué)生物制藥工藝學(xué)中藥制藥工藝學(xué)制劑工藝學(xué)17按照典型藥物生產(chǎn)過程,分為4類：171.2天然提取制藥技術(shù)發(fā)展181.2天然提取制藥技術(shù)發(fā)展18天然提取制藥是指直接從天然材料中使用分離純化等技術(shù)制備藥物。現(xiàn)代藥物最初來源于植物、動物和微生物，而且以提取分離為先導(dǎo)。19天然提取制藥是指直接從天然材料中使用分離純化等技術(shù)制備藥物。發(fā)展歷史15～17世紀，歐洲有了金雞納、愈創(chuàng)木、藥喇叭根、古柯果和可可等。19世紀，掀起了天然提取分離藥物的熱潮，從植物中分離出純的有效化學(xué)物質(zhì)。從鴉片中提取出嗎啡結(jié)晶；從吐根中分離得活性成份吐根堿。從金雞納樹皮分離得到了奎寧，成為最早用于治療瘧疾的藥物。從莨菪中提取了阿托品，從古柯葉取得了可卡因；從洋地黃葉子獲得洋地黃甙晶體。20世紀50年代后，對動物臟器的有效成分和生理活性物質(zhì)的全面了解，生產(chǎn)技術(shù)提高，改變了原來的混合制劑，生產(chǎn)單一特異性組分的生化藥物制劑。如豬牛胰島素、前列腺酶及輔酶、激素、脂類、蛋白質(zhì)和核酸及其降解產(chǎn)物等。生化藥物品種迅速增加，已成為一類重要的藥物。20發(fā)展歷史15～17世紀，歐洲有了金雞納、愈創(chuàng)木、藥喇叭根、古由于合成工藝、技術(shù)等因素的限制，仍然有些氨基酸、維生素、核苷酸、酶、多糖、脂類等仍然不能合成生產(chǎn)，必須直接從天然材料中提取。還有一些手性藥物和半合成藥物的中間原料也必須從天然材料中直接提取。21由于合成工藝、技術(shù)等因素的限制，仍然有些氨基酸、維生素、核苷1.3生物技術(shù)制藥發(fā)展221.3生物技術(shù)制藥發(fā)展22一相關(guān)定義生物技術(shù)藥物（biotechnologymedicine）是利用生物機體、組織、細胞，生產(chǎn)制造或從中分離得到的具有預(yù)防、治療和診斷功能的藥品，包括多肽、蛋白質(zhì)、酶和核酸以及具有生物活性的初級代謝和次級代謝產(chǎn)物、天然活性化合物及其類似物。生物技術(shù)藥物（biotechnologymedicine）、生物技術(shù)產(chǎn)品（biotechnologyproduct）、生物技術(shù)制品（productofpharmaceuticalbiotechnology）有時候也互換使用。在相關(guān)法規(guī)中，經(jīng)常出現(xiàn)的術(shù)語是生物制品(biologics，biologicproduct,中國、美國使用)、生物醫(yī)藥產(chǎn)品（biologicalmedicinalproduct，歐盟使用）。23一相關(guān)定義生物技術(shù)藥物（biotechnologymed中國生物制品規(guī)程對生物制品的定義：以微生物、寄生蟲、動物毒素、生物組織為起始材料，采用生物學(xué)工藝或分離純化技術(shù)制備，并以生物學(xué)技術(shù)和分析技術(shù)控制中間產(chǎn)物和成品質(zhì)量制成的生物活性制劑，包括菌苗、疫苗、毒素、類毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、抗體、變態(tài)反應(yīng)原、細胞因子、激素、酶、發(fā)酵產(chǎn)品、單克隆抗體、DNA重組產(chǎn)品和體外免疫診斷制品等。分為預(yù)防用生物制品、治療用生物制品和診斷用品三類。預(yù)防用生物制品包括疫苗、菌苗和類毒素；治療用生物制品包括抗血清與抗毒素、血液制品、細胞因子與抗體；診斷用品包括細菌學(xué)試劑、免疫試劑、臨床化學(xué)試劑。24中國生物制品規(guī)程對生物制品的定義：以微生物、寄生蟲、動物毒素二生物制藥的類型微生物發(fā)酵制藥采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物。第二次世界大戰(zhàn)期間誕生了以抗生素為代表的次級代謝產(chǎn)物的工業(yè)發(fā)酵，很快應(yīng)用到其他藥物的發(fā)酵生產(chǎn)，如氨基酸、維生素、甾體激素等。微生物藥物主要為抗生素(antibiotic)、氨基酸(aminoacid)、維生素(vitamin)、核苷酸和核苷(nucleotide,nucleoside)、酶(enzyme)、酶抑制劑(enzymeinhibitor)、免疫調(diào)節(jié)劑(immunomodulator)和受體拮抗劑(receptorantagonist)等。酶工程技術(shù)制藥酶工程技術(shù)在制藥工業(yè)上的主要應(yīng)用是（1）生物酶用于制備手性藥物；（2）生物轉(zhuǎn)化，給已有藥物添加基團，增加藥效和功能。25二生物制藥的類型微生物發(fā)酵制藥25細胞培養(yǎng)技術(shù)制藥動植物細胞培養(yǎng)(cellculture)是在離體條件下人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)動植物細胞，使之生長繁殖并發(fā)育。主要應(yīng)用于生產(chǎn)人畜病毒疫苗、單克隆抗體、重組基因工程產(chǎn)品等。基因工程技術(shù)制藥基因工程（geneengineering）制藥是在體外通過重組DNA技術(shù)，對生物的遺傳物質(zhì)基因進行剪切、拼接、重新組合，與適宜的載體連接，構(gòu)成完整的基因表達系統(tǒng)，然后導(dǎo)入宿主生物細胞內(nèi)，與原有遺傳物質(zhì)整合或以質(zhì)粒形式單獨在細胞中繁殖，并表達活性蛋白質(zhì)、多肽或核酸等藥物。通過基因工程改造微生物細胞的代謝過程，還可提高抗生素、維生素、氨基酸、核酸、輔酶、甾體激素等藥物的生產(chǎn)能力。26細胞培養(yǎng)技術(shù)制藥26三、生物藥物的用途1作為治療藥物按藥理作用主要有以下：內(nèi)分泌障礙治療劑：胰島素、生長素、甲狀腺素等。維生素類藥物：主要起營養(yǎng)作用，用于維生素缺乏癥。中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物：L－多巴，人工牛黃、腦啡肽。血液及造血系統(tǒng)藥物：常見的有抗貧血藥（血紅素）、抗凝藥（肝素）、纖溶劑－抗血栓藥（尿激酶）等。呼吸系統(tǒng)藥物：平喘藥（PGE、腎上腺素）、祛痰劑（乙酰半胱氨酸）、鎮(zhèn)咳藥（蛇膽、雞膽）。心血管系統(tǒng)藥物：抗高血壓藥（激肽釋放酶）、降血脂藥（彈性蛋白酶，豬去氧膽酸）、冠心病防治藥（硫酸軟骨素A）27三、生物藥物的用途1作為治療藥物27消化系統(tǒng)藥物：助消化藥（多酶片）、潰瘍抑制劑（胃膜素、維生素U）、止瀉藥（鞣酸蛋白）?？共《舅幬铮阂种撇《竞怂岬暮铣桑绲廛找种撇《竞铣擅?，如阿糖腺苷調(diào)節(jié)免疫功能，如干擾素抗腫瘤藥物：主要有核酸類抗代謝物（阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶）、抗癌天然大分子（天冬酰胺酶，香菇多糖PSK，灰樹花多糖）、提高免疫力抗癌劑（白介素－2,干擾素）抗輻射藥物：如超氧歧化酶（SOD）計劃生育用藥：口服避孕藥（復(fù)方炔諾酮）生物制品類治療藥：各種免疫蛋白、抗毒素、抗血清（蛇毒抗血清）。28消化系統(tǒng)藥物：助消化藥（多酶片）、潰瘍抑制劑（胃膜素、維生素2作為預(yù)防藥物常見的預(yù)防藥物有菌苗、疫苗、類毒素及冠心病防治藥物。3作為診斷藥物（1）免疫診斷試劑利用高度特異性和敏感性的抗原機體反應(yīng)，檢測樣品中有無相應(yīng)的抗原或抗體，可作為臨床診斷的依據(jù)。主要有診斷抗原和診斷血清。診斷抗原：細菌類，如傷寒病毒類，如SARS，乙肝病毒毒素類，如鏈球菌溶血素O292作為預(yù)防藥物29診斷血清：細菌類病毒類腫瘤類抗毒素類激素類血型及人類白細胞抗原診斷血清其它（2）酶診斷試劑利用酶反應(yīng)的專一性和快速靈敏的特點，定量測定體液內(nèi)的某一成分變化作為病情診斷的參考。目前有40余種酶診斷試劑盒。30診斷血清：30（3）器官功能診斷藥物利用某些藥物對器官功能的刺激作用，排泄速度等已檢查器官的功能損害程度。如甘露醇等。（4）放射性核素診斷藥物放射性核素診斷藥物有聚集于不同組織或器官的特性，故加入體內(nèi)后，可檢測其在體內(nèi)的吸收、分布、轉(zhuǎn)運、利用及排泄等情況，從而顯示器官功能及其形態(tài)，以供疾病的診斷。（5）診斷用單克隆抗體（McAb）McAb的特點之一是專一性強，一個B細胞所產(chǎn)生的抗體只針對抗原分子上的一個特定抗原決定族。31（3）器官功能診斷藥物31（四）用作其它生物醫(yī)藥用品生化試劑如細胞培養(yǎng)基、電泳試劑等生物醫(yī)學(xué)材料手術(shù)縫合線、人造骨頭等。營養(yǎng)保健品和美容化妝品32（四）用作其它生物醫(yī)藥用品321.4化學(xué)合成制藥技術(shù)發(fā)展331.4化學(xué)合成制藥技術(shù)發(fā)展33全合成制藥磺胺嘧啶、阿司匹林…半合成制藥多烯紫杉醇、頭孢類抗生素…手性制藥阿托伐他汀、阿奇霉素…34全合成制藥34化學(xué)制藥工藝的要求最安全：易燃易爆、有毒的原料與中間體最經(jīng)濟：成本最低最便捷：工藝路線最短，最簡，易于組織生產(chǎn)綠色工藝：三廢，廢水、氣、渣35化學(xué)制藥工藝的要求最安全：易燃易爆、有毒的原料與中間體351.5制藥工業(yè)的發(fā)展361.5制藥工業(yè)的發(fā)展36一全球制藥工業(yè)的發(fā)展制藥工業(yè)（pharmaceuticalindustry）的歷史大約70多年，但一開始就發(fā)展很快，目前全世界制藥企業(yè)超過10000家，生產(chǎn)制造5000多種藥物，其中約100家為跨國公司。20世紀初所用藥物只有四種：洋地黃用于治療各種心血管疾病，奎寧用于治療瘧疾，吐根屬植物提取物（活性成分為生物堿）用于治療痢疾，水銀用于治療梅毒，但當時缺乏安全性和有效性。20世紀70年代以后，出現(xiàn)現(xiàn)代生物技術(shù)制藥公司。目前，全世界生物技術(shù)公司4400多家，主要集中在歐美，美國1444家，歐洲1815家，加拿大472家，亞太地區(qū)685家。