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文檔簡介
第八章植物細(xì)胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)第一節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)(plantcellculture):指對植物器官或愈傷組織上分離出來的單細(xì)胞(或小細(xì)胞團(tuán))進(jìn)行培養(yǎng),形成單細(xì)無性系或再生植物的技術(shù)。植物細(xì)胞培養(yǎng)的意義:(1)研究細(xì)胞生理代謝過程及各種影響因子;(2)用于植物品種的改良;(3)用于植物次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)。一、單細(xì)胞培養(yǎng)(通常以葉片為材料)(一)單細(xì)胞的分離 分離方法:機(jī)械法和酶解法。各有優(yōu)缺點。(二)單細(xì)胞培養(yǎng) 對分離得到的單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),誘導(dǎo)其分裂增殖,形成細(xì)胞團(tuán),再通過細(xì)胞分化形成芽、根等器官或胚狀體,直到長成完整植株的技術(shù)。 培養(yǎng)方法:平板培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)法。(1)平板培養(yǎng)法:分散的植物細(xì)胞接種于含薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)過程稱為平板培養(yǎng)法。方法是將經(jīng)機(jī)械破碎過篩或酶(纖維素酶及果膠酶等)消化分散純化的細(xì)胞,經(jīng)計數(shù)及稀釋,接種到加熱熔化而剛冷卻至35℃左右的固體培養(yǎng)基中充分混勻,傾入培養(yǎng)皿中,石蠟密封,于25℃培養(yǎng),約20天后細(xì)胞即可生長成團(tuán)。統(tǒng)計生長情況。(3)微室培養(yǎng)法:懸浮單細(xì)胞接種于凹玻片或玻璃環(huán)與蓋玻片組成的微室內(nèi)的固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。二、細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)(cellsuspensionculture)
是指將游離的植物細(xì)胞按一定的細(xì)胞密度,懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法。適宜于大規(guī)模培養(yǎng),細(xì)胞工程產(chǎn)業(yè)的技術(shù)基礎(chǔ)。
(二)懸浮培養(yǎng)類型:1.分批培養(yǎng)(Batchculture):
分批培養(yǎng)是在一個封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)物增加到一定量時,需繼代培養(yǎng),即取出少量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)液中。 生長過程與微生物類似,有延遲期、對數(shù)生長期、減慢期及靜止期等階段。接種時細(xì)胞要達(dá)到一定細(xì)胞濃度,通常為0.25xl06細(xì)胞/ml-0.5x106細(xì)胞/m1。
B.連續(xù)培養(yǎng)(Continuousculture):是用一定容積的非密閉系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法,在培養(yǎng)過程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基,而使?fàn)I養(yǎng)物連續(xù)得到補(bǔ)充,細(xì)胞生長和增殖連續(xù)進(jìn)行,同時有等體積的培養(yǎng)物排除系統(tǒng)。分為封閉型和開放型連續(xù)培養(yǎng)兩種。C.半連續(xù)培養(yǎng):是利用培養(yǎng)罐等裝置進(jìn)行細(xì)胞大量培養(yǎng)的一種方式。在半連續(xù)培養(yǎng)時,當(dāng)培養(yǎng)容器內(nèi)細(xì)胞增殖到一定數(shù)量后,倒出一半細(xì)胞懸浮液于另一培養(yǎng)罐等容器,再分別加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。半連續(xù)培養(yǎng)能夠重復(fù)獲得大量均一的培養(yǎng)細(xì)胞供進(jìn)一步利用。
(三)優(yōu)良懸浮培養(yǎng)體系要求:
