mRNA差異顯示技術(shù)DD及其對動物育種的作用曲亮黃瑞華課件

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院曲亮南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院曲亮1mRNA差異顯示技術(shù)（DD）及其對動物育種的作用曲亮黃瑞華*邱新深劉紅林王林云(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京，210095)

基金項目：江蘇省高技術(shù)研究項目（BG2005304）mRNA差異顯示技術(shù)（DD）及其對動物育種的作用曲亮黃瑞2DD的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達(dá)基因強有力的工具在隨后幾年里，Liang等在技術(shù)方面做了大量改進(jìn)，使技術(shù)更適用、更簡便基于RT-PCR理論，依賴于3種技術(shù)1）RT-PCR技術(shù)2）以特定引物進(jìn)行的PCR技術(shù)3）DNA電泳技術(shù)

DD的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立3DD的原理DD的原理45’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動cDNA第一鏈合成不同長度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴增，克隆測序，同源比對隨機結(jié)合到cDNA鏈上5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly5DD目前的應(yīng)用領(lǐng)域主要用于醫(yī)學(xué)研究的癌癥、神經(jīng)、骨科、病理、生殖等領(lǐng)域動植物遺傳、育種，動物營養(yǎng)及微生物等領(lǐng)域DD目前的應(yīng)用領(lǐng)域主要用于醫(yī)學(xué)研究的癌癥、神經(jīng)、骨科、病理、6DD的優(yōu)點以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)靈敏度高，僅需0.2μg的總RNA可以同時比較多個樣品間基因表達(dá)的差異可以同時檢測到“上調(diào)”及“下調(diào)”的基因時間短，實驗過程中可步步驗證比較可進(jìn)行多基因家族的表達(dá)分析DD的優(yōu)點以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)7DD的缺點假陽性高樣品mRNA可能有部分降解有少量的DNA污染單條帶可能由一種以上cDNA片段所構(gòu)成有些特異cDNA片段太短,在Northern雜交時檢測不到雜交信號PCR擴增了一些稀有mRNA片段,在雜交時顯示不出差異表達(dá)的信號絕大多數(shù)差異條帶僅含有3’-UTR500bp以內(nèi)的一短片段的信息，這些區(qū)域的序列結(jié)構(gòu)相對保守，得不到特異的基因?qū)Φ拓S度mRNA檢出率低DD的缺點假陽性高8DD技術(shù)改進(jìn)針對以上不足,特別是假陽性率高的缺點，從以下幾個方面做了大量改進(jìn)：引物設(shè)計反應(yīng)條件的優(yōu)化顯示方法假陽性鑒定DD技術(shù)改進(jìn)針對以上不足,特別是假陽性率高的缺點，從以下幾個9DD在動物育種中的應(yīng)用比較不同品種間的差異尋找數(shù)量性狀QTL侯選基因研究雜種優(yōu)勢機制

