BSA毛細(xì)管電色譜柱的制備及手性分離應(yīng)用課件

BSA毛細(xì)管電色譜柱的制備及手性分離應(yīng)用02化工專(zhuān)業(yè)：伍品端指導(dǎo)老師：馬志玲副教授BSA毛細(xì)管電色譜柱的制備及手性分離應(yīng)用1目錄Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀Ⅱ.實(shí)驗(yàn)部分Ⅲ.結(jié)果與討論Ⅳ.實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新點(diǎn)目錄Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀2Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀手性分離的重要性

生物大分子幾乎都具有“手性”特征。手性藥物各對(duì)映體的藥效學(xué)等可能存在很大的差異。

因而評(píng)價(jià)手性藥物各對(duì)映體的生物學(xué)活性,建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的對(duì)映體拆分方法具有十分重要的意義。

Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀手性分離的重要性3

拆分對(duì)映體的色譜技術(shù)：高效液相色譜高效毛細(xì)管電泳超臨界流體色譜

……

毛細(xì)管區(qū)帶電泳膠束電動(dòng)色譜毛細(xì)管電色譜（CEC）(以電滲流為驅(qū)動(dòng)力的微柱液相色譜技術(shù))……對(duì)映體分離機(jī)理：

手性選擇劑與對(duì)映體主要為疏水和靜電作用

，只有具備特定空間構(gòu)形和化學(xué)官能團(tuán)的分子才能與這一區(qū)域結(jié)合。Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀

拆分對(duì)映體的色譜技術(shù)：毛細(xì)管區(qū)帶電泳對(duì)映體分離機(jī)理：4CEC的優(yōu)點(diǎn)：CELCCEC高效性高選擇性多功能性高效性、高選擇性、多功能性Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀CEC的優(yōu)點(diǎn)：CELCCEC高效性高選擇性多功能性高效性、高5常用CEC手性選擇劑人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素蛋白、卵類(lèi)粘蛋白、α-酸性糖蛋白

等。手性引入方法柱前手性衍生化法手性流動(dòng)相添加劑法

手性固定相法

Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀√常用CEC手性選擇劑手性引入方法Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀√6

總之，CEC以樣品與固定相之間的相互作用為分離機(jī)理，以電滲流為流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力。不僅具有CE水平的高柱效，而且具有HPLC水平的高選擇性。而且，CEC整體柱在手性分離中也顯示出一定優(yōu)勢(shì)。Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀返回總之，CEC以樣品與固定相之間的相互作用為分離7Ⅱ.實(shí)驗(yàn)部分毛細(xì)管處理在毛細(xì)管內(nèi)聚合整體柱基質(zhì)用動(dòng)態(tài)法在聚合整體柱基質(zhì)上鍵合BSA蛋白使用選擇性鍵合蛋白質(zhì)對(duì)手性物質(zhì)進(jìn)行分離1.儀器和試劑（略）2.實(shí)驗(yàn)方法Ⅱ.實(shí)驗(yàn)部分毛細(xì)管處理在毛細(xì)管內(nèi)聚合整體柱基質(zhì)用動(dòng)態(tài)法在聚合8二、在毛細(xì)管內(nèi)合成整體柱

返回單體交聯(lián)劑二、在毛細(xì)管內(nèi)合成整體柱

返回單體交聯(lián)劑9三、鍵合BSA蛋白

Epoxymethod返回三、鍵合BSA蛋白

Epoxymethod返回10四、使用選擇性鍵合蛋白質(zhì)對(duì)手性物質(zhì)進(jìn)行分離。返回分離對(duì)象：D,L－組氨酸分離條件：運(yùn)行緩沖溶液：2mM磷酸鹽緩沖液分離電壓：＋6kV檢測(cè)方法：

電導(dǎo)檢測(cè)四、使用選擇性鍵合蛋白質(zhì)對(duì)手性物質(zhì)進(jìn)行分離。返回分離對(duì)象：D11Ⅲ.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論一、整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化二、整體柱分離D,L-組氨酸對(duì)映體Ⅲ.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論一、整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化12活性基團(tuán)——IR滲透性——背壓孔結(jié)構(gòu)——SEM、氮吸附法整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化表1整體柱各性能的影響因素最佳聚合條件

單體含量交聯(lián)劑含量致孔劑含量活性基團(tuán)√滲透性√√孔結(jié)構(gòu)

√活性基團(tuán)——IR整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化表1整體柱各13環(huán)氧活性基團(tuán)——IR

環(huán)氧基和酯基分別在約910cm-1和1730cm-1處有吸收。圖1整體柱基質(zhì)的紅外光譜圖環(huán)氧活性基團(tuán)——IR環(huán)氧基和酯基分別在約9114單體含量對(duì)整體柱活性基團(tuán)含量的影響

