玉米超氧化物歧化酶的提取及活性測(cè)定

玉米超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活性測(cè)定一、目的通過(guò)對(duì)玉米超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活性測(cè)定，掌握硫酸銨鹽析沉淀蛋白質(zhì)和超濾濃縮的方法和原理。掌握測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）的活力和比活力的方法。掌握分級(jí)鹽析沉淀的方法和原理，以及透析的方法和原理。二、原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,簡(jiǎn)稱SOD）,它廣泛存在于各類生物體內(nèi)，按其所含金屬離子的不同，可分為3種：Cu,Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD。SOD催化如下反應(yīng)：O：+O2-+2H+S°D》HO+O,22222在生物體內(nèi)，它是一種重要的自由基清除劑，能治療人類多種病癥，如炎癥、腦外傷、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老等，對(duì)生物體有保護(hù)作用。在玉米中，SOD主要存在于胚芽中，當(dāng)將萌發(fā)的玉米籽粒打漿破碎后，以中性鹽沉降其蛋白質(zhì)部分，SOD就存在于沉淀中，但其中有許多雜蛋白，因此在鹽析時(shí)先用40%（NH4）2SO4去除雜蛋白部分，再用90%（NH4）2SO4飽和上清液，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，再將鹽析液離心，取其沉淀進(jìn)行透析，一定時(shí)間后，則其中的SOD成分即被濃縮分離。超濾也是一種蛋白質(zhì)濃縮方法，其工作原理是運(yùn)用液壓迫使溶質(zhì)透過(guò)膜，并按溶質(zhì)分子量、形狀、大小的差異，把大溶質(zhì)分子阻留在膜的一側(cè)，而小分子溶質(zhì)則隨溶劑透過(guò)膜到另一側(cè)，使大小溶質(zhì)分子得到分離。利用此原理只要選擇適當(dāng)?shù)某瑸V膜即可將玉米漿中SOD與其它小分子雜蛋白、可溶性糖等分離，并去除水份，得到SOD濃縮液。SOD活性的測(cè)定：采用NBT光還原法。其原理為核黃素在有氧條件下能產(chǎn)生超氧自由基負(fù)離子O2-，當(dāng)加入NBT后，在光照條件下，與超氧自由基反應(yīng)生成單甲月替（黃色），既而還原成二甲月替（呈蘭色）。該產(chǎn)物在560nm下有最大吸收峰。當(dāng)加入SOD時(shí)，可以使超氧自由基與H+結(jié)合生成H2O2+O2,從而抑制了NBT光還原的進(jìn)行，使蘭色二甲月替生成速度減慢。通過(guò)加入不同量的SOD，一定時(shí)間后測(cè)定560nm光密度的變化，求出抑制NBT光還原的50%的酶液量作為一個(gè)酶活力單位。三、主要實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器實(shí)驗(yàn)材料：玉米籽粒。試劑：注意配好每一試劑時(shí)，應(yīng)立即轉(zhuǎn)入試劑瓶當(dāng)中，不要將試劑放在容量瓶當(dāng)中存放，一定要及時(shí)將試劑瓶貼好相應(yīng)的標(biāo)簽，標(biāo)明溶液的濃度、pH值、體積、試劑名稱、配制時(shí)間、配制人。配制時(shí)一定要標(biāo)清，使用時(shí)注意不要將其弄掉，這一點(diǎn)將給您帶來(lái)無(wú)比的快捷和方便。在未經(jīng)老師允許的情況下，不要隨意倒掉實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的任何藥品或試劑。不要隨意亂動(dòng)儀器的開關(guān)及旋紐等，否則損壞全額賠償。（1）1%次氯酸鈉：用移液管準(zhǔn)確吸取4mL次氯酸鈉，置于500mL大燒杯中，再用量筒準(zhǔn)確量取400mL自來(lái)水稀釋該次氯酸鈉。（2）提取緩沖液：0?05mol/L磷酸氫二鉀一磷酸二氫鉀緩沖液，pH7?8。具體配制方法如下：首先是1mol/LpH7.8的磷酸鉀緩沖液母液的配制。1mol/LKH2PO4溶液：稱取13?6gKH2PO4，置于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。1mol/LK2HPO4溶液：稱取22.8gK2HPO4，置于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，可稍加熱，移入100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。取5mLa液與55mLb液混合后，調(diào)節(jié)pH為7.8，該液即為1mol/L的磷酸鉀緩沖液母液。0.05mol/LpH7.8磷酸鉀緩沖液的配制(內(nèi)含1mmol/LEDTA及0.1%。-巰基乙醇)：稱取EDTA-2Na-2H2O0.372g置于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入1000mL容量瓶中，用移液管吸取1mLp-M基乙醇置入該1000mL容量瓶中，用50mL量筒量取50mLc液至該1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。測(cè)試緩沖液：0.026mol/LMeL磷酸鈉緩沖液具體配制方法：首先是0?1mol/LpH7.8Na2HPO4—NaH2PO4緩沖液母液的配制。稱取Na2HPO4?12H2O(MW=358.14)35.814g于100mL小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，移入1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。稱取NaH2PO4?2H2O(MW=156.01)1.56g于50mL小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。