比較世代間的差異

DD在動物育種中的應(yīng)用比較不同品種間的差異10DD在現(xiàn)代動物育種中的應(yīng)用展望目前主要致力于兩個品種或組合間比較我們在蘇淮白豬選育中的應(yīng)用思路：提高各世代豬群生產(chǎn)性能的遺傳穩(wěn)定性，建立和完善繁殖性能和肉質(zhì)性狀的DD技術(shù)分析新品系內(nèi)不同優(yōu)點的家系或類型間的遺傳相關(guān)檢測新品系豬與其它品種豬的遺傳距離DD在現(xiàn)代動物育種中的應(yīng)用展望目前主要致力于兩個品種或組合間11衷心感謝各位與會者衷心感謝各位與會者12引物設(shè)計mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴增效果最好王夏等在T12MN之前加上了一段T7啟動子序列，提高了PCR反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性Liang發(fā)現(xiàn)9~10個mer長度的隨機引物比較適宜Liang還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)長度為13bp，在5’端增加HindⅢ酶切位點，能更有效的擴增，并能提高特異性引物設(shè)計mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴增效果13反應(yīng)條件優(yōu)化RNA模板量在2-3μg時，能擴增出較多的條帶不同條件下dNTP濃度不是固定不變的1.5-2.0mmol/L的Mg2+濃度效果較好40-42℃的退火溫度通常能得到較好的擴增效果，周寧新等在PCR的頭兩個循環(huán)，用低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟?6℃，在隨后的循環(huán)中退火溫度提高到45℃，獲得了很清晰的電泳圖譜反應(yīng)條件優(yōu)化RNA模板量在2-3μg時，能擴增出較多的條帶14顯示方法最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進(jìn)行放射自顯影成像Sanguinetti介紹了一個快速銀染方法，只需15分鐘，而且容易克隆回收Rompf等通過瓊脂糖凝膠電泳分辨差異cDNA片段余桂華等建立了熒光mRNA差異顯示方法，最大限度地降低了假陽性顯示方法最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進(jìn)行放15假陽性的鑒定Northernblot仍是鑒定差異的一個主要手段；分析較多條帶，反向Northernblot是較為切合實際的選擇Heinz通過SSCP分析排除了非差異表達(dá)的cDNA污染Callard把純化后的PCR產(chǎn)物分成兩部分:一部分用于克隆，另一部分用作探針雜交以篩選克隆Sompayra設(shè)計了向5’步移的方法假陽性的鑒定Northernblot仍是鑒定差異的一個主要16比較不同品種間的差異Pan等應(yīng)用DD尋找杜洛克和二花臉豬背最長肌中差異表達(dá)的mRNA，對10條差異表達(dá)cDNA克隆、測序，有6條cDNA顯示與GenBank上已鑒定的基因類似，另外4條是未知基因比較不同品種間的差異Pan等應(yīng)用DD尋找杜洛克和二花臉豬背最17尋找數(shù)量性狀QTL侯選基因Janzen等用DD分離的差異表達(dá)cDNA片段與豬ARPP-16轉(zhuǎn)錄物的3‘末端一致，試驗組豬ARPP-16的表達(dá)量比對照組高4倍,提示豬ARPP-16基因可能在豬肌肉生長中起重要作用S.Ponsuksili應(yīng)用DD方法尋找豬眼肌面積的可能侯選ESTs，構(gòu)建4個RNA池，顯示了27條非共有條帶，有2個克隆顯示與已知基因有高同源性，2個克隆與EST序列相似M.D.Li等應(yīng)用DD方法發(fā)現(xiàn)梅山豬的TSH-β基因過量表達(dá)，大約為成年WC豬的3倍，推測β亞基的過量表達(dá)很可能是梅山豬比白豬合成系性成熟早的原因?qū)ふ覕?shù)量性狀QTL侯選基因Janzen等用DD分離的差異表達(dá)18研究雜種優(yōu)勢機制YGLiu應(yīng)用DD技術(shù)研究兩個雜交組合背最長肌中基因表達(dá)的差異，觀測到8個不同的典型表達(dá)模式，相關(guān)性分析表明，大白、梅山正反雜交組合與母體效應(yīng)有關(guān)，而在大白、長白雜交組合中，父本效應(yīng)在雜種的基因表達(dá)中起作用，或基因表達(dá)偏向于某一親本Liu(2005)等在研究大白和長白雜交組合背最長肌中基因表達(dá)的差異時，發(fā)現(xiàn)了一個豬的新基因，命名為豬的CA-Ⅲ基因，他催化可逆的二氧化碳水合作用，但還不確定與雜種優(yōu)勢是否相關(guān)研究雜種優(yōu)勢機制YGLiu應(yīng)用DD技術(shù)研究兩個雜交組合背19比較世代間的差異Ren等研究了梅山豬和大白豬及其正反F1代雜種豬背部皮下脂肪組織間的基因表達(dá)情況，4條EST分別與GenBank序列同源性較高，其余36條EST在親子代之間的差異表達(dá)方式不盡相同比較世代間的差異Ren等研究了梅山豬和大白豬及其正反F1代雜20南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院曲亮南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院曲亮21mRNA差異顯示技術(shù)（DD）及其對動物育種的作用曲亮黃瑞華*邱新深劉紅林王林云(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京，210095)

基金項目：江蘇省高技術(shù)研究項目（BG2005304）mRNA差異顯示技術(shù)（DD）及其對動物育種的作用曲亮黃瑞22DD的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達(dá)基因強有力的工具在隨后幾年里，Liang等在技術(shù)方面做了大量改進(jìn)，使技術(shù)更適用、更簡便基于RT-PCR理論，依賴于3種技術(shù)1）RT-PCR技術(shù)2）以特定引物進(jìn)行的PCR技術(shù)3）DNA電泳技術(shù)