年產(chǎn)值超過10億美元的生物技術(shù)公司有20余家。37一全球制藥工業(yè)的發(fā)展制藥工業(yè)（pharmaceutica世界制藥行業(yè)具有以下特征并購風(fēng)云不斷，重組形成更大集團，強強聯(lián)合優(yōu)勢互補，戰(zhàn)略性驅(qū)動，企業(yè)經(jīng)營的專業(yè)化，企業(yè)間的合作。并購數(shù)量增加，藥品生產(chǎn)的集中度不斷提高。研發(fā)費用持續(xù)上升，投入繼續(xù)增大，國際10大制藥公司的年均投入占銷售額的16％左右。1個新藥的研發(fā)費用約8－10億美元，但新藥批準上市的數(shù)目在下降。研發(fā)的難度越來越大，新產(chǎn)品是行業(yè)的希望。重磅炸彈藥物數(shù)目持續(xù)增加，從1995年到2004年，增長了近4倍?？鐕靖嘁蕾囉谥匕跽◤椝幬?，是企業(yè)的主要利潤來源。生物技術(shù)藥物異軍突起。20世紀80年代以前是治療性藥物，20世紀90年代是改善生命質(zhì)量的藥物，而進入21世紀，將是靶向的蛋白質(zhì)、多肽和核酸類治療性藥物。38世界制藥行業(yè)具有以下特征并購風(fēng)云不斷，重組形成更大集團，強強二我國制藥工業(yè)發(fā)展中國制藥工業(yè)的發(fā)展經(jīng)歷了從藥店到廠房，再到現(xiàn)代化企業(yè)和集團的過程。20世紀20～30年代，上海、廣州是我國近代制藥工業(yè)的發(fā)祥地，但制藥工業(yè)十分落后。1949年新中國成立初期，重視醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展，確定了“以發(fā)展原料藥為主”的方針。同時，積極發(fā)展藥物制劑生產(chǎn)。1951年試制出第一批結(jié)晶青霉素，1958年，以生產(chǎn)抗生素為主的華北制藥廠建成投產(chǎn)；至1959年，中國建立起化學(xué)制藥工業(yè)。20世紀80年代后，走上了按正規(guī)制藥工業(yè)管理和發(fā)展的道路。39二我國制藥工業(yè)發(fā)展中國制藥工業(yè)的發(fā)展經(jīng)歷了從藥店到廠房，1.6制藥技術(shù)展望401.6制藥技術(shù)展望40制藥行業(yè)是一個集約化、國際化程度極高的產(chǎn)業(yè)。國外公司在中國設(shè)立研發(fā)機構(gòu)，并把生產(chǎn)制造中心向中國轉(zhuǎn)移?！笆晃濉睍r期乃至更長時間我國醫(yī)藥市場需求將繼續(xù)保持旺盛勢頭。中國醫(yī)藥市場今后5年內(nèi)將以15％～20％的速度發(fā)展，到2010年將達到240億美元，成為繼美國、日本、德國和法國之后的世界第5大醫(yī)藥市場，2020年將達到1200億美元，超過美國成為全球第一大市場。從制藥業(yè)各子行業(yè)看，未來5～10年期間，我國醫(yī)藥市場將繼續(xù)保持以化學(xué)藥為主，生物技術(shù)制藥已經(jīng)成為制藥行業(yè)的新領(lǐng)域，天然提取制藥有很大發(fā)展空間。主要途徑為：創(chuàng)新藥物研究、抗體工程制藥技術(shù)、制藥工藝新技術(shù)及其改造。41制藥行業(yè)是一個集約化、國際化程度極高的產(chǎn)業(yè)。國外公司在中國設(shè)創(chuàng)新藥物研究加大制藥的科研開發(fā)投入，研究并擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的藥物和技術(shù)。我國現(xiàn)有常用西藥4000多種，其中97％屬于仿制國外產(chǎn)品或進口藥。采用組合生物化學(xué)、生物分子芯片、細胞組織和動物模型等高通量的方法篩選天然藥物，發(fā)現(xiàn)新型治療藥物。利用人類基因組和蛋白質(zhì)組以及病原生物體的基因組的最新成果，計算機技術(shù)，把生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)藥學(xué)、藥物化學(xué)、藥理學(xué)等的技術(shù)綜合起來，通過突變、生物展示、嵌合、質(zhì)譜分析等，進行新型藥物的輔助設(shè)計和藥物篩選，獲得創(chuàng)新性藥物。通過基因工程技術(shù)，改變重組蛋白類藥物的結(jié)構(gòu)，從而增強活性，延長體內(nèi)的半衰期。利用生物分子修飾化學(xué)藥物。如利用人白蛋白制成的納米顆粒結(jié)合紫杉醇注射制劑，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的紫杉醇制劑可避免過敏反應(yīng)，加強了紫杉醇的臨床效果和安全性。42創(chuàng)新藥物研究加大制藥的科研開發(fā)投入，研究并擁有自主知識產(chǎn)權(quán)抗體工程制藥技術(shù)FDA批準上市的生物藥物中，抗體類藥物所占比例越來越大，2004年有11個，3個為全新藥物，其它為新適應(yīng)癥。抗體類藥物一上市就成為年銷售額逾億美元的重磅炸彈藥(blockbusterdrug)?；趩慰寺】贵w的治療劑主要的應(yīng)用領(lǐng)域是癌癥，上市的抗體藥物一半都在營利。預(yù)計單抗藥物的全球銷售額將從2004年的50多億美元增至2010年的150億美元，平均年增長30%。43抗體工程制藥技術(shù)FDA批準上市的生物藥物中，抗體類藥物所占制藥工藝新技術(shù)及其改造應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)改造我國傳統(tǒng)的醫(yī)藥工業(yè)，使我國制藥行業(yè)的經(jīng)濟實現(xiàn)由速度型向效益型、由粗放型向集約型的根本轉(zhuǎn)變，用先進的制造技術(shù)進行藥物生產(chǎn)。研究適用于大規(guī)模藥物生產(chǎn)的動植物和微生物表達系統(tǒng)，提高藥物生產(chǎn)效率的新途徑。大力開發(fā)手性藥物及外消旋藥物的手性轉(zhuǎn)化。加強環(huán)境保護與質(zhì)量意識。44制藥工藝新技術(shù)及其改造應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)改造我國傳統(tǒng)的醫(yī)藥工本章結(jié)束45本章結(jié)束45第2章微生物發(fā)酵制藥工藝46第2章微生物發(fā)酵制藥工藝46本章內(nèi)容2.1微生物發(fā)酵與制藥2.2制藥微生物生長與生產(chǎn)關(guān)系2.3制藥微生物菌種的建立2.4培養(yǎng)基制備2.5滅菌工藝2.6微生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)2.7發(fā)酵工藝過程的控制2.8抗生素生產(chǎn)工藝2.9氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝2.10維生素生產(chǎn)工藝47本章內(nèi)容2.1微生物發(fā)酵與制藥472.1微生物發(fā)酵與制藥482.1微生物發(fā)酵與制藥48一發(fā)酵概念發(fā)酵概念：通過微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過程。發(fā)酵種類：用產(chǎn)品說明，冠以產(chǎn)物名而成，如青霉素發(fā)酵，維生素發(fā)酵；發(fā)酵工程按需氧分為好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵。初級代謝產(chǎn)物：在初級代謝過程中形成的產(chǎn)物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等。生長所必須的。幾乎所有生物初級代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機酸。次級代謝產(chǎn)物：比較復(fù)雜的化合物，不是細胞生長必需的，對生命活動有意義（抗逆境條件）?？股?，毒素，色素。49一發(fā)酵概念發(fā)酵概念：通過微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過程。49發(fā)酵制藥種類微生物菌體發(fā)酵微生物菌體發(fā)酵是以獲得微生物菌體為目的，如：面包的酵母發(fā)酵、單細胞蛋白發(fā)酵（利用各種碳源）、真菌類（各種蘑菇、冬蟲夏草）、生物防治劑（蘇云金桿菌，伴孢晶體可以毒殺鱗翅目、雙翅目害蟲）。微生物酶發(fā)酵微生物酶發(fā)酵是以獲得酶為目的的發(fā)酵，如青霉素?；福糜诎牒铣汕嗝顾貢r，制備中間體6－氨基青霉烷酸。微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵初級代謝產(chǎn)物：氨基酸，核苷酸，維生素，有機酸。次級代謝產(chǎn)物：最主要的是抗生素。微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵利用微生物的一種或多種酶把一種化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)相關(guān)的更有價值的產(chǎn)物的生化反應(yīng)為轉(zhuǎn)化發(fā)酵。50發(fā)酵制藥種類微生物菌體發(fā)酵50制藥微生物的種類生產(chǎn)藥物的天然微生物主要包括細菌、放線菌和絲狀真菌三大類。細菌主要生產(chǎn)環(huán)狀或鏈狀多肽類抗生素，如芽孢桿菌(Bacillus)產(chǎn)生桿菌肽（bacitracin），多黏芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa）產(chǎn)生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。細菌還可以產(chǎn)生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（Brevibacteriumflarum）產(chǎn)生谷氨酸，大小菌生產(chǎn)維生素C。放線菌主要產(chǎn)生各類抗生素，以鏈霉菌屬最多，諾卡菌屬較少，還有小單孢菌屬。