納米結構TiN陶瓷涂層對NiTi合金生物相容性的影響

張貴：男，貴州省六盤水人，工程師,主要從事生物材料生物性能研究TelEmail:zhanggui@納米結構TiN陶瓷涂層對NiTi合金生物相容性的影響張貴1，張德元1，何伶俐2，祁鳳君11先健科技（深圳）有限公司研發(fā)中心，深圳5180572貴州省六盤水市人民醫(yī)院檢驗科，六盤水553000摘要：目的：評價沉積納米結構TiN陶瓷涂層對鎳鈦形狀記憶合金生物安全性的影響，為生物醫(yī)用納米結構陶瓷涂層材料安全性提供依據(jù)。方法：分別通過溶血試驗、血小板粘附實驗、體外細胞毒性測試，初步評價鎳鈦合金表面納米陶瓷涂層的生物安全性。結果：鎳鈦合金表面納米陶瓷涂層溶血率、血小板粘附、細胞爬附均好于鎳鈦合金，無細胞毒性。結論：表面納米陶瓷涂層可以改善鎳鈦合金的生物安全性。關鍵詞：生物相容性；細胞毒性；NiTi合金；氮化鈦中圖分類號R318；文獻標識碼:B0引言鎳鈦形狀記憶合金（NiTi）不僅具有良好的力學性能、耐腐蝕性和生物相容性，其獨特的形狀記憶效應和超彈性使得其被廣泛應用于植入性醫(yī)療器械的制備，如心臟缺損封堵器、血管內(nèi)植入物、接骨器件、口腔科器械等。但鎳鈦形狀記憶合金含鎳一般為49.8%-50.6at%，植入體內(nèi)會緩慢的釋放出鎳離子，導致血鎳濃度升高到正常的3倍[1]，并富集于植入部位附近組織[2]；而鎳離子積聚到一定濃度后有誘發(fā)毒性效應，發(fā)生細胞破壞和炎癥反應，對生物體有致畸致癌的潛在危險[3、4]。所以人們通過各種表面處理來改善鎳鈦合金的生物相容性；TiN表面涂層改性是改善NiTi合金臨床醫(yī)學領域應用效果的有效捷徑[5]。但單一的TiN涂層不能隨基體做較大的變形，且阻礙基體變形。所以人們嘗試Ti/TiN交替涂層[6]，簡單的交替涂層太厚依然存在阻礙變形或變形時脫落的問題。本文通過對NiTi合金表面沉積納米結構生物陶瓷涂層（Ti/TiN），在不影響基體的形狀記憶或超彈性效應的前提下，通過減少鎳離子釋放來改善NiTi合金中鎳離子對人體的危害。目前，材料器械生物安全體外評價方法較多，其中應用最多的是細胞相容性和血液相容性[7、8]，本文通過體外細胞毒性實驗和血液相容性實驗初步探索涂層對鎳鈦合金生物安全性的影響，為這一材料后續(xù)的生物醫(yī)用提供依據(jù)。1實驗1．1實驗材料和方法1．1．1NiTi合金表面處理和特性選用美國JohnsonMatthey生產(chǎn)的含鎳50.6at%的NiTi合金絲做為基底,共40段，規(guī)格：直徑0.26mm，長10mm,分兩組，20段用三氯乙烯和酒精清洗后，采用增強離子沉積技術，在其表面沉積總厚度1μm的Ti/TiN薄膜,剖面形貌用掃描電鏡（SEM）觀察，并用X射線能量色散譜儀（EDS）做穿過界面的線掃描；另一組20段NiTi絲表面未經(jīng)處理1．1．2細胞相容性實驗用0.25%胰蛋白酶消化已傳代三代的大鼠心肌細胞（由上海生命科學研究院細胞庫提供），DMEM完全培養(yǎng)液稀釋成104/mL的細胞懸液（DMEM購于美國Gibco公司，含10%小牛血清1%雙抗），將兩組樣品各5段用超聲清洗儀清洗20min，生理鹽水沖洗、75%的酒精消毒，放在紫外線下照射40min后。分別放入兩個細胞培養(yǎng)皿中，同時加入等體積等密度的大鼠心肌細胞懸液，置于37CO5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于第五天時取出樣品，PBS沖去樣品表面的細胞培養(yǎng)液，各取1段用2%的戊二醛固定10min，乙醇系列脫水、丙酮脫醇、空氣中干燥、噴金后掃描電鏡（Jeol6300Lv）下觀察細胞在兩組材料表面的數(shù)量及形態(tài)；將余下未經(jīng)固定的的兩組樣品，每段用0.5mL0.2%的胰酶洗脫表面爬附細胞，并計數(shù)。