DD的發(fā)明及其基礎(chǔ)由Liang于1992年創(chuàng)立23DD的原理DD的原理245’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉(zhuǎn)錄5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動cDNA第一鏈合成不同長度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴增，克隆測序，同源比對隨機結(jié)合到cDNA鏈上5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly25DD目前的應(yīng)用領(lǐng)域主要用于醫(yī)學(xué)研究的癌癥、神經(jīng)、骨科、病理、生殖等領(lǐng)域動植物遺傳、育種，動物營養(yǎng)及微生物等領(lǐng)域DD目前的應(yīng)用領(lǐng)域主要用于醫(yī)學(xué)研究的癌癥、神經(jīng)、骨科、病理、26DD的優(yōu)點以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)靈敏度高，僅需0.2μg的總RNA可以同時比較多個樣品間基因表達(dá)的差異可以同時檢測到“上調(diào)”及“下調(diào)”的基因時間短，實驗過程中可步步驗證比較可進(jìn)行多基因家族的表達(dá)分析DD的優(yōu)點以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)27DD的缺點假陽性高樣品mRNA可能有部分降解有少量的DNA污染單條帶可能由一種以上cDNA片段所構(gòu)成有些特異cDNA片段太短,在Northern雜交時檢測不到雜交信號PCR擴增了一些稀有mRNA片段,在雜交時顯示不出差異表達(dá)的信號絕大多數(shù)差異條帶僅含有3’-UTR500bp以內(nèi)的一短片段的信息，這些區(qū)域的序列結(jié)構(gòu)相對保守，得不到特異的基因?qū)Φ拓S度mRNA檢出率低DD的缺點假陽性高28DD技術(shù)改進(jìn)針對以上不足,特別是假陽性率高的缺點，從以下幾個方面做了大量改進(jìn)：引物設(shè)計反應(yīng)條件的優(yōu)化顯示方法假陽性鑒定DD技術(shù)改進(jìn)針對以上不足,特別是假陽性率高的缺點，從以下幾個29DD在動物育種中的應(yīng)用比較不同品種間的差異尋找數(shù)量性狀QTL侯選基因研究雜種優(yōu)勢機制

比較世代間的差異

DD在動物育種中的應(yīng)用比較不同品種間的差異30DD在現(xiàn)代動物育種中的應(yīng)用展望目前主要致力于兩個品種或組合間比較我們在蘇淮白豬選育中的應(yīng)用思路：提高各世代豬群生產(chǎn)性能的遺傳穩(wěn)定性，建立和完善繁殖性能和肉質(zhì)性狀的DD技術(shù)分析新品系內(nèi)不同優(yōu)點的家系或類型間的遺傳相關(guān)檢測新品系豬與其它品種豬的遺傳距離DD在現(xiàn)代動物育種中的應(yīng)用展望目前主要致力于兩個品種或組合間31衷心感謝各位與會者衷心感謝各位與會者32引物設(shè)計mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴增效果最好王夏等在T12MN之前加上了一段T7啟動子序列，提高了PCR反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性Liang發(fā)現(xiàn)9~10個mer長度的隨機引物比較適宜Liang還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)長度為13bp，在5’端增加HindⅢ酶切位點，能更有效的擴增，并能提高特異性引物設(shè)計mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴增效果33反應(yīng)條件優(yōu)化RNA模板量在2-3μg時，能擴增出較多的條帶不同條件下dNTP濃度不是固定不變的1.5-2.0mmol/L的Mg2+濃度效果較好40-42℃的退火溫度通常能得到較好的擴增效果，周寧新等在PCR的頭兩個循環(huán)，用低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟?6℃，在隨后的循環(huán)中退火溫度提高到45℃，獲得了很清晰的電泳圖譜反應(yīng)條件優(yōu)化RNA模板量在2-3μg時，能擴增出較多的條帶34顯示方法最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進(jìn)行放射自顯影成像Sanguinetti介紹了一個快速銀染方法，只需15分鐘，而且容易克隆回收Rompf等通過瓊脂糖凝膠電泳分辨差異cDNA片段余桂華等建立了熒光mRNA差異顯示方法，最大限度地降低了假陽性顯示方法最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進(jìn)行放35假陽性的鑒定Northernblot仍是鑒定差異的一個主要手段；分析較多條帶，反向Northernblot是較為切合實際的選擇Heinz通過SSCP分析排除了非差異表達(dá)的cDNA污染Callard把純化后的PCR產(chǎn)物分成兩部分:一部分用于克隆，另一部分用作探針雜交以篩選克隆Sompayra設(shè)計了向5’步移的方法假陽性的鑒定Northernblot仍是鑒定差異的一個主要36比較不同品種間的差異Pan等應(yīng)用DD尋找杜洛克和二花臉豬背最長肌中差異表達(dá)的mRNA，對10條差異表達(dá)cDNA克隆、測序，有6條cDNA顯示與GenBank上已鑒定的基因類似，另外4條是未知基因比較不同品種間的差異Pan等應(yīng)用DD尋找杜洛克和二花臉豬背最37尋找數(shù)量性狀QTL侯選基因Janzen等用DD分離的差異表達(dá)cDNA片段與豬ARPP-16轉(zhuǎn)錄物的3‘末端一致，試