生產(chǎn)的抗生素主要有氨基糖苷類（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等）、四環(huán)類（四環(huán)素、金霉素、土霉素等）、放線菌素類（放線菌素D）大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大環(huán)內(nèi)酯類（制霉菌素、抗滴蟲霉素等）。酸性、堿性和中性，但以堿性為多。真菌的曲菌屬產(chǎn)生桔霉素，青霉素菌屬產(chǎn)生青霉素和灰黃霉素等，頭孢菌屬產(chǎn)生頭孢霉素等。脂環(huán)芳香類或簡單的氧雜環(huán)類，多為酸性化合物。51制藥微生物的種類生產(chǎn)藥物的天然微生物主要包括細菌、放線菌和發(fā)酵制藥的基本過程菌種選育發(fā)酵工段提煉工段成品工段孢子制備種子制備發(fā)酵控制預(yù)處理分離提取濃縮純化成品工段包裝原料藥實驗室、種子庫發(fā)酵車間提煉車間包裝車間52發(fā)酵制藥的基本過程菌種選育發(fā)酵工段提煉工段成品工段孢子制備2.3制藥微生物菌種的建立532.3制藥微生物菌種的建立53新藥生產(chǎn)菌的選育自然分離自然選育誘變育種雜交育種基因工程技術(shù)育種基因組shuffling技術(shù)54新藥生產(chǎn)菌的選育自然分離542.8抗生素生產(chǎn)工藝以青霉素為例552.8抗生素生產(chǎn)工藝以青霉素為例55一概述－發(fā)現(xiàn)1929:Fleming在葡萄球菌培養(yǎng)皿中，污染的霉菌周圍出現(xiàn)透明的抑菌圈。殺菌物質(zhì)，斷言太不穩(wěn)定，無法分離并用作藥物。1939：牛津病理家HowardFlorey化學(xué)家ErnstChain,NormanHeatley。發(fā)酵瓶培養(yǎng)霉菌，培養(yǎng)里提取，測活性，青霉素結(jié)晶。56一概述－發(fā)現(xiàn)56發(fā)展1940：8只鼠注射鏈球菌，提取物對4只治療。未經(jīng)治療鼠在24小時內(nèi)死亡，治療鼠存活數(shù)天至數(shù)周。1941年2月開始治療第一批人類病人。1943：威斯康辛大學(xué)小組，取得突破生產(chǎn)菌表面培養(yǎng)：幾十個單位。深層培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉：100U/ml。X、UV誘變育種：1000－1500U/ml。不產(chǎn)色素變種：66000－70000U/ml目前：85000U/ml。57發(fā)展1940：8只鼠注射鏈球菌，提取物對4只治療。未經(jīng)治療鼠概述－作用機理細胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽類似物競爭性與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯(lián)。生長中的細胞有效，靜止細胞無效高效、安全的抗細菌感染藥物58概述－作用機理細胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段58概述－應(yīng)用臨床抗感染治療：大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性細菌及螺旋體等。毒性小，但需要皮試。各種半合成抗生素的原料：氨芐青霉素，磺芐青霉素，乙氧萘青霉素頭孢菌素母核。59概述－應(yīng)用臨床抗感染治療：大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性二青霉素生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性產(chǎn)黃青霉：Penicilliumchrosogenum孢子:綠色和黃色菌落：平坦或皺褶，圓形。青霉穗:分生孢子鏈狀深層培養(yǎng)菌絲：球狀和絲狀兩種。60二青霉素生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性產(chǎn)黃青霉：Penicilliu發(fā)酵條件下的生長過程第1期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡。第2期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜堿性，類脂肪小顆粒。第3期：形成脂肪包涵體，機理貯藏物，沒有空泡，嗜堿性很強。第4期：脂肪包涵體形成小滴并減少，中小空泡，原生質(zhì)體嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性染色大顆粒，菌絲呈桶狀，脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高。第6期：出現(xiàn)個別自溶細胞，細胞內(nèi)無顆粒，仍然桶狀。釋放游離氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細胞壁。61發(fā)酵條件下的生長過程第1期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)鏡檢規(guī)定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期的形態(tài)變化，控制發(fā)酵。1－4期為菌絲生長期，3期的菌體適宜為種子。4－5期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強，通過工程措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前結(jié)束發(fā)酵。62鏡檢規(guī)定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期的形態(tài)變化，控制發(fā)酵。6三發(fā)酵工藝過程63三發(fā)酵工藝過程631生產(chǎn)孢子制備工斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長7天，25℃。注意：每批孢子必需進行嚴格搖瓶試驗，測定效價及雜菌情況。641生產(chǎn)孢子制備工斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組2種子罐培養(yǎng)工藝一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等?？諝饬髁?：3（體積比）；300-350rpm；pH自然，溫度27±1℃,40h二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10％培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，25±1℃。10-14h質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h652種子罐培養(yǎng)工藝一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。3生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝三級罐：生產(chǎn)罐；接種量20％。培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油。參數(shù)條件：通氣量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小時:pH6.4-6.6，26℃；60小時后:pH6.7,24℃。663生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝三級罐：生產(chǎn)罐；接種量20％。664發(fā)酵培養(yǎng)與過程控制操作方式：反復(fù)分批式發(fā)酵。發(fā)酵罐：100M3，裝料80M3。帶放:6-10次，帶放量10％，間隔24h。發(fā)酵周期：180-220h。674發(fā)酵培養(yǎng)與過程控制操作方式：反復(fù)分批式發(fā)酵。67（1）過程控制——補料分批操作控制基質(zhì)濃度前40小時：培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物40小時后：低速連續(xù)補加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。半饑餓狀態(tài)：延長合成期，提高產(chǎn)量。碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。糖與6APA結(jié)合形成糖基-6APA，影響青霉素產(chǎn)量。68（1）過程控制——補料分批操作控制基質(zhì)濃度前40小時：培養(yǎng)基流加碳源控制根據(jù)殘?zhí)恰H、尾氣中CO2和O2含量。葡萄糖的波動范圍較窄，濃度過低使抗生素合成速度減慢或停止，過高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至引起自溶。殘?zhí)?.3-0.6％左右，pH開始升高時流加糖。濃度：500kg/m3，流速:1.0-2.5kg/m3·h。69流加碳源控制根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。69流加氮源控制玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。補加無機氮源：硫酸銨、氨水、尿素。氨基氮濃度：0.01-0.05%。70流加氮源控制玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍鹽離子控制無機鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵對青霉素合成有毒，30-40ug/ml以下。罐壁涂環(huán)氧樹脂保護層。71鹽離子控制無機鹽：硫、磷、鎂、鉀等。71（2）添加青霉素側(cè)鏈前體時期：合成階段。