全基因組擴增應用于胚胎植入前遺傳學診斷

全基因組擴增應用于胚胎植入前遺傳學診斷植入前遺傳學診斷(preimplantationgeneticdiagnosis，PGD)是指借助顯微操作技術對具有高遺傳病風險夫婦，從其體外受精培養(yǎng)得到的胚胎中取出個別卵裂球細胞或極體或幾個滋養(yǎng)層細胞進行遺傳學檢查，通過分析選擇正常的胚胎移植，能夠防止異常妊娠的發(fā)生，將產(chǎn)前診斷提早到胚胎植入子宮內(nèi)膜之前。避免了反復流產(chǎn)、引產(chǎn)對孕婦及其家庭造成的傷害。但由于可用于PGD分析的材料為胚胎中取出的個別卵裂球細胞或極體或幾個滋養(yǎng)層細胞，這些材料特別有限，所以在進行PGD之前，需對單細胞進行全基因組擴增(wholegenomeampliflication，WGA)，全基因組擴增一組在基因組DNA數(shù)量極有限情況下對全部基因組序列進行非選擇性擴增的技術，其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增長DNA的總量，對進行疾病診斷的組織或單個細胞的基因組進行大量擴增，使得后續(xù)分析的模板量增長，進而完成多位點、多基因的檢測研究。該技術能很好的解決PGD的標本少和精確性要求高等要求。本文介紹了WGA方法中PEP、DOP-PCR、MDA應用于PGD的情況，分析了MDA方法的優(yōu)勢與不足。1引言伴隨著人類輔助生殖技術的發(fā)展，十分是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)及單精子胞漿內(nèi)顯微打針(ICSI)的廣泛應用，使得越來越多的不育患者實現(xiàn)了生育的愿望，但隨之而來的遺傳病的患病風險也明顯增長[1]，而胚胎植入前遺傳學診斷卻能有效地降低后代患遺傳病的風險，故胚胎植入前遺傳學診斷將成為臨床檢驗的主要手段。胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)是指借助顯微操作技術對具有高遺傳病風險夫婦，從其體外受精培養(yǎng)得到的胚胎中取出個別卵裂球細胞或極體或幾個滋養(yǎng)層細胞進行遺傳學檢查，通過分析選擇正常的胚胎移植，能夠防止遺傳學異常妊娠的發(fā)生，將產(chǎn)前診斷提早到胚胎植入子宮內(nèi)膜之前。該技術包含體外受精胚胎移植(invitrofertilizatio-andembryotransfer，IVF-ET)的臨床手段，聚合酶鏈式反應(PCR)、熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybriddization，F(xiàn)ISH)等檢測技術。全基因組擴增(wholegenomeamplification，WGA)是一組在基因組DNA數(shù)量極有限情況下對全部基因組序列進行非選擇性擴增的技術，其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增長DNA的總量，對進行疾病診斷的組織或單個細胞的基因組進行大量擴增，使得后續(xù)分析的模板量增長，進而完成多位點、多基因的檢測研究。該技術現(xiàn)已應用于法醫(yī)學、疾病基因研究、產(chǎn)前診斷等領域。近年在胚胎植入前遺傳學診斷中的應用也遭到關注[2]。2全基因組擴增(WGA)的方法聚合酶鏈反應(PCR)技術的產(chǎn)生和發(fā)展極大得推進了微量DNA樣本的分析，但由于很多材料所能提供的DNA量也只能用于一次或幾次PCR反應。為了能從極少量細胞中最大限度的獲取信息，需要用全基因組擴增技術(WGA)將原始DNA序列放大。WGA技術如今已經(jīng)發(fā)展構(gòu)成以PCR為基礎的PEP和DOP-PCR技術和不以PCR為基礎使用隨機引物恒溫擴增的多重置換擴增技術(multipledisplacementamplification，MDA)。