固定致孔劑和溶劑的含量，改變單體（）和交聯(lián)劑（）相對(duì)含量，用紅外光譜法比較環(huán)氧基吸收峰（約910cm-1）和酯基吸收峰（約1729cm-1）峰面積。返回

樣品號(hào)單體/交聯(lián)劑環(huán)氧基峰面積酯基峰面積環(huán)氧基與酯基峰面積之比1＃3：233.405559.39040.56252＃1：126.807249.15960.54533＃2：326.324553.51840.4919表2環(huán)氧基與酯基峰面積比較單體含量對(duì)整體柱活性基團(tuán)含量的影響固定致孔劑和151.交聯(lián)劑含量對(duì)整體柱背壓的影響原因：隨著交聯(lián)劑用量的減少，相分離提前，使孔徑增大。樣品號(hào)

單體/交聯(lián)劑（v/v)流速（mL/min)背壓（MPa）C3#3:20.0053.4C6#1:10.0054.7C7#2:30.005>5.2表3不同交聯(lián)劑含量的整體柱基質(zhì)背壓1.交聯(lián)劑含量對(duì)整體柱背壓的影響原因：隨著交聯(lián)劑用量的減少，162.致孔劑含量對(duì)整體柱背壓的影響隨著致孔劑（非良性溶劑）用量增大，相分離提前，孔徑增大。返回圖2不同致孔劑含量整體柱基質(zhì)背壓2.致孔劑含量對(duì)整體柱背壓的影響隨著致孔劑（非良性溶劑）用量17孔結(jié)構(gòu)——SEM圖3K1#（50%致孔劑）SEM圖圖4K5#（10%致孔劑）SEM圖樣品號(hào)單體％交聯(lián)劑％溶劑％致孔劑％

K1＃

24161050K5＃

24165010表4整體柱基質(zhì)組成

孔結(jié)構(gòu)——SEM圖3K1#（50%致孔劑）SEM圖圖18孔結(jié)構(gòu)——氮吸附法

該整體柱基質(zhì)的孔都是中孔和大孔，孔徑分布在50nm-90nm范圍內(nèi)最多。圖5K1#（50％致孔劑）孔徑分布圖返回孔結(jié)構(gòu)——氮吸附法該整體柱基質(zhì)的孔都是中孔和大孔，孔19單體: 24%交聯(lián)劑: 16%致孔劑: 50%溶劑: 10%整體柱基質(zhì)聚合條件返回單體: 24%整體柱基質(zhì)聚合條件返回20CEC分離組氨酸對(duì)映體結(jié)果

在＋6.0kV的分離電壓下，以2mmol·L－1，

pH＝5.5磷酸鹽緩沖溶液作運(yùn)行液，分離D,L-組氨酸，所得CEC圖。圖6D,L-組氨酸CEC圖

CEC分離組氨酸對(duì)映體結(jié)果在＋6.0kV的分離21表5緩沖液的pH值對(duì)分離效果的影響結(jié)論

緩沖液作運(yùn)行液的pH值越高，BSA（pI=4.7）離解的負(fù)電荷越多，使正的電滲流越強(qiáng)，使保留時(shí)間越早。較高pH值的緩沖液作運(yùn)行液時(shí)分離度下降是由于，正的電滲流較強(qiáng)，待分離對(duì)映體與手性選擇劑的作用來(lái)不及很好地進(jìn)行，就被帶出毛細(xì)管。返回緩沖液pH

L-組氨酸t(yī)R（min）

D-組氨酸t(yī)R（min）分離度R5.0／／／5.56.236.681.06.05.025.560.4表5緩沖液的pH值對(duì)分離效果的影響結(jié)論返回緩沖液pH22Ⅳ實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新點(diǎn)通過(guò)條件實(shí)驗(yàn)，用IR、測(cè)定背壓、SEM和氮吸附法等方法，確定出最佳聚合條件，成功制備出毛細(xì)管電色譜柱。用手性毛細(xì)管電色譜柱分離組氨酸對(duì)映體，并考察了運(yùn)行緩沖液pH值對(duì)柱效及分離度的影響,并從原理上作出解釋。最簡(jiǎn)便的方法（環(huán)氧基法），用BSA蛋白對(duì)毛細(xì)管整體柱進(jìn)行修飾，制成手性毛細(xì)管電色譜柱。

首次建立了采用IR法定性和定量分析整體柱基質(zhì)表面的活性基團(tuán)。Ⅳ實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新點(diǎn)通過(guò)條件實(shí)驗(yàn)，用IR、測(cè)定背壓、SEM和氮吸23前景展望