種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸。毒性：抑制細胞生長和青霉素合成。策略：低濃度流加。濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%?？刂疲罕３止?yīng)速率略大于生物合成需要。72（2）添加青霉素側(cè)鏈前體時期：合成階段。72提高產(chǎn)量的其他物質(zhì)流加表面活性劑：新潔爾滅、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、單油酸酯、單月桂酸酯、三油酸酯可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇其他：剪切保護劑；分散劑73提高產(chǎn)量的其他物質(zhì)流加表面活性劑：新潔爾滅、聚氧乙烯、山梨糖（3）溫度控制適宜菌絲生長溫度30℃，分泌青霉素20℃。20℃青霉素破壞少，周期很長。變溫控制，不同階段不同溫度。生長階段:較高溫度，縮短生長時間；生產(chǎn)階段適當降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制24℃。74（3）溫度控制適宜菌絲生長溫度30℃，分泌青霉素20℃。74（4）pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過7.0直接加酸或堿：自動控制流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢。pH下降：補加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補加糖、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）75（4）pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過7.0（5）溶氧控制＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降；＜10％，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧。調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速:各階段的生長和耗氧量不同。76（5）溶氧控制＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降；76（6）消沫天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵。策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。77（6）消沫天然油脂：玉米油；77四提煉工藝過程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機溶劑，水中溶解度很小青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性防止降解，條件溫和、快速。78四提煉工藝過程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不1預(yù)處理青霉素的存在部位：發(fā)酵液。濃度較低：10－30kg/m3。含有大量雜質(zhì)：菌體細胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產(chǎn)物等。目的：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過程。預(yù)處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白。791預(yù)處理青霉素的存在部位：發(fā)酵液。792過濾鼓式真空過濾機過濾：一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質(zhì)含量0.5-2.0%。板框式過濾機過濾：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土為助慮劑。二次濾液：澄清透明，用于提?。ㄊ章?0％）802過濾鼓式真空過濾機過濾：803、溶劑萃取原理：青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而霉素鹽易溶于水。萃取劑：青霉素分配系數(shù)高的有機溶劑。工業(yè)上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白質(zhì)：加0.05-0.1%乳化劑PPB。萃?。?－3次。813、溶劑萃取原理：青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而霉素鹽易溶于逆流萃取過程正相萃?。核峄痯H1.8-2.0，濾液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式離心機分離（濃縮1.5-2.1）反相萃取：pH6.8-7.4（磷酸鹽、碳酸鹽緩沖液）。把青霉素從丁酯中提取到緩沖液中。反復(fù)萃取2－3次，達到結(jié)晶要求。萃取條件：10℃下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。82逆流萃取過程正相萃取：酸化pH1.8-2.0，824脫色萃取液中添加活性炭，除去色素。過濾，除去活性炭。834脫色萃取液中添加活性炭，除去色素。835結(jié)晶——直接結(jié)晶加醋酸鈉－乙醇溶液反應(yīng)：得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液：得到青霉素鉀鹽。845結(jié)晶——直接結(jié)晶加醋酸鈉－乙醇溶液反應(yīng)：得到結(jié)晶鈉鹽。85結(jié)晶——共沸蒸餾結(jié)晶萃取液，再用0.5MNaOH萃取pH6.4-6.8下得到鈉鹽水濃縮液。加3-4倍體積丁醇，16-26℃，真空0.67-1.3KPa）下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結(jié)晶析出。結(jié)晶經(jīng)過洗滌、干燥（60℃真空16h），磨粉，裝桶，得到青霉素產(chǎn)品。855結(jié)晶——共沸蒸餾結(jié)晶萃取液，再用0.5MNaOH萃取2.9氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝862.9氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝86一氨基酸類藥物得基本概念α氨基酸87一氨基酸類藥物得基本概念α氨基酸87氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用氨基酸的營養(yǎng)價值及其與疾病治療的關(guān)系必需氨基酸—人和哺乳動物自身不能合成，需要由食物供應(yīng)，稱為必需氨基酸。賴氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸等8種。治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸及其鹽酸鹽，谷氨酰胺，乙酰谷酰胺鋁，甘氨酸及其鋁鹽，硫酸甘氨酸鐵，維生素U及組氨酸鹽酸鹽等。治療肝病的氨基酸及其衍生物精氨酸鹽酸鹽，磷葡精氨酸，鳥天氨酸，谷氨酸鈉，蛋氨酸，乙酰蛋氨酸，瓜氨酸，賴氨酸鹽酸鹽，及天冬氨酸等。88氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用氨基酸的營養(yǎng)價值及其與疾病治療治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸鈣鹽及鎂鹽，氫溴酸谷氨酸，色氨酸，5－羥色氨酸、左旋多巴等。用于腫瘤治療的氨基酸及其衍生物偶氮絲氨酸，氯苯丙氨酸，磷天冬氨酸及重氮氧代正亮氨酸等。其它氨基酸類藥物的臨床應(yīng)用89治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸及其衍生物89二氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法1發(fā)酵法2水解法3酶法轉(zhuǎn)化90二氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法1發(fā)酵法90L－異亮氨酸的制備培養(yǎng)液滅菌滅菌培養(yǎng)液菌種培養(yǎng)接種發(fā)酵發(fā)酵液過濾上層液酸化濾液離子交換洗脫液減壓蒸餾濃縮液活性炭脫色濾液減壓濃縮濃縮液氨水中和沉淀水結(jié)晶干燥L(fēng)－異亮氨酸成品1發(fā)酵法91L－異亮氨酸的制備培養(yǎng)液滅菌滅菌培養(yǎng)液菌種培養(yǎng)接種發(fā)酵發(fā)酵液工藝過程1）菌種培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成（％）為：葡萄糖2，尿素0.3，玉米漿2.5，豆餅水解液0.1，pH6.5。二級種子培養(yǎng)基加菜籽油，其余同一級種子培養(yǎng)基。一級種子培養(yǎng)：1000ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為200ml，接種一環(huán)牛肉膏斜面AS1.998菌種，搖床30℃16h。二級種子培養(yǎng)：接種量3.5％，培養(yǎng)8h。逐級放大。2）滅菌、發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)液組成（％）：硫酸銨4.5，豆餅水解液0.4，玉米漿2.0，碳酸鈣4.5，pH7.2，淀粉水解還原糖粗糖濃度11.5。滅菌，接種1％菌種（v/v），攪拌，發(fā)酵。92工藝過程1）菌種培養(yǎng)923）除菌體，酸化發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液加熱至100℃并維持10min，冷卻過濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至pH3.5，過濾除沉淀。