量取915mLa液與85mLb液混合后，該液即為0.1mol/LpH7.8的磷酸鈉緩沖液母液。稱取L-Met(MW=149.2)0.1941g于50mL小燒杯中，用少量0.1mol/LpH7.8磷酸鈉緩沖液溶解后，移入50mL容量瓶中，用0.1mol/LpH7.8磷酸鈉緩沖液定容至刻度。7.5X10-4mol/L氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)稱取NBT(MW=817.7)0.0613g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移至100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度(最好現(xiàn)用現(xiàn)配，也可貯于冰箱中用2~3d)。2X10-smol/L核黃素溶液稱取EDTA(MW=292)0.00292g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解。稱取核黃素(MW=376.36)0.0735g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解。合并a液和b液，移入100mL容量瓶中，并充分用蒸餾水洗凈上述a和b兩個(gè)小燒杯，將洗液移入該容量瓶中，再用蒸餾水定容至刻度(含EDTA0.1mmoL核黃素2mmol)。貯于冰箱中，避光保存。測(cè)定酶活臨用前，將c液稀釋100倍，即為2X10-5mol/L核黃素溶液。苯甲酸鈉：1瓶。BaC以1瓶。(NH4)2SO4：500g/瓶,1瓶/大組。儀器：天平3臺(tái)，膠體磨1臺(tái)，超濾器(0?5m2)1臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱1臺(tái)，高速冷凍離心機(jī)1臺(tái)，可見分光光度計(jì)5臺(tái)，光照箱3臺(tái)，移液管架5個(gè)，移液管(10mL，5mL，2mL，1mL，0.5mL，0.2mL各10支)，微燒杯(10-15mL)130個(gè)，量筒(100mL，50mL，1000mL各3個(gè))，容量瓶(100mL，50mL各10個(gè))，燒杯(100mL，250mL各5個(gè))，125mL棕色試劑瓶12個(gè)，125mL白色試劑瓶10個(gè)，1000mL白色試劑瓶6個(gè)，1000mL棕色試劑瓶5個(gè)，紗布等。四、操作方法SOD粗提液的制備取200g玉米籽粒用自來(lái)水洗凈后，用1%次氯酸鈉400mL漂洗10min消毒后，然后用自來(lái)水徹底洗凈，置于器皿中，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中浸泡吸脹24h后，用自來(lái)水洗凈，去掉多余的水分，用四層紗布蒙好，置于28C恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽24h后，用自來(lái)水洗凈，再用蒸餾水潤(rùn)洗一次后，進(jìn)行扒胚，不要求胚的完整性，將胚置于大研缽中，用0.05mol磷酸氫二鉀一磷酸二氫鉀提取緩沖液50mL，另外加入1g苯甲酸鈉，在研缽中充分研磨，再加0.05mol磷酸氫二鉀一磷酸二氫鉀提取緩沖液50mL，勻漿，在室溫下輕輕攪拌4次/h，浸提1h，8500r/min離心20min，棄沉淀，所得上清液用四層紗布過(guò)濾以除去漂浮物，即為酶的粗提液。將上述粗酶液稱量總體積后，再留取10mL粗酶液，用于測(cè)定鹽析前的酶活力及比活力和實(shí)驗(yàn)九的電泳。SOD濃縮（1）鹽析將上述剩余的酶粗提液先以40%（NH4）2SO4飽和1h,8500r/min離心20min去除沉淀，留取上清液，再用90%（NH4）2SO4鹽析24h,8500r/min離心40min，棄去上清液，沉淀用0?05mol/LpH7.8磷酸氫二鉀一磷酸二氫鉀提取緩沖液5mL重溶，以蒸餾水透析過(guò)夜。將透析液8500r/mim離心20min后，棄沉淀，留取上清液，并量取其體積，即為酶濃縮液。用于測(cè)定透析后的酶活力及比活力與濃縮倍數(shù)及回收率，以及用于實(shí)驗(yàn)九的電泳。（2）超濾濃縮取酶粗提液經(jīng)0.5m2超濾器（膜的截留分子量為1萬(wàn)）濃縮后，量取體積，計(jì)算酶活力、比活力、濃縮倍數(shù)及回收率。SOD活性測(cè)定表反應(yīng)體系中各試劑及酶液的取量杯號(hào)（單位均為mL）試劑3(Met)蒸餾水試劑4(NBT)酶液（玉米SOD）試劑5（核黃素）11.50.90.300.321.50.90.300.331.50.90.300.341.50.850.30.050.351.50.800.30.100.361.50.750.30.150.371.50.700.30.200.381.50.650.30.250.3注：酶液為鹽析前的和透析后的兩個(gè)樣品，一個(gè)為粗酶液，一個(gè)為濃縮液。取8個(gè)微燒杯，編好號(hào)后，以反應(yīng)系統(tǒng)總體積為3.0mL計(jì)算，按上表加入各試劑及酶液。試劑加入后充分混勻，取1號(hào)微燒杯放入暗處作為空白（調(diào)零時(shí)用）。其它7個(gè)微燒杯放入4500Lux日光燈照射下啟動(dòng)反應(yīng)，15min后遮光終止反應(yīng)。在560nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度，以2,3號(hào)杯的OD值計(jì)算出不同酶液量在其反應(yīng)系統(tǒng)中抑制NBT光還原的相關(guān)百分率。然后以所加酶液量為橫坐標(biāo)，以抑制百分率為縱坐標(biāo)作圖，畫出兩者的相關(guān)曲線，找出50%抑制率的酶液量，此酶液量即為一個(gè)酶活力單位。五、結(jié)果計(jì)算g、心5、酶液總體積（mL）X稀釋倍數(shù)總酶活力（U/g）=抑制50%的酶液量（mL）X樣品重（g）一抑制率=—D-D2—X100%D1比活力（U/mg）=酶活力（U）其中：D1為總蛋白mg數(shù)2、3號(hào)杯的平均OD值；D2為加入不同酶液量的OD值。其中：D1為古濃縮后酶活力（U）…5回收率—e、X100%總酶活力（U）提純倍數(shù)=濃縮囂活力駕'

濃縮前比活力（U/mg）六、討論思