A.懸浮培養(yǎng)物分散性好,細(xì)胞團(tuán)較小,一般由幾十個以下的細(xì)胞組成。B.均一性好,細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。C.生長迅速,懸浮細(xì)胞的量一般2—3天甚至更短時間便可增加一倍。三、細(xì)胞培養(yǎng)的特性:
1.植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大,具有纖維素細(xì)胞壁,抗剪切力差;2.細(xì)胞生長速度慢,易受微生物污染,有時需用抗生素;3.細(xì)胞生長的中期及對數(shù)期,易凝聚為直徑達(dá)350um一400um的團(tuán)塊,懸浮培養(yǎng)較困難;4.培養(yǎng)時需供氧,培養(yǎng)液粘度大,不能耐受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌;并具有群體效應(yīng)5.培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi),且產(chǎn)量較低,培養(yǎng)過程具有結(jié)構(gòu)與功能全能性。
四、植物細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求及培養(yǎng)基1.營養(yǎng)需求:
植物細(xì)胞生長所需營養(yǎng)較微生物細(xì)胞復(fù)雜,除水分外,其它營養(yǎng)成分可分為如下幾類:
(1)無機(jī)營養(yǎng):如N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等;
(2)維生素:如維生素B1、B6、煙酸、肌醇、生物素、泛酸鈣及葉酸等;
(3)碳源:如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等;
(4)天然物:如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸薺汁、生梨汁及蘋果汁等;
(5)植物激素:如生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸;其它有油菜素內(nèi)酯、三十烷醇、肽類、半支蓮醇、月光花素、石蒜素、玉米素等;(6)氨基酸類:如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、賴氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氯酸、蘇氨酸、酪氨釀、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等;(7)核酸及其水解物:如DNA、RNA、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤及胸腺嘧啶等;(8)其它成分:如氯化膽堿、膽質(zhì)素、膠氨酸、蘋果酸及反丁烯二酸等.2.培養(yǎng)基:
(1)固體培養(yǎng)基:添加瓊脂等
(2)液體培養(yǎng)基:不加瓊脂等SyntheticseedsofMulberryandbanana第三節(jié)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)及細(xì)胞融合植物原生質(zhì)培養(yǎng)和細(xì)胞融合可用產(chǎn)生遠(yuǎn)緣雜種;是目前植物細(xì)胞及基因工程的核心技術(shù)。一、植物原生質(zhì)體培養(yǎng)通過一定方法除去細(xì)胞壁,而得到一個裸露的植物細(xì)胞,即為原生質(zhì)體(Protoplast)。游離的原生質(zhì)體像正常的植物細(xì)胞那樣具有全能性,在一定條件下培養(yǎng)可以重新再生出完整植株。
自1970年首次獲得煙草原生質(zhì)體再生植株成功以來,通過原生質(zhì)體獲得再生植株的植物約有280余種,其中有20種為我國首先報道。原生質(zhì)體培養(yǎng)包括原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)、植株再生等過程。(2)預(yù)處理:
A.預(yù)質(zhì)壁分離:17-20℃酶液中靜置半小時,再于28—34℃保溫,或?qū)⒉牧现糜谂c酶液中糖濃度相同的溶液中預(yù)培養(yǎng)1h左右,再浸于酶液中消化即可達(dá)到質(zhì)壁分離目的;
B.預(yù)培養(yǎng):將除去下表皮的葉片于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天,再用酶消化去壁,所得原生質(zhì)體分裂頻率較高;
C.暗處理:將室溫下生長5—7個星期的植物材料在黑暗中放置30h以上,取其葉片制備的原生質(zhì)體有活力;
D.光處理:將葉片于日光或燈光下照射2—6h令其萎蔫,利于撕除下表皮及原生質(zhì)體分離;
