血凝和血凝抑制試驗

關(guān)于血凝和血凝抑制試驗第1頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六主要內(nèi)容一、基本概念二、HA和HI實驗在禽病診斷中的作用三、基本操作四、注意事項第2頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六一、基本概念1、血凝試驗(HA)1.1定義某此病毒或病毒的血凝素，能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細胞的現(xiàn)象稱為血凝(hemagglutination，HA)，也稱直接血凝反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計的試驗稱血凝試驗(HA)。常見于正粘病毒（如AIV）、副粘病毒（如NDV）和某些黃病毒（如JEV）、痘病毒、以及經(jīng)過處理過后的IBV。第3頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六1.2血凝類型：(1)可逆轉(zhuǎn)型

血凝素與病毒顆粒易分開，經(jīng)超速離心后，病毒顆粒沉淀于管底，血凝素則游離于上清液內(nèi)。這種血凝素凝集紅細胞的現(xiàn)象是可逆的，即被凝集的紅細胞釋放了吸附于表面的血凝素后，可再與該血凝素發(fā)生凝集。如天花、鼠疫等病毒。第4頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六(2)不可逆轉(zhuǎn)型

血凝素與病毒顆粒結(jié)合得比較緊密，不經(jīng)過特殊處理血凝素不能與病毒顆粒分開，這種病毒引起的紅細胞凝集，是不可逆轉(zhuǎn)的。在一定的溫度(37℃)下，病毒釋放出一種能破壞紅細胞表面受體糖苷鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸酶，當病毒顆粒從紅細胞表面游離出來后紅細胞表面受體已被破壞而失去了再凝集病毒的能力。如流感病毒、雞新城疫病毒等。

第5頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六(3)凝集條件嚴格型

有些病毒及其血凝素凝集紅細胞的條件很嚴格，不僅對不同種動物的紅細胞有嚴格的選擇，即是對同種動物，由于性別和年齡的不同，對紅細胞的凝集性能亦有差異（如JEV對公鵝的紅細胞凝集性能比對經(jīng)產(chǎn)老齡母鵝的紅細胞凝集性能好）。除此之處，還對緩沖液的pH值、溫度及鹽濃度等的要求均很嚴格。第6頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六1.3原理血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如:痘病毒對雞的紅細胞發(fā)生凝集并非是病毒本身，而是痘病毒的產(chǎn)物--類脂蛋白的作用。流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素與紅細胞表面的受體糖蛋白相互吸附而發(fā)生的。第7頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六第8頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六2、血凝抑制試驗(HI)

2.1定義當病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲?，則紅細胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯咏佑|。這時紅細胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細胞凝集抑制(hemagglutinationinhibiion，HI)反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計的試驗稱血凝試驗(HI)。該試驗是目前WHO進行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗方法。

第9頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六2.2原理特異性抗體與相應(yīng)病毒結(jié)合，使病毒失去凝集紅細胞的能力，從而抑制血凝現(xiàn)象。第10頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六二、HA和HI實驗在禽病診斷中的作用1、用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鑒定根據(jù)抗原與相應(yīng)抗體的特異性中和反應(yīng)原理，給未知病毒懸液中加入已知的抗禽流感病毒陽性血清或已知的抗新城疫病毒陽性血清，相應(yīng)病毒便喪失了其凝集紅細胞的能力。因此，可利用從發(fā)病的雞、鴨、鵝體內(nèi)分離的病毒作HA和HI試驗。病毒懸液能凝集紅細胞，并且能被已知的抗血清（陽性血清）所抑制，那么該病毒即是已知陽性血清相對應(yīng)的病毒。如用新城疫陽性血清完全抑制了未知病毒培養(yǎng)物的血凝性，那么，這個未知病毒培養(yǎng)物就是新城疫病毒；如果病毒懸液雖然能凝集雞紅細胞，但不能被雞新城疫血清所抑制，說明不是雞新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。第11頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六2、HI試驗可用于發(fā)病禽群的診斷雞、鴨、鵝規(guī)?；B(yǎng)殖中雖進行相關(guān)疫病疫苗的免疫，但往往有部分家禽由于各種原因免疫力水平達不到要求，因而造成某些傳染病的流行。由于免疫禽群發(fā)病時臨床癥狀和病變不典型，給確診帶來困難。采用HI試驗對雞群中禽流感、新城疫等抗體進行測定，依據(jù)抗體滴度的高低和離散性有助于診斷。例如：經(jīng)新城疫活苗加滅活苗免疫過的雞群，新城疫抗體水平平均為7Log2～8Log2，最高為10Log2。而新城疫感染雞群中HI抗體部分高達11Log2～13Log2；就抗體分布而言，雞新城疫免疫雞群抗體水平呈正態(tài)分布，HI抗體在10Log2以上者僅占10％以下，4Log2以下者在1％以下。而感染了新城疫強毒并出現(xiàn)發(fā)病的雞群，HI抗體中10Log2以上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之間。因此，依據(jù)禽群的抗體水平高低和分布，結(jié)合臨床癥狀和病、死雞的剖檢變化，可診斷禽群是否患有新城疫或禽流感等。