1．1．3血液相容性實驗1．1．3．1血小板粘附實驗將20mL的新鮮抗凝血（3.8%枸櫞酸鈉，血液為1：9）3000轉/分離心20min獲得富含血小板血漿（PRP）。分別取5段兩組樣品，生理鹽水清洗，同時浸入PRP血漿中，置于37Co溫箱60min后取出，用PBS溶液輕輕漂洗表面多余的PRP，用2%的戊二醛固定，系列脫水、脫醇、空氣中干燥、噴金、掃描電鏡下觀察血小板貼附于材料表面形態(tài)和數(shù)量。1．1．3．2溶血實驗用新鮮抗凝血5mL，加生理鹽水15mL稀釋,得稀釋4倍的稀釋血細胞懸液(血紅蛋白量約為40g/L)。將兩組樣品各10段，用生理鹽水沖洗數(shù)次后，各加入5mL的稀釋血液，置于37CO的培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)48h。陰性對照直接用稀釋的血液，陽性對照用蒸餾水將新鮮抗凝人血做4倍的稀釋，與實驗樣品同樣操作，然后以300r/min速度離心15min，取上清液200μL（陽性對照20μL）按照氰化高鐵血紅蛋白法（HiCN）操作，紫外分光光度計（UV1101）讀取500nm到650nm的吸光度曲線，并用540nm處各組吸光度計算出溶血率（試劑盒由上海榮盛生物科技有限公司提供）；溶血率以下式計算。2結果2．1Ti/TiN涂層結構分析SEM和EDS分析結果及涂層結構示意圖見圖1，從圖中可看出，納米陶瓷層由底層的過渡層、中間的純鈦層和外層的Ti/TiN交替層構成，外層的亞層厚度在100nm左右，EDS的分辨率不足以顯示亞層細節(jié)。納米陶瓷層主要有N、Ti、和O元素。圖1納米生物陶瓷涂層剖面EDS全譜及結構示意圖2．2細胞相容性細胞在兩樣品表面爬附結果示于圖2，從照片中可看出，兩樣品表面都有細胞爬附，細胞粘附比較結實、牢固。涂層樣品表面被細胞爬附成一層較厚的細胞膜，包裹于樣品表面，看不到基底；而裸鎳鈦合金則基底大部分還裸露在外，細胞稀少，單個出現(xiàn)，呈破網(wǎng)狀覆蓋于樣品表面。此外將未經(jīng)固定處理的兩組樣品，用胰蛋白酶洗脫表面粘附細胞并用細胞計數(shù)板計數(shù)，結果納米生物陶瓷組細胞數(shù)量明顯大于NiTi合金組，和電鏡觀察結果相一致，說明納米陶瓷表面呈水波樣粘附的物質(zhì)確實是細胞圖2NiTi合金組(a)和納米生物陶瓷涂層（b）組樣品表面大鼠心肌細胞爬附情況表1兩樣品組細胞洗脫液中細胞濃度(×103/mL)樣品NiTi合金Ti/TiN涂層123342327192038313732X±S22.25±3.5934.5±3.51t檢驗法比較兩組細胞洗脫液中細胞濃度結果表明其有顯著差異（p＜0.05）2．3血液相容性2．3．1血小板黏附實驗圖3是材料表面血小板黏附掃描照片，可看出，兩組樣品表面均有血小板黏附，NiTi合金組血小板聚集和變形程度高，伸出偽足。納米結構陶瓷涂層組(圖b)表面有較少的血小板黏附和聚集，形態(tài)比NiTi合金組好。圖3TiNi合金組（a）和納米生物陶瓷涂層組（b）樣品表面血小板粘附情況2．3．2溶血實驗圖4給出了兩樣品組的溶血曲線，從圖中可以看出，納米生物陶瓷涂層組的吸光度只為NiTi合金的一半左右，我們根據(jù)曲線算出兩樣品的溶血率，兩組樣品的溶血率均符合生物材料溶血安全要求（<5%）。納米生物陶瓷涂層組的為1.2%，明顯好于TiNi合金的2.1%。