4）離子交換、吸附分離上述濾液每分鐘以樹脂量1.5％的流速進H＋型732離子交換柱（φ40×100cm),以100L去離子水洗柱，再以60℃,0.5mol/L氨水按3L/min的流速進行洗脫。分部收集洗脫液。5）濃縮趕氨6）脫色、濃縮、中和7）精制，烘干933）除菌體，酸化931水解法（一）基本原理蛋白質(zhì)水解方法酸水解法、堿水解法、酶水解法氨基酸分離方法溶解度法、特殊試劑沉淀法、吸附法、離子交換法氨基酸精制方法結(jié)晶，重結(jié)晶941水解法（一）基本原理94L－胱氨酸的制備：人發(fā)或豬毛水解液L－半胱氨酸粗品濾液L－半胱氨酸粗品濾液L－半胱氨酸鹽酸水解氫氧化鈉中和鹽酸，活性炭氫氧化鈉中和鹽酸，活性炭中和，氨水水解法舉例95L－胱氨酸的制備：人發(fā)或豬毛水解液L－半胱氨酸粗品濾液L－半延胡索酸＋NH3固定化天冬氨酸酶轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化液L－Asp粗品分離L-Asp精品轉(zhuǎn)化液固定化L－Asp－β－脫羧酶濃縮結(jié)晶L－Ala粗品L－Ala精品精制3酶法轉(zhuǎn)化天冬氨酸和丙氨酸的制備96延胡索酸＋NH3固定化天冬氨酸酶轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化液L－Asp粗品分離工藝過程1）菌種培養(yǎng)大腸桿菌（E.coli）AS1.881的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為普通肉汁培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)基成分（％）：玉米漿7.5，反丁烯二酸2.0，硫酸鎂（7水）0.02，氨水調(diào)pH6.0，煮沸后過濾，500ml三角燒瓶中裝液量50-100ml。從新鮮斜面上或液體中培養(yǎng)種子，接種子于搖瓶培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)24h，逐級擴大培養(yǎng)至1000～2000ml規(guī)模。培養(yǎng)結(jié)束后用1mol/LHCl調(diào)pH5.0，升溫至45℃并保溫1h，冷卻至室溫，離心收集菌體。德阿昆哈假單胞（Pseudomonasdacunhae）68變異株的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基組成（％）為蛋白胨0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaCl0.5，pH7.0，瓊脂2.0。種子培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基，不加瓊脂，250ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量40ml。搖瓶培養(yǎng)基組成（％）為L－谷氨酸3.0，蛋白胨，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氫鉀0.05，MgSO4.7H2O0.01，用氨水調(diào)pH7.2，500ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為80ml。將培養(yǎng)24h的新鮮斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)8h，再接種于搖瓶培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)24h，逐級放大。97工藝過程1）菌種培養(yǎng)972）細胞固定化Ecoli的細胞固定化取濕菌體20kg，懸浮于生理鹽水中，保溫至40℃，再加入90L保溫至40℃的12％明膠溶液及10L1.0％戊二醛溶液，充分攪拌均勻，放置冷卻凝固，再浸入0.25％戊二醛溶液中。于5℃過夜后，切成3～5mm的立體小方塊，浸入0.25％戊二醛溶液5℃過夜，蒸餾水充分洗滌，濾干得含天冬氨酸酶得固定化。假單胞菌體固定取濕菌體20kg，加生理鹽水攪拌至稀釋至40L，另取溶于生理鹽水的5％角叉菜膠溶液85L，兩液均保溫至45℃后混合，冷卻至5℃成膠。浸于600L2％KCl和0.2mol/L已二胺的0.5mol/LpH7.0的磷酸緩沖液中，5℃下攪拌10min，加戊二醛至0.6mol/L濃度，5℃攪拌30min，取出切成3～5mm的立體方塊，用2％KCl溶液充分洗滌后，濾去洗滌液，即得固定化脫羧細胞。982）細胞固定化983）生物反應(yīng)堆的制備4）轉(zhuǎn)化反應(yīng)5）產(chǎn)品純化與精制993）生物反應(yīng)堆的制備99L－脯氨酸4化學(xué)合成法100L－脯氨酸4化學(xué)合成法100L－谷氨酸＋乙醇硫酸三乙胺L－谷氨酸－γ－乙酯KBH4還原L－Pro反應(yīng)液五氯酚沉淀氨水解析濾液活性炭濾液乙醚固形物精制L－脯氨酸成品101L－谷氨酸＋乙醇硫酸三乙胺L－谷氨酸－γ－乙酯KBH4還原L2.10維生素生產(chǎn)工藝1022.10維生素生產(chǎn)工藝102一概述維生素是一類生物生長發(fā)育起調(diào)節(jié)作用的、化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的、小分子有機化合物，人體內(nèi)不能合成，必須從食物等中攝取。人體需求量很少，但不足時，出現(xiàn)相應(yīng)的缺乏癥。已知維生素13種，根據(jù)溶解性，一般分為水溶性和脂溶性維生素兩類。主要維生素的生產(chǎn)有三種方法。2002年我國維生素原料產(chǎn)量達8.2萬噸，其中維生素C超過5萬噸，成為世界上最大的原料藥生產(chǎn)國和出口國。維生素制劑年產(chǎn)量260－280億支/片/瓶，以片劑、注射液和膠囊為主。103一概述維生素是一類生物生長發(fā)育起調(diào)節(jié)作用的、化學(xué)結(jié)構(gòu)不同2維生素C生產(chǎn)工藝目前，工業(yè)上生產(chǎn)維生素C采用二步發(fā)酵法，此法是在1975年由中國科學(xué)院上海生物技術(shù)研究所研究出來的，屬我國首創(chuàng)。發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C可以分為發(fā)酵、提取和轉(zhuǎn)化三大步驟。即先從D-山梨醇發(fā)酵，提取出維生素C前體2-酮基-L-古龍酸，再用化學(xué)法轉(zhuǎn)化為維生素C。第一步發(fā)酵黑醋酸菌（Acetobactersuboxydans）經(jīng)種子擴大培養(yǎng)，接入發(fā)酵罐，種子和發(fā)酵培養(yǎng)基主要包括山梨醇、玉米漿、酵母膏、碳酸鈣等成份，pH5.0~5.2。醇濃度控制在24~27%，培養(yǎng)溫度29~30℃，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)低溫滅菌，移入第二步發(fā)酵罐作原料。D-山梨醇轉(zhuǎn)化L-山梨糖的生物轉(zhuǎn)化率達98%以上。1042維生素C生產(chǎn)工藝目前，工業(yè)上生產(chǎn)維生素C采用二步發(fā)酵法第二步發(fā)酵氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans，小菌)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium，大菌)混合培養(yǎng)。生產(chǎn)維生素C的發(fā)酵罐均在100m3以上，瘦長型，無機械攪拌，采用氣升式攪拌。種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的成份類似,主要有L-山梨糖、玉米漿、尿素、碳酸鈣、磷酸二氫鉀等，pH值為7.0。大、小菌經(jīng)二級種子擴大培養(yǎng)，接入含有第一步發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，29~30℃下通入大量無菌空氣攪拌，培養(yǎng)72h左右結(jié)束發(fā)酵，L-山梨糖生成2-酮基-L-古龍酸的轉(zhuǎn)化率可達70~85%。2-酮基-L-古龍酸的分離提純經(jīng)二步發(fā)酵法兩次發(fā)酵以后，發(fā)酵液中僅含8%左右的2-酮基-L-古龍酸，且殘留菌絲體、蛋白質(zhì)和懸浮的固體顆粒等雜質(zhì)，常采用加熱沉淀法、化學(xué)凝聚法、超濾法分離提純。傳統(tǒng)工藝是加熱沉淀法，發(fā)酵液經(jīng)靜置沉降后通過732氫型離子交換樹脂柱，調(diào)節(jié)pH至蛋白質(zhì)等電點，并加熱使蛋白質(zhì)凝固，然后用高速離心機分離出菌絲、蛋白和微粒，清液再次通過陽離子交換柱，酸化為2-酮基-L-古龍酸的水溶液，濃縮結(jié)晶后得到2-酮基-L-古龍酸。105第二步發(fā)酵1052-酮基-L-古龍酸的化學(xué)轉(zhuǎn)化將維生素C前體2-酮基-L-古龍酸轉(zhuǎn)化為維生素C，常采用堿轉(zhuǎn)化法。2-酮基-L-古龍酸在甲醇中用濃硫酸催化酯化生成2-酮基-L-古龍酸甲酯，加NaHCO3轉(zhuǎn)化生成維生素C鈉鹽，經(jīng)氫型離子交換樹脂酸化得到維生素C。粗品經(jīng)結(jié)晶精制得維生素C成品。1062-酮基-L-古龍酸的化學(xué)轉(zhuǎn)化1063維生素B2生產(chǎn)工藝維生素B2（vitaminB2）又稱核黃素(riboflavin)，國內(nèi)約有l(wèi)0家核黃素生產(chǎn)商。目前國內(nèi)外廣泛采用微生物發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)維生素B2。能夠產(chǎn)生維生素B2的微生物有細菌、真菌和霉菌，工業(yè)生產(chǎn)中主要以阿舒假囊酵母(Eremothereciumashbyii)為生產(chǎn)菌種。