新冠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南

新冠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（一）檢測(cè)人員要求實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員應(yīng)當(dāng)具有實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)歷以及相關(guān)專(zhuān)業(yè)技術(shù)技能，接受過(guò)新冠相關(guān)檢驗(yàn)檢測(cè)技能培訓(xùn)。檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)按照所開(kāi)展檢測(cè)項(xiàng)目及標(biāo)本量配備實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員，以保證及時(shí)、高效完成檢測(cè)和結(jié)果報(bào)告。（二）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè).實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)新冠核酸（1）核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室新冠核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室按功能區(qū)布置位置的不同，可分為集中布置形式和分散布置形式。開(kāi)展新冠核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。如采用標(biāo)本加樣、核酸提取及擴(kuò)增檢測(cè)為一體的自動(dòng)化分析儀，標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)可合并。集中布置形式的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置應(yīng)遵循“各區(qū)獨(dú)立，單向流動(dòng)（注意風(fēng)向，壓力梯度走向），因地制宜，方便工作”的原則。各區(qū)的功能如下：①試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)用于分裝、儲(chǔ)存試劑、制備擴(kuò)增反應(yīng)混合液，以及儲(chǔ)存和準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)耗材。該區(qū)應(yīng)配備冰箱或冰柜、離心機(jī)、試驗(yàn)臺(tái)、渦旋振蕩器、微量加樣器等。為防止污染，該區(qū)宜保持正壓狀態(tài)。②標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)桶的開(kāi)啟、標(biāo)本滅活（必要時(shí)）、核酸提取及模板加入至擴(kuò)增反應(yīng)管等。該區(qū)應(yīng)配備冰箱或冰柜、生物安全柜、離心機(jī)、試驗(yàn)臺(tái)、微量加樣器，可根據(jù)實(shí)際工作需要選配自動(dòng)化核酸提取儀等。標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)桶的開(kāi)啟、分裝應(yīng)在生物安全柜內(nèi)完成。為防止污染，該區(qū)宜保持負(fù)壓狀態(tài)。為操作方便，標(biāo)本分裝以及核酸提取也可以在獨(dú)立的生物安全二級(jí)(BSL-2)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，提取的核酸可以轉(zhuǎn)運(yùn)至該區(qū)加至擴(kuò)增反應(yīng)液中。③核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和產(chǎn)物分析。該區(qū)應(yīng)配備實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。為防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染環(huán)境，該區(qū)宜保持負(fù)壓狀態(tài)，壓力等于或低于標(biāo)本制備區(qū)。(2)新冠核酸的熒光定量RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)制定標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP),并嚴(yán)格按照SOP進(jìn)行操作。接到標(biāo)本后，應(yīng)當(dāng)在生物安全柜內(nèi)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行清點(diǎn)核對(duì)，并依據(jù)SOP進(jìn)行試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本前處理、核酸提取、核酸擴(kuò)增、結(jié)果分析及報(bào)告。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)建立可疑標(biāo)本復(fù)檢的流程。①試劑準(zhǔn)備應(yīng)當(dāng)選擇國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門(mén)批準(zhǔn)的試劑，建議根據(jù)核酸提取試劑及擴(kuò)增體系的要求選擇配套的標(biāo)本采樣管，不建議免提取核酸直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。②標(biāo)本處理使用含胭鹽等滅活型采樣液的標(biāo)本無(wú)需進(jìn)行滅活處理，可直接進(jìn)行核酸提取，而使用非滅活型采樣液的標(biāo)本，按照核酸提取試劑盒的說(shuō)明，取適量標(biāo)本加至核酸提取裂解液中充分混勻作用一定的時(shí)間則可以有效滅活病毒。