2.1PEP和DOP-PCR技術引物延伸預擴增(Primerextensionpreamplification，PEP)用到的是PCR技術、Taq酶和由15個堿基的隨機寡聚核苷酸組合出415種不同序列的引物，其變性后在37℃條件下低溫退火，然后緩慢升至55℃延伸，隨機擴增基因組DNA，擴增產(chǎn)品覆蓋接近基因組96%區(qū)域，同時放大1000倍[3]，PEP后續(xù)采取巢式PCR或以其終產(chǎn)品為模板，使用特異的引物序列進行擴增，進而到達檢測的目的。普通PEP的總反應時間需經(jīng)歷14h，其較長時間的反應周期阻礙了其在臨床PGD檢測中的應用。在改善普通PEP的反應體系以及熱循環(huán)條件后，其反應時間縮短至5.5h[4]，固然反應時間縮短，但改進后的PEP仍然堅持著原有擴增效率，以至提升了擴增的特異性，其命名為改進的引物延伸反應預擴增(improve-PEP，I-PEP)。2003年Jiao等[5]應用PEP結(jié)合巢式PCR技術及反向點雜交技術(RDB)的方案，對β-地中海貧血攜帶者行PGD，成功出生了健康的小孩。然而，普通PEP擴增產(chǎn)品的長度達不到1500bp，較低的擴增率、產(chǎn)生片段的過短成為PEP技術在PGD中廣泛應用的最重要障礙。另一種WGA方法是簡并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)，其操作相對PEP更簡單，采取部分簡并寡核苷酸引物，這些引物會結(jié)合于整個基因組序列，在低退火溫度運行幾個循環(huán)擴增，讓引物充足與基因組DNA結(jié)合，隨后提升退火溫度進行更特異的擴增。DOP-PCR能將DNA模板能從開始時的15pg增至400ng，且能按比例均勻擴增整個基因組DNA[6]。但和PEP一樣，DOP-PCR只能擴增出相對較短的產(chǎn)品，2002年Kittle等[7]將其改進，其使用核酸外切酶矯正DNA聚合酶的活性，增長DOP-PCR退火和延伸的時間，其結(jié)果是擴增產(chǎn)品長度由原來0.5kb增至10kb，更好地覆蓋了微隨體區(qū)域和單拷貝序列。2.2多重置換擴增(MDA)技術MDA技術是當前最受關注的WGA技術，不同于以PCR為基礎的PEP和DOP-PCR技術存在擴增產(chǎn)品過短、偏性擴增明顯等缺點，該技術是不需以PCR為基礎的具有更高層次擴增效率、更廣覆蓋域及更高層次保真度的新的擴增技術。MDA是一種基于鏈置換和環(huán)狀滾動擴增的全基因組擴增技術。該技術利用一種φ29DNA聚合酶催化六聚體隨機引物對基因組進行擴增，其反應條件為在30℃下恒溫。擴增時，六聚體隨機引物在多個位點與模板DNA退火，在φ29DNA聚合酶的作用下同時啟動復制。引物沿著模板鏈延長，同時取代模板的互補鏈。被置換的互補鏈又作為新的模板完成一次擴增，經(jīng)過長時間的循環(huán)，最終經(jīng)過65℃滅活可獲得大量的DNA。該技術適用于各種樣本，低DNA含量的樣本，尤其是在臨床應用中常出現(xiàn)的單細胞取材，如單個淋巴細胞、單個精子、單個滋養(yǎng)層細胞或卵裂球等?？梢灾苯訌男迈r或枯燥的全血、白膜層和培養(yǎng)的細胞等進行擴增，可以是石蠟包埋的樣品，但效果較差[8]。在臨床應用中，MDA表現(xiàn)出高擴增效率和精到準確性，相較于以PCR基礎的WGA方法，MDA表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢。2009年Ren等[9]通過MDA技術擴增單細胞基因組DNA完成兩家DMD臨床PGD實驗，每個家系均分析了一個DMD基因的突變位點和6個STR連鎖標記，最后各出生一個健康的女孩。2010年Eduardo等[10]用MDA技術結(jié)合PCR-連鎖分析完成了1家PKHD1家系的臨床PCR實驗，他們共分析了20個PKHD1基因及其側(cè)翼序列中的STR位點，最終出生了一個健康孩子。