維生素B2的工業(yè)發(fā)酵一般為二級發(fā)酵，發(fā)酵液先沉淀再氧化進行分離提純。1073維生素B2生產(chǎn)工藝維生素B2（vitaminB2）又稱發(fā)酵培養(yǎng)基中以植物油、葡萄糖、糖蜜或大米等作為主要碳源，植物油中以豆油對維生素B2產(chǎn)量的促進效果最為顯著,有機氮源以蛋白胨、骨膠、魚粉、玉米漿為主，無機鹽有NaCl、K2HPO4、MgSO4。種子擴大培養(yǎng)和發(fā)酵的通氣量要求均比較高，通氣比一般在1.0，罐壓0.05MPa左右，攪拌功率要求比較高。阿舒假囊酵母的最適生長溫度在28~30℃，種子培養(yǎng)34~38h后接入發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)40h后開始連續(xù)流加補糖，發(fā)酵液的pH值控制在5.4~6.2,發(fā)酵周期為150~160h。維生素B2的產(chǎn)量在50g/L左右。維生素B2的分離提取與純化發(fā)酵液酸化后加熱,然后加入黃血鹽、硫酸鋅沉淀蛋白，過濾后濾液調(diào)pH1.5~2.0酸化，靜置20~40h沉淀，壓濾后將沉淀物酸溶，加入硝酸銨，氧化抽提，氧化液經(jīng)結(jié)晶、過濾后，濕晶在80℃以下干燥20h，得到維生素B2成品。108發(fā)酵培養(yǎng)基中以植物油、葡萄糖、糖蜜或大米等作為主要碳源，植物本章結(jié)束109本章結(jié)束109第3章基因工程制藥工藝110第3章基因工程制藥工藝110本章內(nèi)容3.1基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)3.2基因工程大腸桿菌的構(gòu)建技術(shù)3.3基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制3.4重組人干擾素生產(chǎn)工藝111本章內(nèi)容3.1基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)1113.1基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)1123.1基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)112基因工程菌：微生物為操作對象，通過基因工程技術(shù)獲得的表達外源基因或過量或抑制表達自身基因的工程生物體。種類：細菌和酵母是重要的表達重組藥物的制藥生物。113基因工程菌：微生物為操作對象，通過基因工程技術(shù)獲得的表達外源一大腸桿菌表達系統(tǒng)1大腸桿菌（Eschericliacoli）形態(tài)特征細胞：G－，單細胞，桿狀。鞭毛，無芽孢，一般無莢膜。裂殖。菌落:白色至黃白色，光滑，直徑2－3mm。114一大腸桿菌表達系統(tǒng)1大腸桿菌（Eschericliac2生化與遺傳特性能在僅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的無機鹽的極限培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵糖，產(chǎn)氣產(chǎn)酸?；蚬こ讨惺褂镁辏篕－12株的衍生菌株?；蚪M：4.6Mb，3000多種蛋白質(zhì)。染色體DNA為環(huán)狀雙鏈，核外遺傳物質(zhì)為質(zhì)粒。1152生化與遺傳特性能在僅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的無機3質(zhì)粒載體復(fù)制起始點選擇標記多克隆位點1163質(zhì)粒載體復(fù)制起始點116質(zhì)粒類型嚴緊型質(zhì)粒：在每個宿主細胞只能復(fù)制少數(shù)幾個拷貝的質(zhì)粒，pSC101；松弛型質(zhì)粒：在每個細胞中能復(fù)制幾十至幾百個拷貝數(shù)的質(zhì)粒，pMB1和colE1；克隆質(zhì)粒：用于克隆和擴增外源基因；測序質(zhì)粒：用于基因測序；整合質(zhì)粒：用于外源基因與宿主染色體整合；穿梭質(zhì)粒：能在兩種宿主細胞存在；表達質(zhì)粒：能表達基因產(chǎn)物117質(zhì)粒類型嚴緊型質(zhì)粒：在每個宿主細胞只能復(fù)制少數(shù)幾個拷貝的質(zhì)粒4產(chǎn)物表達形式不溶性蛋白質(zhì)：細胞質(zhì)內(nèi)形成包涵體；可溶性蛋白質(zhì)：存在于細胞質(zhì)；周質(zhì)表達：外源蛋白被運輸分泌到周質(zhì)，可溶性。有利于分離和減少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸；胞外分泌表達：胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)分泌到胞外的培養(yǎng)液中。1184產(chǎn)物表達形式不溶性蛋白質(zhì)：細胞質(zhì)內(nèi)形成包涵體；1185優(yōu)點和不足發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典的表達系統(tǒng)。具有遺傳背景清楚、目標基因表達水平高（高達70％），培養(yǎng)周期短，抗污染能力強。不能用于加工修飾化（糖基化、酰胺化）蛋白表達。細胞死亡后，細胞壁脂多糖游離出來，形成內(nèi)毒素，具有抗原性，產(chǎn)生熱源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反應(yīng)。1195優(yōu)點和不足發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典的表達系統(tǒng)。1196應(yīng)用大量外源基因能超量的表達，18種藥物上市。多肽類2種（甲狀旁腺激素(1-34)、利尿鈉肽）激素：胰島素及2種突變體、8種生長素(1種PEG化)細胞因子類：5種干擾素α（1種PEG化）、干擾素β和γ，2種G-CSF(1種PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗劑溶栓酶類：rPA白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。1206應(yīng)用大量外源基因能超量的表達，18種藥物上市。120二酵母表達系統(tǒng)1形態(tài)特征細胞：單細胞真核生物，球形、橢圓形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定條件下才產(chǎn)生子囊孢子。菌落：乳白色，有光澤，邊沿整齊。121二酵母表達系統(tǒng)1形態(tài)特征細胞：單細胞真核生物，球形、橢圓2生長與遺傳特征孢子萌發(fā)產(chǎn)生單倍體細胞，兩個性別不同的單倍體細胞結(jié)合形成二倍體接合子或營養(yǎng)細胞，進行芽殖。能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等。生長繁殖迅速，倍增期約2小時。釀酒酵母有17條染色體1996年完成其全基因組測序，遺傳背景已相當清楚?；蚪M：120.68Mb，5887個ORF，編碼約6000個基因。1222生長與遺傳特征孢子萌發(fā)產(chǎn)生單倍體細胞，兩個性別不同的單倍3優(yōu)點與不足優(yōu)點五種類型的載體，——安全、無毒。營養(yǎng)缺陷選擇外來質(zhì)粒。培養(yǎng)條件簡單、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟。亞細胞器分化，進行蛋白質(zhì)的翻譯后正確修飾和加工，并具有良好的蛋白質(zhì)分泌能力。缺點釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，制約了高密度發(fā)酵。修飾的蛋白質(zhì)糖基化側(cè)鏈過長，會引起副作用。1233優(yōu)點與不足優(yōu)點1234應(yīng)用1981年Hitzman等：酵母表達人干擾素激素類：6種人胰島素及1種突變體，尿酸水解酶和水蛭素細胞因子：GM-CSF和血小板衍生生長因子多肽類：高血糖素2種乙肝疫苗等。8種產(chǎn)品1244應(yīng)用1981年Hitzman等：酵母表達人干擾素1243.2基因工程大腸桿菌的構(gòu)建技術(shù)1253.2基因工程大腸桿菌的構(gòu)建技術(shù)125一工程菌構(gòu)建流程目標基因克隆表達載體構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化與篩選工程菌PCR、文庫、化學(xué)合成酶切、連接外源基因?qū)肱c培養(yǎng)126一工程菌構(gòu)建流程目標基因克隆表達載體構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化與篩選工程二表達載體構(gòu)建表達載體設(shè)計目標基因的定位克隆酶切反應(yīng)連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化篩選與鑒定127二表達載體構(gòu)建表達載體設(shè)計127三基因工程菌的建立過程適宜宿主菌的轉(zhuǎn)化篩選鑒定，遺傳穩(wěn)定性等。目標獲得質(zhì)粒能穩(wěn)定遺傳、基因能高效和定向表達的載體，確保藥物的生物活性。128三基因工程菌的建立過程128表達篩選與產(chǎn)物鑒定不同菌種的表達篩選誘導(dǎo)表達時間和誘導(dǎo)強度的篩選產(chǎn)物存在形式和存在場所的鑒定表達部位胞外，周質(zhì)，胞內(nèi)；包涵體，可溶性蛋白表達產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與活性鑒定電泳，SDS－PAGE，等電點電泳免疫雜交，末端測序，質(zhì)譜分析分析與目標產(chǎn)物的同一性129表達篩選與產(chǎn)物鑒定不同菌種的表達篩選1293.3基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制1303.3基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制130一培養(yǎng)基組成與控制碳源氮源無機鹽選擇劑誘導(dǎo)物131一培養(yǎng)基組成與控制碳源1311碳源大腸桿菌：蛋白胨等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源；酵母：利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質(zhì)。