選用熱滅活時(shí)可采用95C加熱15分鐘，不推薦采用56七孵育30分鐘的處理方式滅活病毒，該條件不能保障充分滅活病毒。污水水樣標(biāo)本處理可參考《污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)》(WS/T799-2022)推薦的方法；污水拭子標(biāo)本處理可參考《農(nóng)貿(mào)(集貿(mào))市場(chǎng)新型冠狀病毒環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》(WS/T776-2021)推薦的方法。③核酸提取將滅活后的標(biāo)本取出，在生物安全柜內(nèi)打開(kāi)標(biāo)本采集管加樣，或按照核酸提取試劑盒的說(shuō)明，將標(biāo)本與裂解液作用足夠時(shí)間后繼續(xù)核酸提取步驟，核酸提取完成后立即封蓋。取適量核酸加至PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中。④核酸擴(kuò)增將擴(kuò)增體系放入熒光定量PCR儀，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置擴(kuò)增程序，啟動(dòng)擴(kuò)增程序。擴(kuò)增完成后反應(yīng)管不可開(kāi)蓋，直接放于垃圾袋中，封好袋口，不可高壓，按一般醫(yī)療廢物轉(zhuǎn)移出實(shí)驗(yàn)室處理。檢測(cè)機(jī)構(gòu)所選用的新冠核酸檢測(cè)試劑應(yīng)針對(duì)新冠基因組中開(kāi)放讀碼框lab(openreadingframelab,ORFlab)和核衣殼蛋白(nucleocapsidprotein,N)基因，人體標(biāo)本檢測(cè)原則上選擇含內(nèi)源性?xún)?nèi)參的核酸檢測(cè)試劑。⑤陽(yáng)性標(biāo)本的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)陽(yáng)性病例需滿足以下兩個(gè)條件中的一個(gè)：條件一：同一份標(biāo)本中新冠2個(gè)靶標(biāo)(ORFlab、N)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。如果出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，則需要重新檢測(cè)或重新采樣復(fù)核。條件二：兩種標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光RT-PCR同時(shí)出現(xiàn)單靶標(biāo)陽(yáng)性，或同種類(lèi)型標(biāo)本兩次采樣檢測(cè)中均出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，可判定為陽(yáng)性。環(huán)境與生物材料核酸檢測(cè)陽(yáng)性要排除疫苗接種物殘留污染的影響。核酸檢測(cè)結(jié)果假陰性的可能原因包括：標(biāo)本質(zhì)量差；標(biāo)本采集時(shí)間過(guò)早或過(guò)晚；標(biāo)本保存、運(yùn)輸和處理不當(dāng)；其他原因如病毒變異、PCR抑制等。⑥質(zhì)控由上級(jí)疾控部門(mén)對(duì)下級(jí)疾控實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸檢測(cè)質(zhì)控考核，中國(guó)疾控中心每年至少開(kāi)展一次對(duì)省級(jí)疾控機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控考核，并同時(shí)提供全國(guó)新冠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)控方案，省級(jí)針對(duì)地市級(jí)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控考核每年不少于兩次。各檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)核酸檢測(cè)質(zhì)量控制，選用擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒指定的核酸提取試劑和擴(kuò)增儀。性能驗(yàn)證。臨床標(biāo)本檢測(cè)前，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)核酸提取試劑、提取儀、擴(kuò)增試劑、擴(kuò)增儀等組成的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行必要的性能驗(yàn)證，性能指標(biāo)包括但不限于精密度（至少要有重復(fù)性）和最低檢測(cè)限。室內(nèi)質(zhì)控。實(shí)驗(yàn)室可按照《國(guó)家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于醫(yī)療機(jī)構(gòu)開(kāi)展新型冠狀病毒核酸檢測(cè)有關(guān)要求的通知》（國(guó)衛(wèi)辦醫(yī)函（2020）53號(hào)）要求規(guī)范開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)控。每批檢測(cè)至少有1份弱陽(yáng)性質(zhì)控品（第三方質(zhì)控品，通常為檢出限的1.5-3倍）、3份陰性質(zhì)控品（生理鹽水）。質(zhì)控品隨機(jī)放在臨床標(biāo)本中，參與從提取到擴(kuò)增的全過(guò)程。大規(guī)模人群篩查時(shí)，一旦出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本采用另外一到兩種更為靈敏的核酸檢測(cè)試劑對(duì)原始標(biāo)本進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，復(fù)核陽(yáng)性方可報(bào)出。物品和環(huán)境標(biāo)本的采集檢測(cè)，還需在采樣前及采樣過(guò)程中至少設(shè)一個(gè)現(xiàn)場(chǎng)空白標(biāo)本及一個(gè)運(yùn)輸空白標(biāo)本，以進(jìn)行過(guò)程中的質(zhì)量控制。