目前，CEC在藥物分析方面已有廣泛的研究，集中在與藥物相關(guān)的雜質(zhì)分離和手性藥物的分離等。隨著毛細(xì)管電色譜技術(shù)的不斷完善和提高，將在生物技術(shù)、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)化學(xué)、精細(xì)化工產(chǎn)品、食品工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域的分析中得到應(yīng)用。在可預(yù)計(jì)的將來(lái)，CEC作為一種發(fā)展中的快速分離技術(shù)，將有更廣泛的應(yīng)用前景。前景展望目前，CEC在藥物分析方面已有廣泛的研究24致謝感謝創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)與研究基金項(xiàng)目感謝導(dǎo)師馬志玲副教授的悉心指導(dǎo)感謝凌連生、謝天堯、曾鋒、鄒世春等老師的關(guān)心和幫助感謝師兄師姐和朋友們對(duì)我的鼓勵(lì)和幫助致謝感謝創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)與研究基金項(xiàng)目25謝謝！謝謝！26BSA毛細(xì)管電色譜柱的制備及手性分離應(yīng)用02化工專(zhuān)業(yè)：伍品端指導(dǎo)老師：馬志玲副教授BSA毛細(xì)管電色譜柱的制備及手性分離應(yīng)用27目錄Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀Ⅱ.實(shí)驗(yàn)部分Ⅲ.結(jié)果與討論Ⅳ.實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新點(diǎn)目錄Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀28Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀手性分離的重要性

生物大分子幾乎都具有“手性”特征。手性藥物各對(duì)映體的藥效學(xué)等可能存在很大的差異。

因而評(píng)價(jià)手性藥物各對(duì)映體的生物學(xué)活性,建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的對(duì)映體拆分方法具有十分重要的意義。

Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀手性分離的重要性29

拆分對(duì)映體的色譜技術(shù)：高效液相色譜高效毛細(xì)管電泳超臨界流體色譜

……

毛細(xì)管區(qū)帶電泳膠束電動(dòng)色譜毛細(xì)管電色譜（CEC）(以電滲流為驅(qū)動(dòng)力的微柱液相色譜技術(shù))……對(duì)映體分離機(jī)理：

手性選擇劑與對(duì)映體主要為疏水和靜電作用

，只有具備特定空間構(gòu)形和化學(xué)官能團(tuán)的分子才能與這一區(qū)域結(jié)合。Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀

拆分對(duì)映體的色譜技術(shù)：毛細(xì)管區(qū)帶電泳對(duì)映體分離機(jī)理：30CEC的優(yōu)點(diǎn)：CELCCEC高效性高選擇性多功能性高效性、高選擇性、多功能性Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀CEC的優(yōu)點(diǎn)：CELCCEC高效性高選擇性多功能性高效性、高31常用CEC手性選擇劑人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素蛋白、卵類(lèi)粘蛋白、α-酸性糖蛋白

等。手性引入方法柱前手性衍生化法手性流動(dòng)相添加劑法

手性固定相法

Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀√常用CEC手性選擇劑手性引入方法Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀√32

總之，CEC以樣品與固定相之間的相互作用為分離機(jī)理，以電滲流為流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力。不僅具有CE水平的高柱效，而且具有HPLC水平的高選擇性。而且，CEC整體柱在手性分離中也顯示出一定優(yōu)勢(shì)。Ⅰ.研究意義和研究現(xiàn)狀返回總之，CEC以樣品與固定相之間的相互作用為分離33Ⅱ.實(shí)驗(yàn)部分毛細(xì)管處理在毛細(xì)管內(nèi)聚合整體柱基質(zhì)用動(dòng)態(tài)法在聚合整體柱基質(zhì)上鍵合BSA蛋白使用選擇性鍵合蛋白質(zhì)對(duì)手性物質(zhì)進(jìn)行分離1.儀器和試劑（略）2.實(shí)驗(yàn)方法Ⅱ.實(shí)驗(yàn)部分毛細(xì)管處理在毛細(xì)管內(nèi)聚合整體柱基質(zhì)用動(dòng)態(tài)法在聚合34二、在毛細(xì)管內(nèi)合成整體柱

返回單體交聯(lián)劑二、在毛細(xì)管內(nèi)合成整體柱

返回單體交聯(lián)劑35三、鍵合BSA蛋白

Epoxymethod返回三、鍵合BSA蛋白

Epoxymethod返回36四、使用選擇性鍵合蛋白質(zhì)對(duì)手性物質(zhì)進(jìn)行分離。返回分離對(duì)象：D,L－組氨酸分離條件：運(yùn)行緩沖溶液：2mM磷酸鹽緩沖液分離電壓：＋6kV檢測(cè)方法：