添加低濃度的單糖和雙糖及其他有機物如甘油等對菌體生長具有一定的促進作用。濃度稍高后就表現(xiàn)出底物抑制作用。葡萄糖優(yōu)先利用會造成培養(yǎng)基的酸化。1321碳源大腸桿菌：蛋白胨等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源；1322氮源直接很好地吸收利用銨鹽等，一般不能利用硝態(tài)氮。幾乎都能利用有機氮源。不同工程菌對氮源利用能力差異很大，具有很高的選擇性。大腸桿菌：利用大分子有機氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸為氮源1332氮源直接很好地吸收利用銨鹽等，一般不能利用硝態(tài)氮。幾乎都3、無機鹽磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量元素和鐵、銅、鋅、錳、鉬等微量元素的鹽離子形態(tài)基因工程菌生長提供必需的礦物質(zhì)。1343、無機鹽磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量元素和鐵、銅、鋅、錳、4選擇劑selectiveagent維持工程菌的純正性和質(zhì)粒的穩(wěn)定性的化合物。發(fā)酵培養(yǎng)過程中質(zhì)粒容易丟失，使之成為宿主菌。為了保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性、不丟失，根據(jù)質(zhì)粒上的營養(yǎng)缺陷或選擇性標記基因，添加或缺陷選擇劑。1354選擇劑selectiveagent維持工程菌的純正性和選擇劑種類營養(yǎng)缺陷互補和抗生素抗性。工程大腸桿菌：卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等抗生素作為選擇劑；工程酵母菌：氨基酸營養(yǎng)缺陷型，缺陷亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、色氨酸等。136選擇劑種類營養(yǎng)缺陷互補和抗生素抗性。1365誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達型工程菌：在細胞生長到一定階段，必需添加誘導(dǎo)物，以解除目標基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。誘導(dǎo)物成為產(chǎn)物表達必不可少的。Lac啟動子表達系統(tǒng)：IPTG誘導(dǎo)。甲基營養(yǎng)型酵母：加入甲醇進行誘導(dǎo)。1375誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達型工程菌：在細胞生長到一定階段，必需添加誘6培養(yǎng)基組成對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響營養(yǎng)較豐富的培養(yǎng)基，質(zhì)粒穩(wěn)定性高于合成培養(yǎng)基；限制性基質(zhì)對基因工程菌的比生長速率有不同影響；大腸桿菌對葡萄糖和磷酸鹽限制易發(fā)生質(zhì)粒不穩(wěn)定，有一些質(zhì)粒對氮源、鉀、硫等表現(xiàn)不穩(wěn)定；對于酵母，極限培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于維持質(zhì)粒穩(wěn)定性；培養(yǎng)基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。1386培養(yǎng)基組成對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響營養(yǎng)較豐富的培養(yǎng)基，質(zhì)粒穩(wěn)定二培養(yǎng)工藝與控制溫度溶解氧pH139二培養(yǎng)工藝與控制溫度1391溫度對工程菌發(fā)酵的影響生長大腸桿菌和釀酒酵母生長最低溫度為10℃；大腸桿菌生長最適溫度為37℃，最高溫度為45℃；釀酒酵母生長最適溫度為30℃，最高溫度為40℃。生產(chǎn)生長與生產(chǎn)溫度不一致；較高溫度表達包涵體，較低溫度下有利于表達可溶性蛋白質(zhì)；對于熱敏感的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)期可采用先高溫，然后低溫，變溫表達，避免蛋白質(zhì)降解。1401溫度對工程菌發(fā)酵的影響生長140溫度控制兩段變溫發(fā)酵培養(yǎng)：前期：較高溫度發(fā)酵，獲得足夠高的菌體密度；后期：較低溫培養(yǎng)發(fā)酵，對菌體合成目標產(chǎn)物的抑制不明顯，但可有效抑制目標產(chǎn)物的降解和包涵體形成，總體提高工程菌的生產(chǎn)能力。溫度誘導(dǎo)型大腸桿菌表達系統(tǒng)：生長期維持37℃，生產(chǎn)期提高溫度42℃。141溫度控制兩段變溫發(fā)酵培養(yǎng)：1412pH值對發(fā)酵的影響細菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜pH為6.5～7.5，真菌喜歡微酸性：酵母適宜pH為5.0～6.0。影響產(chǎn)物穩(wěn)定性，最適生長和最適生產(chǎn)pH不同。干擾素是在酸性條件下穩(wěn)定，而在堿性條件下容易降解。酸性環(huán)境有利于發(fā)揮菌株生產(chǎn)能力。乙酸的產(chǎn)生使菌體生長速率下降，也抑制基因表達。1422pH值對發(fā)酵的影響細菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜pH為6.pH控制了解發(fā)酵過程中各個階段的適宜pH以后，需要進一步設(shè)法控制pH在合適的范圍內(nèi)。分階段控制pH：根據(jù)試驗結(jié)果來確定生長最適pH和產(chǎn)物最適pH，以達到最佳生產(chǎn)。143pH控制了解發(fā)酵過程中各個階段的適宜pH以后，需要進一步設(shè)法3溶解氧控工程菌是好氧微生物，生長過程需要大量氧。從供應(yīng)量和需要量（菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累）二個方面考慮，使之需氧不超過設(shè)備的供氧能力?？紤]溶氧對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量來調(diào)控1443溶解氧控工程菌是好氧微生物，生長過程需要大量氧。144三終點控制根據(jù)目標基因產(chǎn)物的表達模式而定。適宜的誘導(dǎo)時間：非常重要誘導(dǎo)物的濃度及其發(fā)酵溫度：影響表達量，產(chǎn)物存在形式在生產(chǎn)中應(yīng)嚴格控制。145三終點控制根據(jù)目標基因產(chǎn)物的表達模式而定。1451化學(xué)誘導(dǎo)表達化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子：lac、tac、T7等誘導(dǎo)時間：對數(shù)生長期細菌：IPTG誘導(dǎo)甲基營養(yǎng)型酵母：甲醇誘導(dǎo)。1461化學(xué)誘導(dǎo)表達化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子：lac、tac、T7等142溫度誘導(dǎo)表達溫度誘導(dǎo)型啟動子：PL、PR啟動子兩段培養(yǎng)發(fā)酵：誘導(dǎo)時間：菌體生長的對數(shù)期或稍后一些，升高溫度，合成產(chǎn)物。1472溫度誘導(dǎo)表達溫度誘導(dǎo)型啟動子：PL、PR啟動子1473.4重組人干擾素生產(chǎn)工藝1483.4重組人干擾素生產(chǎn)工藝148一干擾素概述概念：（interferon，IFN）機體受到病毒感染時，免疫細胞產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的細胞因子功能：干擾病毒在細胞內(nèi)的繁殖天然干擾素分類：I干擾素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNε、IFNωII干擾素：IFNγ上市重組干擾素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ研發(fā)中的重組干擾素：IFNω，臨床階段149一干擾素概述概念：（interferon，IFN）機體受到重組干擾素的臨床應(yīng)用廣譜抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFNα）毛細胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性——治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFNγ）多發(fā)性硬化癥rhuIFNβ150重組干擾素的臨床應(yīng)用廣譜抗病毒活性（rhuIFNα）150干擾素生產(chǎn)工藝路線體外誘生干擾素制備工藝：Sendai病毒誘導(dǎo)人白細胞人源轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝基因工程大腸桿菌假或單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝動物無限細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝151干擾素生產(chǎn)工藝路線體外誘生干擾素制備工藝：Sendai病毒誘二生產(chǎn)過程工程菌的構(gòu)建發(fā)酵過程產(chǎn)物分離和純化152二生產(chǎn)過程工程菌的構(gòu)建1521工程菌的構(gòu)建第一步：干擾素α-2b基因的克隆第二步：表達載體的構(gòu)建第三步：工程菌的構(gòu)建1531工程菌的構(gòu)建第一步：干擾素α-2b基因的克隆1532干擾素的發(fā)酵工藝過程工作菌種庫藥瓶培養(yǎng)種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)菌體收集1542干擾素的發(fā)酵工藝過程工作菌種庫藥瓶培養(yǎng)種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)菌3干擾素的分離純化工藝過程(1)菌體裂解裂解緩沖液：純化水，2℃～10℃（pH7.5）；使用保護劑：EDTA，PMSF；破碎－20℃菌體：2厘米；攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2h；凍融:細胞完全破裂，釋放干擾素。