室間質(zhì)評(píng)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)常態(tài)化參加國(guó)家級(jí)或省級(jí)疾控機(jī)構(gòu)組織的室間質(zhì)評(píng)。對(duì)檢測(cè)量大以及承擔(dān)重點(diǎn)人群篩查等任務(wù)的實(shí)驗(yàn)室，可適當(dāng)增加室間質(zhì)評(píng)頻率。不按要求參加室間質(zhì)評(píng)的，或室間質(zhì)評(píng)結(jié)果不合格的，應(yīng)通報(bào)批評(píng)并上報(bào)國(guó)家衛(wèi)健委，待室間質(zhì)評(píng)通過(guò)后方可開(kāi)展核酸檢測(cè)。核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控詳細(xì)內(nèi)容參見(jiàn)《國(guó)家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于加強(qiáng)疾控機(jī)構(gòu)新冠核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的通知》(國(guó)衛(wèi)辦疾控函(2021)548號(hào))《疾控機(jī)構(gòu)新冠核酸檢測(cè)質(zhì)量控制方案》。.病毒全基因組測(cè)序病毒全基因組測(cè)序可以監(jiān)測(cè)病毒基因組突變，為新冠核酸檢測(cè)試劑、疫苗研發(fā)策略的改變提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為流調(diào)溯源工作提供支持。(1)測(cè)序標(biāo)本選取原則結(jié)合流調(diào)信息和病例傳播鏈關(guān)系，優(yōu)先選擇以下標(biāo)本開(kāi)展測(cè)序：核酸檢測(cè)Ct值＜32的本土疫情中的首發(fā)或早期病例、與早期病例有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵病例、感染來(lái)源不明的本土病例、境外輸入病例、入境物品及相關(guān)環(huán)境陽(yáng)性標(biāo)本、疫苗接種后核酸檢測(cè)陽(yáng)性者標(biāo)本等。測(cè)序結(jié)果應(yīng)與本地近一個(gè)月的輸入病例和本土病例序列進(jìn)行比對(duì)。對(duì)同一傳播鏈或流行病學(xué)關(guān)系明確的病例無(wú)需全部測(cè)序。(2)測(cè)序要求①測(cè)序單位和流程以省、自治區(qū)、直轄市為單位確定開(kāi)展新冠全基因組測(cè)序的機(jī)構(gòu)，包括省級(jí)疾控機(jī)構(gòu)和科研機(jī)構(gòu)；具備測(cè)序條件的省份要在接收標(biāo)本后24小時(shí)內(nèi)開(kāi)展測(cè)序工作。不具備測(cè)序條件的省份要及時(shí)將標(biāo)本送至病毒病所，病毒病所收到標(biāo)本后及時(shí)啟動(dòng)序列測(cè)定工作。②結(jié)果報(bào)告與反饋各省份要建立本省輸入、本土病例新冠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，及時(shí)進(jìn)行序列比對(duì)分析，逐步提高自主分析能力。獲得的全部測(cè)序數(shù)據(jù)都必須上報(bào)中國(guó)疾控中心病毒病所用于我國(guó)新冠溯源數(shù)據(jù)庫(kù)的更新與維護(hù)。對(duì)本土疫情的指示或首發(fā)病例、本土疫情中由不同基因型的毒株導(dǎo)致的新傳播鏈的指示或首發(fā)病例，測(cè)序完成后應(yīng)于24小時(shí)內(nèi)將數(shù)據(jù)報(bào)送病毒病所,病毒病所確認(rèn)數(shù)據(jù)完整無(wú)誤后于48小時(shí)之內(nèi)反饋結(jié)果；對(duì)本土疫情中歸屬已知傳播鏈的病例、境外輸入病例、環(huán)境標(biāo)本（非指示或首發(fā)病例相關(guān)），測(cè)序數(shù)據(jù)于每周周一上午集中上報(bào)，病毒病所確認(rèn)數(shù)據(jù)完整無(wú)誤后于一周之內(nèi)反饋結(jié)果。.血清抗體檢測(cè)血清抗體檢測(cè)用作新冠核酸檢測(cè)的補(bǔ)充檢測(cè)，也用于評(píng)估疫苗接種后誘發(fā)的免疫反應(yīng)。應(yīng)采用中國(guó)藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的試劑進(jìn)行檢測(cè)，采集急性期（發(fā)病7天內(nèi)）和恢復(fù)期（3-4周后）雙份血清進(jìn)行檢測(cè)，也可根據(jù)臨床需要確定采集時(shí)間，疑似新冠感染者抗體檢測(cè)陽(yáng)性時(shí)應(yīng)排除新冠疫苗接種因素的影響。.病毒分離培養(yǎng)（1）病毒分離培養(yǎng)對(duì)象對(duì)核酸檢測(cè)Ct值W30的所有境外輸入病例的標(biāo)本、本土疫情中的首發(fā)或早期病例、與早期病例有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵病例、感染來(lái)源不明的本土病例以及疫苗接種后核酸陽(yáng)性者標(biāo)本開(kāi)展病毒分離培養(yǎng)。（2）毒株報(bào)送與結(jié)果反饋具有新冠分離、培養(yǎng)資質(zhì)的省級(jí)疾控機(jī)構(gòu)應(yīng)開(kāi)展病毒分離培養(yǎng)工作,收到關(guān)鍵標(biāo)本后96小時(shí)內(nèi)開(kāi)展相關(guān)工作，在獲得分離毒株后96小時(shí)內(nèi)將毒株送病毒病所保存?zhèn)浒?，并將毒株序列等相關(guān)信息報(bào)送病毒病所。不具備病毒分離條件的省份，要在病例報(bào)告后48小時(shí)內(nèi)啟動(dòng)送樣流程,將標(biāo)本送達(dá)病毒病所，病毒病所收到標(biāo)本后應(yīng)在96小時(shí)內(nèi)啟動(dòng)病毒