電導(dǎo)檢測(cè)四、使用選擇性鍵合蛋白質(zhì)對(duì)手性物質(zhì)進(jìn)行分離。返回分離對(duì)象：D37Ⅲ.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論一、整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化二、整體柱分離D,L-組氨酸對(duì)映體Ⅲ.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論一、整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化38活性基團(tuán)——IR滲透性——背壓孔結(jié)構(gòu)——SEM、氮吸附法整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化表1整體柱各性能的影響因素最佳聚合條件

單體含量交聯(lián)劑含量致孔劑含量活性基團(tuán)√滲透性√√孔結(jié)構(gòu)

√活性基團(tuán)——IR整體柱基質(zhì)聚合條件的優(yōu)化表1整體柱各39環(huán)氧活性基團(tuán)——IR

環(huán)氧基和酯基分別在約910cm-1和1730cm-1處有吸收。圖1整體柱基質(zhì)的紅外光譜圖環(huán)氧活性基團(tuán)——IR環(huán)氧基和酯基分別在約9140單體含量對(duì)整體柱活性基團(tuán)含量的影響

固定致孔劑和溶劑的含量，改變單體（）和交聯(lián)劑（）相對(duì)含量，用紅外光譜法比較環(huán)氧基吸收峰（約910cm-1）和酯基吸收峰（約1729cm-1）峰面積。返回

樣品號(hào)單體/交聯(lián)劑環(huán)氧基峰面積酯基峰面積環(huán)氧基與酯基峰面積之比1＃3：233.405559.39040.56252＃1：126.807249.15960.54533＃2：326.324553.51840.4919表2環(huán)氧基與酯基峰面積比較單體含量對(duì)整體柱活性基團(tuán)含量的影響固定致孔劑和411.交聯(lián)劑含量對(duì)整體柱背壓的影響原因：隨著交聯(lián)劑用量的減少，相分離提前，使孔徑增大。樣品號(hào)

單體/交聯(lián)劑（v/v)流速（mL/min)背壓（MPa）C3#3:20.0053.4C6#1:10.0054.7C7#2:30.005>5.2表3不同交聯(lián)劑含量的整體柱基質(zhì)背壓1.交聯(lián)劑含量對(duì)整體柱背壓的影響原因：隨著交聯(lián)劑用量的減少，422.致孔劑含量對(duì)整體柱背壓的影響隨著致孔劑（非良性溶劑）用量增大，相分離提前，孔徑增大。返回圖2不同致孔劑含量整體柱基質(zhì)背壓2.致孔劑含量對(duì)整體柱背壓的影響隨著致孔劑（非良性溶劑）用量43孔結(jié)構(gòu)——SEM圖3K1#（50%致孔劑）SEM圖圖4K5#（10%致孔劑）SEM圖樣品號(hào)單體％交聯(lián)劑％溶劑％致孔劑％

K1＃

24161050K5＃

24165010表4整體柱基質(zhì)組成

孔結(jié)構(gòu)——SEM圖3K1#（50%致孔劑）SEM圖圖44孔結(jié)構(gòu)——氮吸附法

該整體柱基質(zhì)的孔都是中孔和大孔，孔徑分布在50nm-90nm范圍內(nèi)最多。圖5K1#（50％致孔劑）孔徑分布圖返回孔結(jié)構(gòu)——氮吸附法該整體柱基質(zhì)的孔都是中孔和大孔，孔45單體: 24%交聯(lián)劑: 16%致孔劑: 50%溶劑: 10%整體柱基質(zhì)聚合條件返回單體: 24%整體柱基質(zhì)聚合條件返回46CEC分離組氨酸對(duì)映體結(jié)果

在＋6.0kV的分離電壓下，以2mmol·L－1，

pH＝5.5磷酸鹽緩沖溶液作運(yùn)行液，分離D,L-組氨酸，所得CEC圖。圖6D,L-組氨酸CEC圖

CEC分離組氨酸對(duì)映體結(jié)果在＋6.0kV的分離47表5緩沖液的pH值對(duì)分離效果的影響結(jié)論

緩沖液作運(yùn)行液的pH值越高，BSA（pI=4.7）離解的負(fù)電荷越多，使正的電滲流越強(qiáng)，使保留時(shí)間越早。較高pH值的緩沖液作運(yùn)行液時(shí)分離度下降是由于，正的電滲流較強(qiáng)，待分離對(duì)映體與手性選擇劑的作用來(lái)不及很好