蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應

實驗四蛋白質(zhì)的顏色反應

和沉淀反應蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!一、實驗目的1.熟悉蛋白質(zhì)的沉淀反應、顏色反應2.了解蛋白質(zhì)的沉淀反應、顏色反應的機理。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!二、實驗原理蛋白質(zhì)分子中的某些基團與顯色劑作用，可產(chǎn)生特定的顏色反應，不同蛋白質(zhì)所含氨基酸不完全相同，顏色反應亦不同。顏色反應不是蛋白質(zhì)的專一反應，一些非蛋白物質(zhì)亦可產(chǎn)生相同顏色反應，因此不能僅根據(jù)顏色反應的結(jié)果決定被測物是否是蛋白質(zhì)。顏色反應是一些常用的蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。（一）蛋白質(zhì)的顏色反應原理蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!蛋白質(zhì)能形成較穩(wěn)定的親水膠體的另一個原因，是因為蛋白質(zhì)顆粒在非等電狀態(tài)時帶有相同電荷，使蛋白質(zhì)顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致相互凝集沉淀。

蛋白質(zhì)由于帶有電荷和水膜，因此在水溶液中形成穩(wěn)定的膠體。當某些物理化學因素破壞了蛋白質(zhì)的水膜或中和了蛋白質(zhì)的電荷，則蛋白質(zhì)膠體溶液就不穩(wěn)定而出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!三、實驗儀器、試劑和材料1.卵清蛋白液：將雞蛋白用蒸餾水稀釋20～40倍，2～3層紗布過濾，濾液冷藏備用。2.飽和硫酸銨溶液：稱硫酸銨850g加于1000mL蒸餾水中，在70～80℃下攪拌促溶，室溫中放置過夜，瓶底析出白色結(jié)晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。3.1%醋酸鉛溶液4.1%硫酸銅溶液5.0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀釋至100mL。6.濃硝酸：比重1.42。7.試管及試管架、吸管、量筒等。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!2.蛋白質(zhì)的黃色反應實驗原理：含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酷氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進一步形成深橙色的硝醌酸鈉。多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應)。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!實驗過程：在一試管內(nèi)，加蛋白質(zhì)溶液10滴及濃硝酸3～4滴，加熱，冷卻后再加10%NaOH溶液5滴，觀察顏色反應。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!茚三酮反應分為兩步，步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮;第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合成有色物質(zhì)。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!(一)蛋白質(zhì)的沉淀反應

1.鹽析作用原理

用大量中性鹽(如硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈉等)，使蛋白質(zhì)沉淀析出的過程，稱為蛋白質(zhì)的鹽析作用。它包括兩個過程：一是電解質(zhì)破壞了蛋白質(zhì)的水化層而出現(xiàn)沉淀；二是電解質(zhì)中和了蛋白質(zhì)分子所帶的電荷而出現(xiàn)沉淀。中性鹽能否沉淀各種蛋白質(zhì)與中性鹽的濃度、蛋白質(zhì)的種類、溶液的pH值以及蛋白質(zhì)膠體顆粒大小有關。大顆粒蛋白質(zhì)膠體比小顆粒更容易沉淀，如球蛋白多在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!2.乙醇沉淀反應

原理：在水溶液中，蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒。在有機溶劑中，蛋白質(zhì)顆粒因失去電荷或脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!3.重金屬鹽沉淀反應實驗原理：蛋白質(zhì)在堿性溶液中，帶有較多的負電荷，當與帶正電荷的重金屬離子結(jié)合時，即生成不溶于水的沉淀。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!（二）蛋白質(zhì)的沉淀反應原理

蛋白質(zhì)的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因為蛋白質(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團，如-NH3+，-COO-，-SH等和水有高度親和性，當?shù)鞍踪|(zhì)與水相遇時，就很容易被蛋白質(zhì)吸住，在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水膜(又稱水化層)。水膜的存在使蛋白顆粒相互隔開，顆粒之間不會碰撞而聚成大顆粒。因此蛋白質(zhì)在溶液中比較穩(wěn)定而不會沉淀。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!蛋白質(zhì)變性后,有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在(如電荷),并不析出.因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀,而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性.蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!四、操作步驟(一)蛋白質(zhì)的顏色反應1.雙縮脲反應原理：當尿素經(jīng)加熱至180℃左右時，兩分子尿素脫去一分子氨，進而縮合成一分子雙縮脲。在堿性條件下雙縮脲與銅離子結(jié)合成紅紫色絡合物，此反應稱為雙縮脲反應。多肽及蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中均含有許多肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲分子中的亞酰胺鍵相同。因此，在堿性條件下與銅離子也能呈現(xiàn)出類似于雙縮脲的呈色反應。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!實驗過程①取少許結(jié)晶尿素放在干燥試管中，微火加熱，尿素溶化并形成雙縮脲，釋出的氨可用紅色石蕊試紙試之。至試管內(nèi)有白色固體出現(xiàn)，停止加熱，冷卻。然后加10%NaOH溶液1mL混勻，觀察有無紫色出現(xiàn)。②另取一試管，加蛋白質(zhì)溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混勻，觀察是否出現(xiàn)紫玫瑰色。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!3.茚三酮反應實驗原理：在弱酸條件下（pH5-7），蛋白質(zhì)或氨基酸與茚三酮共熱，可生成藍紫色縮合物。此反應為一切蛋白質(zhì)和α—氨基酸所共有(亞氨基酸如脯氨酸和羥脯氨酸產(chǎn)生黃色化合物)。含有氨基的其他化合物亦可發(fā)生此反應。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!實驗過程：取1mL蛋白質(zhì)溶液置于試管中，加2滴茚三酮試劑，加熱至沸，即有藍紫色出現(xiàn)(注意：此反應必須在pH5～7進行)。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!實驗過程取1支試管加入3mL蛋白質(zhì)溶液和3mL飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置約10min，球蛋白則沉淀析出。過濾后向濾液中加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解達到飽和為止，析出的沉淀為清蛋白，再加水稀釋，觀察沉淀是否溶解。蛋白質(zhì)的顏色反應和沉淀反應共22頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!取1支試管架蛋白質(zhì)溶液1mL，加晶體氯化鈉少許(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解