圖4兩樣品組及陰性、陽性對照的溶血曲線表2兩樣品組上清液所含血紅蛋白量（mg/L）樣品Ti/TiNNiTin1n2n3n4n5平均值x±s490510490420540490±44900860920910860890±28t檢驗法比較兩組上清液中所含血紅蛋白有顯著差異(p＜0.05）3討論目前，生物陶瓷涂層制備方法主要有；等離子噴涂法、電泳沉積法、離子束濺射法、浸漬涂層法、射頻磁控濺射法、離子束動態(tài)混合法、激發(fā)物激光沉積法、溶膠一凝膠法、仿生溶液生長法、整合-燒結法和浸涂-燒結法等[6,10]；我們選用增強離子沉積法，在NiTi表面沉積一層Ti/TiN涂層，有效的屏蔽了NiTi中鎳離子的釋放，陶瓷表面層中的Ti、N、C、O對細胞沒有危害；實驗結果和有關研究表明，減少TiNi中鎳離子釋放是改善其細胞毒性的主要途徑[11]。對生物材料安全性的評價方法較多，國際標準化組織公布的醫(yī)療器械植入材料生物學評價試驗指南(ISO10993-2000)中基本評價的生物學試驗包括細胞毒性、致敏、刺激或皮內(nèi)反應、全身急性毒性、亞慢性亞急性毒性、遺傳毒性、植入、血液相容性等[12、13]，我們選擇了溶血實驗、血小板粘附實驗，細胞毒性試驗三種較為常用的生物學試驗方法，其中細胞毒性實驗我們采用細胞直接在生物材料上進行培養(yǎng)。當有毒性物質(zhì)釋放時，影響細胞形態(tài)和數(shù)量的變化，細胞形態(tài)變化和數(shù)量增減，來反應材料的細胞毒性程度，并且可以直接觀察到細胞在材料表面爬附情況。直接接觸法不僅能直接檢測材料溶出物的細胞毒性，同時也是考察材料與組織細胞相容性的重要手段；通?！安牧仙锵嗳菪院谩保芏鄨龊隙际侵讣毎菀踪N壁且能迅速繁殖生長。因此可根據(jù)直接接觸法細胞培養(yǎng)的結果推測材料植入人體后與機體細胞的反應，有學者認為直接接觸法對材料的細胞毒性敏感性最高，可測出材料微弱的細胞毒性[9]。此外，用洗脫法計數(shù)材料表面細胞數(shù)，能較精確的反應材料表面爬附的細胞數(shù)，克服了電鏡圖片只能定性的缺陷，兩者組合是測定材料微弱細胞毒性的很好方法。氰化高鐵血紅蛋白法測定血紅蛋白是臨床檢驗中測定血紅蛋白的參考方法，血紅蛋白被試劑中的高鐵氰化鉀反應，生成高鐵血紅蛋白，最后以氰結合為氰化高鐵血紅蛋白，其在波長540nm處反應線性好，能準確的測出樣品中微量的血紅蛋白，比直接測定溶血后溶液的吸光度值來計算溶血率精確度高。4結論樣品表面細胞毒性實驗、血小板粘附實驗和溶血實驗結果表明，納米結構Ti/TiN生物陶瓷涂層可以顯著改善鎳鈦合金的生物相容性。致謝：本項目獲得國家十一五攻關項目（2004BA706B11）資助參考文獻MarcusW.RiesMDa,ChristophKampmannMDb,Hans-JürgenRupprechtMDa,GudrunHinterederMDc,GerdHafnerMDcandJürgenMeyerMD,NickelreleaseafterimplantationoftheAmplatzeroccluder,AmericanHeartJournal,145(4),April2003,Pages737-741ThomasNeumann,DragaPetkovic,MariaBurian,MichaelW.Weber,MatthiasRau,RolandR.Brandt,ThorstenDillandChristianHamm,Systemicdisseminationofnickelinpatientswithatrialseptaldefectsfollowingtheimplantationoftheamplatzerseptaloccluder,

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