1553干擾素的分離純化工藝過程(1)菌體裂解155(2)預(yù)處理加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。離心連續(xù)流離心機：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。156(2)預(yù)處理加絮凝劑聚乙烯亞胺:156(3)初級分離鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻靜置過夜。離心：連續(xù)流離心機，16000r/min。保存：收集沉淀，粗干擾素，4℃。157(3)初級分離鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻靜置過(4)干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝158(4)干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素158本章結(jié)束159本章結(jié)束159第4章動物細胞培養(yǎng)制藥工藝160第4章動物細胞培養(yǎng)制藥工藝160本章內(nèi)容4.1制藥動物細胞4.2動物細胞的生產(chǎn)特征4.4動物細胞培養(yǎng)技術(shù)4.5重組人紅細胞生成素的生產(chǎn)工藝161本章內(nèi)容4.1制藥動物細胞1614.1制藥動物細胞1624.1制藥動物細胞162一動物細胞的結(jié)構(gòu)與功能動物細胞的結(jié)構(gòu)與功能細胞膜細胞質(zhì)細胞核沒有細胞壁亞細胞器163一動物細胞的結(jié)構(gòu)與功能動物細胞的結(jié)構(gòu)與功能細胞膜163動物細胞培養(yǎng)的代謝特征葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代謝的前體。葡萄糖限制葡萄糖限制：通過增加谷氨酰氨消耗得以補償，反之通過增加谷氨酰氨消耗得以補償，反之亦然。葡萄糖代謝：糖酵解為主，，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累。另一條途徑為TCA循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生CO2和水。一小部分為戊糖磷酸途徑，生成生成4、5、7碳糖和NADPH。中間產(chǎn)物進入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。葡萄糖代謝旺盛，產(chǎn)生大量乳酸，對細胞有毒性。164動物細胞培養(yǎng)的代謝特征葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代謝的前體Gln代謝：脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。Gln氮源，Gln受限，增加其他氨基酸消耗以補償。離體動物細胞系，轉(zhuǎn)氨作用是主要代謝途徑。谷氨酰胺在脫氨酶的催化下，脫氨產(chǎn)生氨，對細胞有毒性。谷氨酰氨與丙酮酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸，進入培養(yǎng)液并積累。Gln能量：Glu轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，進入TCA循環(huán)。流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整個代謝過程，避免有毒廢物的積累。165Gln代謝：脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。1蛋白質(zhì)糖基化與分泌表達蛋白質(zhì)合成場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體糖基化場所：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成各種糖類，粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)和高爾基體，加工修飾。不同細胞系糖基化特征不同，選擇適宜細胞系。對于分泌型蛋白，分泌泡與細胞膜融合，釋放到胞外，完成了蛋白質(zhì)的分泌表達。166蛋白質(zhì)糖基化與分泌表達蛋白質(zhì)合成場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體二制藥動物細胞的種類目前用于制藥的動物細胞有4類：原代細胞系二倍體細胞系異倍體細胞系融合的或重組的工程細胞系167二制藥動物細胞的種類目前用于制藥的動物細胞有4類：167細胞系分類來源：原代細胞，傳代細胞。壽命：有限細胞系，無限細胞系。染色體數(shù)目：二倍體細胞系，異倍體細胞系。獲得方式：工程細胞系，癌變細胞系。生長特性：貼壁依賴型，非貼壁依賴型細胞系。168細胞系分類來源：原代細胞，傳代細胞。1684.2動物細胞的生產(chǎn)特征1694.2動物細胞的生產(chǎn)特征169一對培養(yǎng)條件要求嚴格動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感無細胞壁保護，細胞膜直接接觸外界。物理化學(xué)因素：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力等耐受力很弱，容易受傷害。與細菌和植物細胞相比，動物細胞培養(yǎng)條件要求嚴格地多。170一對培養(yǎng)條件要求嚴格動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感1701溫度哺乳動物細胞最佳培養(yǎng)溫度為37℃雞細胞為39℃～40℃；昆蟲類細胞為25℃～28℃。耐受溫度范圍較窄，35℃～37℃細胞受傷：39℃～40℃1小時，但能恢復(fù)。受傷嚴重：41℃～42℃，部分可恢復(fù)。死亡：43℃以上。1711溫度哺乳動物細胞最佳培養(yǎng)溫度為37℃1712氧氣動物細胞生長必須有氧氣，缺氧時不能生存。離體培養(yǎng)的氣體：含有5％CO2和95％空氣，其中氧濃度為中氧濃度為21％。高氧環(huán)境：O2濃度60%以上，對細胞毒性較大，抑制生長和增殖，出現(xiàn)染色體異常等現(xiàn)象。有時充以有時充以N2氣稀釋O2濃度。1722氧氣動物細胞生長必須有氧氣，缺氧時不能生存。1723pH值低于6.8或超過7.6會對細胞產(chǎn)生嚴重影響甚至使細胞死亡。機體細胞的pH范圍為6～8，而且在血液和體液中，變化范圍很小。人體：血液pH比較恒定，7.36～7.44。低于7.05發(fā)生酸中毒，高于7.45發(fā)生堿中毒。1733pH值低于6.8或超過7.6會對細胞產(chǎn)生嚴重影響甚至4滲透壓正常血漿滲透壓為280～310mOsm/kg高滲溶液：高于310mOsm/kg低滲透壓溶液：低于280mOsm/kg。動物細胞對滲透壓有較強的耐受性離體培養(yǎng)細胞的滲透壓應(yīng)控制為等滲透溶液。增減NaCl的濃度調(diào)整滲透壓，每增加1mg/mlNaCl，滲透壓增加32mOsm/kg。1744滲透壓正常血漿滲透壓為280～310mOsm/kg17二對培養(yǎng)基組成要求高動物細胞對培養(yǎng)基的要求高完全異養(yǎng)，容易利用、相對低分子量的營養(yǎng)物12中必需氨基酸8種以上維生素多種無機鹽和微量元素多種附加成分：生長類、細胞因子和貼壁因子因子及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)能源：單糖，葡萄糖，谷氨酰氨氮源：氨基酸單體化合物175二對培養(yǎng)基組成要求高動物細胞對培養(yǎng)基的要求高175三天然結(jié)構(gòu)與活性的藥物完善的翻譯后蛋白質(zhì)修飾功能游離核糖體：合成細胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)。與膜結(jié)合的核糖體：合成分泌性和膜整合蛋白，多數(shù)為糖蛋白。修飾：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工，高爾基體加工、轉(zhuǎn)運、分泌，糖鏈。糖基化、磷酸化、酰胺化等。活性分子：裝配折疊形成精確的三維結(jié)構(gòu)。176三天然結(jié)構(gòu)與活性的藥物完善的翻譯后蛋白質(zhì)修飾功能176四生產(chǎn)工藝特征產(chǎn)品與天然的產(chǎn)物一致：適于臨床使用動物細胞生產(chǎn)：70％蛋白質(zhì)藥物。培養(yǎng)工藝：難度大，產(chǎn)量低，成本高。胞外分泌產(chǎn)物：分離純化簡單。有潛在的血源性污染危險。177四生產(chǎn)工藝特征產(chǎn)品與天然的產(chǎn)物一致：適于臨床使用1774.3動物細胞培養(yǎng)技術(shù)1784.3動物細胞培養(yǎng)技術(shù)178一細胞生長和基質(zhì)依賴性生長基質(zhì)接觸抑制貼壁依賴性細胞非貼壁依賴性細胞兼性貼壁細胞179一細胞生