2.2.1MDA技術的優(yōu)點首先是其連續(xù)合成能力，MDA方法比以PCR為基礎的擴增方法擴增效率更高層次，可將微量模版擴大數(shù)千倍以上。φ29DNA聚合酶的合成力極強且連續(xù)時間長，產(chǎn)品片段平均長度可大于10kb。而在PCR反應中，反復的變性和退火約40個循環(huán)左右，DNA擴增即進入平臺期，MDA由于其反應全程恒溫，其酶活性能連續(xù)長達16小時，進而可產(chǎn)生足夠量的DNA來完成PGD及STR位點的檢測[11]。第二，MDA方法的脫扣率較以往PCR基礎的擴增方法進行WGA低。在微衛(wèi)星基因座上滑脫是的WGA一個大問題，φ29DNA聚合酶從理論上講能減少微衛(wèi)星在基因座上的滑脫率。第三，MDA方法的高保真性，φ29DNA聚合酶具有外切酶活性，可均勻擴增DNA而不出現(xiàn)擴增偏差，其錯配率僅為1：106～1：107，而TaqDNA酶的錯配率3：104[13]，相較之下φ29DNA聚合酶可保證擴增效果。第四，無論MDA擴增起始濃度差別多大，其終濃度穩(wěn)定，基因組DNA經(jīng)過30℃反應6～8h，擴增在到達高峰后維持于一個穩(wěn)定水平使所有反應的DNA產(chǎn)量堅持在20～30μg左右。2.2.2MDA技術的不足MDA當前仍然存在一些不足，2005年Sun等[15]綜合比較了I-PEP、MDA方法的優(yōu)缺點，結(jié)果提示MDA方法擴增效率大于I-PEP方法，但特異性較I-PEP差，片段大小差異不同大，在一些微衛(wèi)星位點分型時，可能會發(fā)生脫扣。MDA反應靈敏度極高，起始模板量少故極易污染，若用單個細胞做PGD，污染問題將會愈加突出。污染物與待檢測模板競爭擴增，經(jīng)PCR放大后極大影響了診斷的精確性。3單細胞WGA擴增后續(xù)分析技術3.1單體型分析胚胎植入前單體型分析(Preimplantationgenetichaplotyping，PGH)是PGD中一個新的方法，是利用短串聯(lián)反復序列(STR)在DNA復制經(jīng)過中會發(fā)生一個或幾個單位的反復或缺失的特點，在人群反復次數(shù)會出現(xiàn)特異且符合孟德爾遺傳定律的原理，進行家系分析確定攜帶突變的染色體的簡易診斷的手段，其最大的優(yōu)勢是能發(fā)現(xiàn)任何單基因病以至已確定的缺失。但是需要在進行PGH分析之前細心研究至少有一個患者的家系中并找到一些能用于攜帶者的連鎖標記。2006年Renwick等[16]成功用MDA產(chǎn)品通過PGH方法應用于囊性纖維變性和DMD并使受孕。如今，PGH應用了將熒光標記在PCR擴增引物上的熒光PCR，并通過熒光電泳進行單體型分析，大大縮短了PGH的時間，作為一種代替診斷的方法，PGH增長了PGD診斷的范圍和可用性。3.2SNP分型單核苷酸多態(tài)(Singlenucleotidepolymorphism，SNPs)是占人類基因突變的很大比例并會增長人類患病風險的單核苷酸改變。但SNP關聯(lián)分析需要足量的基因組DNA，WGA使之成為可能。WGA之后的SNP分析不僅提供了一種可靠的評估DNA產(chǎn)品的方法，同時在探究染色體畸變實驗中也呈現(xiàn)出高精到準確性和可反復性，2009年ling等[17]通過MDA結(jié)合SNP分析的方案成功發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生了單體和三體的染色體數(shù)目畸變。WGA結(jié)合SNP方案尚處在發(fā)展的初級階段，以后的發(fā)展不可估量。4總結(jié)PGD中可獲得的細胞數(shù)量、DNA都極其有限。進行PGD分析需要大量反映原始遺傳信息的DNA，WGA用于PGD基因分析令人鼓舞，其恰好解決了這種單細胞擴增的問題且臨床檢測技術使用正不斷發(fā)展。尤其是MDA技術翻開了需要大量DNA的多重檢