第12頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六3、對禽群的免疫狀態(tài)進行評價

禽群或個體血清中的HI抗體水平與疫苗的免疫和對相應(yīng)強毒侵襲的抵抗力都有密切關(guān)系。以新城疫為例，當HI抗體在7Log2以上進行活苗免疫時，由于高抗體可中和絕大部分的疫苗病毒，產(chǎn)生的免疫力很弱；HI抗體在5Log2～6Log2時，活苗免疫效果也受到一定的干擾；當HI抗體在4Log2以下時，活苗免疫效果良好，但對強毒感染抵抗力下降。一般認為，成年雞新城疫的HI抗體水平在5Log2以上時，保護率在90％以上，4Log2以下時只有50％的雞對強毒有抵抗力，2Log2以下時80％以上的雞易感染新城疫。由于雛雞母源抗體對疫苗首次免疫效果影響很大，了解母源抗體水平對疫苗免疫有重要意義。研究表明，母雞血清抗體、卵黃抗體和5日齡雛雞母源抗體三者之間有相關(guān)性，卵黃抗體與母雞血清抗體基本一致，而1日齡雛雞血清抗體低于卵黃抗體一個滴度，可檢測種雞卵黃抗體、估測1日齡雛雞母源抗體水平。

雛雞新城疫母源抗體半衰期約為5天，免疫臨界點為3Log2，這樣可依據(jù)抗體水平，確定最佳免疫時間。第13頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六三、實驗步驟

（以禽流感為例，參照禽流感防治技術(shù)規(guī)范）

1阿氏（Alsevers）液配制稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?。?4頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六21%雞紅細胞液的制備2.1采血用注射器吸取阿氏液約1mL，取至少2只SPF雞（如果沒有SPF雞，可用常規(guī)試驗證明體內(nèi)無禽流感和新城疫抗體的雞），采血約2～4mL，與阿氏液混合，放入裝10mL阿氏液的離心管中混勻。2.2洗滌雞紅細胞將離心管中的血液經(jīng)1500～1800r/min離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液，輕輕混合，再經(jīng)1500～1800r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，再重復2次以上過程后，加入阿氏液20mL，輕輕混合成紅細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆?，不超過5天。2.310%雞紅細胞懸液取阿氏液保存不超過5天的紅細胞，在錐形刻度離心管中離心1500～1800r/min8分鐘，棄去上清液，準確觀察刻度離心管中紅細胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的PBS，用吸管反復吹吸使PBS與紅細胞混合均勻。2.41%雞紅細胞液取混合均勻的10%雞紅細胞懸液1mL，加入9mLPBS，混合均勻即可。第15頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六3抗原血凝效價測定（HA試驗，微量法）3.1在微量反應(yīng)板的1孔～12孔均加入25μLPBS，換滴頭。3.2吸取25μL病毒懸液加入第l孔，混勻。3.3從第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔，混勻后吸取25μL加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取25μL棄之，換滴頭。3.4每孔再加入25μLPBS。3.5每孔均加入25μL體積分數(shù)為1%雞紅細胞懸液（將雞紅細胞懸液充分搖勻后加入）3.6振蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下反應(yīng)1小時）。對照孔紅細胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。第16頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六3.7結(jié)果判定將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果將板傾斜（45度左右），觀察血凝板，判讀結(jié)果：

