聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)

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聚丙烯酰胺凝膠電泳

分離血清蛋白質(zhì)

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑四甲基乙二胺(TEMED)和催化劑過硫酸銨((NH4)2S2O8，AP)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。實(shí)驗(yàn)原理TEMED（加速劑）過硫酸銨硫酸根自由基（催化劑）

Acr（雙鏈）Acr（長(zhǎng)鏈）+Bis(交聯(lián)劑)

PAG凝膠

聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)。電荷效應(yīng)（電泳物所帶電荷的差異性）濃縮效應(yīng)（四個(gè)不連續(xù)性形成）分子篩效應(yīng)（凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的大小形狀不同所致）不連續(xù)體系由凝膠層、緩沖液離子成分、電位梯度、pH因素所組成。濃縮膠是大孔徑，分離膠是小孔徑；Cl-為快離子、甘氨酸根離子為慢離子、Tris為緩沖配對(duì)離子,Cl->Pr>Gly-;濃縮膠緩沖液為pH6.7，分離膠緩沖液為pH8.9；電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液;電位梯度的差異是自動(dòng)形成的，在快離子與慢離子之間形成電位梯度，由于Pr的有效遷移率介于快慢離子之間故也就聚集在這個(gè)移動(dòng)的界面附近，被濃縮成狹小的中間層；2種孔徑的凝膠、3種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了，樣品得到濃縮。

樣品濃縮效應(yīng)(a)凝膠孔徑不連續(xù)性：(b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性；在pH6.7的凝膠緩沖體系中前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-)

尾隨離子或慢離子：甘氨酸根當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)；（c)電位梯度的不連續(xù)性：分子篩效應(yīng)分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。電荷效應(yīng) 電荷量不同，遷移率不同。實(shí)驗(yàn)儀器

電泳裝置穩(wěn)壓電源盤狀電泳槽

刻度吸量管

玻璃管和橡膠帽

培養(yǎng)皿

微量移液器

脫色搖床

注射器和長(zhǎng)針頭實(shí)驗(yàn)試劑丙烯酰胺(Acr)和甲叉雙丙烯酰胺(Bis)Acr的重結(jié)晶Bis重結(jié)晶（注意固體Acr和Bis應(yīng)貯存應(yīng)貯存棕色瓶中，在干燥、低溫和暗處保存，并注意避免超聲波、γ-輻射和自然光的照射）

TEMED-四甲基乙二胺，避免冰箱保存。過硫酸銨(不能潮解，否則不能用)

染色液：用0.05NNaOH配制0.1％溴酚蘭液洗脫液：7％醋酸其他試劑：見下表貯存液的配制。按表1配制各貯存液置冰箱中貯存，可放1—2月（但過硫酸銨液貯存冰箱不能超過一周）。貯存液100ml溶液中的含量pH工作溶液配制的體積比11NHCl48.0mlTris36.6克TEMED0.23ml8.9分離膠制備：1份1號(hào)，2份2號(hào)，1份水；抽氣后加入4份3號(hào)凝膠濃度7％pH8.92Acr28.0克Bis0.725克3過硫酸銨0.14克41NHCl48.0mlTris5.98克TEMED0.46ml6.7濃縮膠制備：1份4號(hào)，2份5號(hào)抽氣后加入4份6號(hào)凝膠濃度2.5％pH6.75Acr10.0克Bis2.5克6蔗糖40.0克7電泳槽緩沖液：Tris0.60克甘氨酸2.88克8.3用時(shí)可稀釋10倍500ml可供12根電泳管實(shí)驗(yàn)步驟1、準(zhǔn)備每人取電泳管1支，標(biāo)好號(hào)碼，并在距電泳管下端7cm和7.5cm處畫橫線做標(biāo)記，在橡膠帽中滴1滴蔗糖溶液后，套在電泳管底端。試劑分離膠溶液（ml）濃縮膠溶液（ml）分離膠緩沖溶液（pH8.9）1.25—濃縮膠緩沖溶液（pH6.7）—1.25單體交聯(lián)劑2.51.0DDW6.197.65催化劑（10%AP）0.100.10TEMED0.020.02成膠時(shí)間30min15min濃度7.5%(孔小)3%（孔大）2、制膠：取小燒杯2個(gè)，按表加液3.灌柱⑴按上述操作，把分離膠溶液混勻，用滴管將分離膠溶液加入到電泳管中，高至7cm處。然后在膠面上沿管壁緩緩注入0.5cm高的水層，切勿打亂凝膠液面，靜置30min左右。⑵待分離膠成膠后，用細(xì)濾紙條吸干上層水分，灌濃縮膠至7.5cm處，再小心沿管壁加DDW高約0.5cm，靜置15min左右。⑶該濃縮膠成膠后，棄去上層水分，拔出橡膠帽。

4、樣品液制備：血清:0.1ml40%蔗糖:0.1ml于一0.5mlEP管中混勻備用0.05%溴酚蘭:0.1ml

5、裝電泳管：先將電泳緩沖液倒入下槽，再將電泳管裝到電泳槽內(nèi)，用電泳緩沖液灌滿膠管底部空隙，排凈空氣，注意對(duì)稱放置，使其散熱均勻。最后將上槽灌滿緩沖液，排凈電泳管里的氣泡。6、上樣：用微量加樣器吸樣品液10ul，加在濃縮膠上正中央。7、電泳：上槽——負(fù)極下槽——正極電流：先濃縮膠:1.5mA/管然后分離膠:3.0mA/管

8、剝膠電泳畢，取下電泳玻管，用一長(zhǎng)針頭注射器(針頭長(zhǎng)約6～8厘米)，吸滿蒸餾水為潤(rùn)滑劑，將針頭插入玻管內(nèi)壁和凝膠柱表面之間，緩緩旋轉(zhuǎn)玻管，一邊注水，一邊使針頭慢慢呈螺旋式推進(jìn)。最后可用洗耳球在玻管濃縮膠端輕加壓力，就可將凝膠柱壓出玻管。9、固定和染色：先用固定液固定5分鐘，再在培養(yǎng)皿中裝染色液，搖床染色10min。10、脫色：加7%冰醋酸搖床脫色，三次，每次2~3min，一周之后觀察結(jié)果。11、定量：光密度掃描儀定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果+—觀看結(jié)果，描出血清電泳區(qū)帶圖譜，確定清蛋白有無異常。

丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，對(duì)皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。制膠時(shí)，要充分搖勻，加速