++++：紅細胞全部凝集，均勻鋪于孔底，即100%紅細胞凝集＋＋＋：紅細胞凝集基本同上，但孔底有大圈＋＋：紅細胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝塊＋：紅細胞于孔底形成小圓點，四周有少許凝集塊－：紅細胞于孔底呈小圓點，邊緣光滑整齊，即紅細胞完全不凝集能使紅細胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為1個血凝單位（HAU）。注意！對照孔應(yīng)呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗無效第17頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六4、血凝抑制試驗（HI試驗微量法）4.1根據(jù)3的試驗結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。4.2在微量反應(yīng)板的1孔～11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS。4.3吸取25μL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸25μL于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取25μL棄去。4.41孔～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液25μL，室溫（約20℃）靜置至少30min。4.5每孔加入25μL體積分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進行），對照紅細胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。4.6結(jié)果判定以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于21og2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結(jié)果才有效。HI價小于或等于21og2判定HI試驗陰性；HI價等于31og2為可疑，需重復試驗；HI價大于或等于41og2為陽性。第18頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六四、注意事項目前在禽流感血凝抑制試驗方面存在很多問題，會對血凝抑制試驗的意義造成影響從而導致不正確的結(jié)果。第19頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六1、注意抗原相的差異實踐中，經(jīng)常會出現(xiàn)不同廠家生產(chǎn)的相同亞型的禽流感抗原所測同一血清的血凝抑制價不同，這是由于禽流感病毒變異較快，存在抗原相的差異。禽流感病毒株按其血凝抑制試驗中所表現(xiàn)的親和力不同而分為三種類型：對本株和異株免疫血清均呈較高效價的為“R”相；對本株效價高對異株低的為“P”相；對本株及異株均低的為“Q”相。如果在試驗中出現(xiàn)相的差異，所測結(jié)果會相差2-3個滴度，所以在血凝抑制試驗操作時，挑選親和相毒株作為測定抗原較好，這樣會提高診斷的靈敏度。第20頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六2、注意消除非特異性因素

禽類血清中，尤其是水禽血清，往往含有非特異性血凝抑制因子，在做禽流感血凝抑制試驗時會出現(xiàn)2-3孔有凝集現(xiàn)象。因此，在利用血凝抑制試驗進行血清抗體測定之前，有必要對血清中非特異性因子進行排除。第21頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六常用消除方法（FAO推薦）1、雞的紅細胞吸附法1.1試劑雞的紅細胞：要充分洗滌；PBS：pH7.5，4℃保存；陽性對照血清；陰性對照血清。1.2方法加入25μL雞的紅細胞到100μL血清中；4℃，用微量振蕩器振蕩20-30min；加入100μL滅菌PBS(用RDE處理的血清除外)；4000轉(zhuǎn)離心1min；取出上清，進行HI試驗；用陽性對照血清和陰性對照血清驗證處理的徹底性用于消除除雞以外的其它禽類的血清非特異性反應(yīng)。第22頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六2、RDE（受體裂解酶）消除法2.1試劑：RDE：用20mL無菌PBS稀釋，小量分裝，-20℃保存一周，注意避免反復凍融；PBS：pH7.5，4℃保存；陽性對照血清；陰性對照血清。2.2方法：雞血清加3倍體積的RDE到1倍體積的血清中；充分混合；56℃水浴30-60min;加入6倍體積于血清體積的PBS。其它禽類血清依據(jù)用RDE處理雞血清方法處理后，繼續(xù)按下列方法進行：用25-5μL雞的紅細胞到500μL血清中；4℃，用微量振蕩器振蕩20-30min；4000轉(zhuǎn)離心1min。第23頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六3、熱滅活法3.1雞血清取100μL血清樣品放入一滅菌離心管中；各取100μL陽性血清和陰性血清加入到另2個滅菌離心管中；56℃水浴30min。3.2其它禽類血清血清用雞的紅細胞處理后，分別取100μL樣品、陽性血清、陰性血清放入滅菌離心管中，56℃水浴30min。熱滅活是一種排除非特異性因子的有效方法，但對特異性抗體破壞較大。

第24頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六采用1%同源禽種紅細胞作為指示細胞進行水禽血清抗體效價測定，將結(jié)果降低1個滴度作為測定結(jié)果（朱燕秋等《中國獸醫(yī)雜志》2009，45（2）42-43）。第25頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六3、注意抗原的標定在禽流感血凝抑制試驗中抗原標定至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)?？乖渲仆旰?，需對所配制的抗原進行標定，看所配制的抗原是否達到所需標準，如工作抗原效價過高或過低對結(jié)果都有一定的影響。過高，測定抗體效價偏低；過低，測定效價過高，甚至很高。所以在禽流感血凝抑制試驗中必須對抗原進行標定。第26頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六第27頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六4、注意嚴格規(guī)范操作在進行試驗操作時很容易出現(xiàn)錯誤，所以進行實驗時一定要嚴格操作，每次測定應(yīng)有嚴格的溫度范圍和作用時間，出現(xiàn)錯誤時要認真查找原因，以免類似錯誤再次出現(xiàn)。以下是容易出現(xiàn)的錯誤：第28頁，共35頁，2022年，5月20日，4點56分，星期六（1）對照孔凝集鹽類凝集：所謂鹽類凝集即稀釋液中氯化鈉達至一定高濃度時，即使沒有血清抗體也能發(fā)生凝集反應(yīng)。當生理鹽水被細菌污染時