E.低溫處理:夏季應(yīng)用的實驗材料其萌動種子應(yīng)于4℃過夜后再播種,從其植株葉片上分離的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果較佳。2.制備原生質(zhì)體的酶類:高等植物細(xì)胞壁主要成分為a-纖維素,其次為半纖維素、果膠質(zhì)及蛋白質(zhì)。細(xì)胞生長的不同階段及不同物種的細(xì)胞壁組成與結(jié)構(gòu)不同,木質(zhì)化及次生加厚的細(xì)胞壁不被酶消化,故選擇材料和消化細(xì)胞壁的酶類是制備原生質(zhì)體關(guān)鍵。常用的酶類有:A.纖維素酶,如OnozukaR—10及RS,國內(nèi)常用的為EA3—867,其中含少量果膠酶;B.果膠酶,如MacerozymeR—10又叫離析酶,主要含果膠酶,活力較高,其含雜酶較多,用量不超過2%,作用時間長有毒害作用;此外亦用PectalyaseY—23,也叫離析軟化酶,活力極高,葉片用量一般為0.1%,懸浮細(xì)胞為0.05%;C.崩潰酶(Driselase),為一種粗酶制劑,具有纖維素酶及果膠酶活性;D.半纖維素酶,如RhozymeHP150,用于懸浮細(xì)胞、豆科根瘤、幼苗子葉及根細(xì)胞原生質(zhì)體的分離;E蝸牛酶,主要用于體細(xì)胞原生質(zhì)體分離。酶液配制:
需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl2·2H20(0.1mmol/l一10mo1/l)及KH2PO4(0.75mmol/l)等滲透穩(wěn)定劑,以維持原生質(zhì)體完整性。酶液pH值相當(dāng)重要,纖維素酶及果膠酶單獨(dú)使用時,其pH分別以5.4及5.8為宜;混合使用時pH5.4-pH5.6為宜,降至4.8以下則原生質(zhì)體破裂。酶液配制后需以0.45um微孔膜過濾除菌,而不可采用加熱滅菌法。3.原生質(zhì)體分離及純化(1)分離:原生質(zhì)體分離有機(jī)械法及酶消化法,前者產(chǎn)量極低而不多用、后者又分一步法及二步法。一步法是將材料在2l一28℃用纖維素酶及果膠酶混合液一次性處理2—24h。二步法是將材料先用果膠酶降解胞間膠層得到單細(xì)胞,再用纖維素酶脫壁而釋放原生質(zhì)體。(2)純化
A.沉降法:原生質(zhì)體混合物經(jīng)微孔過濾后,低速(150g)離心5min,沉淀再用與酶液具相同糖濃度溶液反復(fù)洗3-4次,后用培養(yǎng)液洗滌備用;B.飄浮法:離心法純化的原生質(zhì)體若含較多碎片及少量老細(xì)胞時.可用20%蔗糖離心,原生質(zhì)體浮于液面.碎片及老細(xì)胞沉降而得以純化,純度高,但產(chǎn)量低;C.不連續(xù)梯度離心法:將原生質(zhì)粗提液置于不連續(xù)濃度梯度的溶液中,經(jīng)離心后分離不同比重的原生質(zhì)體。
4.原生質(zhì)體活力測定
純化的原生質(zhì)體需經(jīng)活力測定后方可用于培養(yǎng)。(1)根據(jù)形態(tài)待征判斷其活力:原生質(zhì)體呈綠色(若來源于葉片)及圓而鼓者為活原生質(zhì)體。(2)熒光染料活體染色法:熒光素染料可自由透過細(xì)胞膜,在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解為熒光素,后者不能自由透過細(xì)胞膜而滯留于細(xì)胞內(nèi),在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光強(qiáng)度即可判斷原生質(zhì)體死活。(3)酚藏花紅染色法:活原生質(zhì)體能吸收呈紅色,無活性的則不能吸收而無色。(二)原生質(zhì)體培養(yǎng):1.培養(yǎng)方法:(1)固體培養(yǎng):平板培養(yǎng)法,1.2%瓊脂。(2)液體培養(yǎng):
A.淺層培養(yǎng)法:其過程是將1m1原生質(zhì)體懸液置于直徑4cm培養(yǎng)皿或25m1三角瓶中使成薄層后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng).初期振搖1—2次,防止粘壁;
B.固液結(jié)合培養(yǎng)法:在混好原生質(zhì)體的固體培養(yǎng)基表面加一層相同成分的液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。效果較好。2.培養(yǎng)條件:
密度:平板培養(yǎng)103~104個/ml,液體培養(yǎng)104~105個/ml溫度:多數(shù)為25-28oC,少數(shù)16~37oC光照:500lx,18h或2800lx連續(xù)光照多數(shù)要求黑暗或弱光3.細(xì)胞壁再生及細(xì)胞分裂:
l一3天即再生新細(xì)胞壁,表現(xiàn)為體積增加、膨大,再由圓變橢圓??捎觅|(zhì)壁分離法證實。也可用0.1%ST型或WBL型熒光增白劑染色,經(jīng)前者染色,有細(xì)胞壁者在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色熒光。經(jīng)后者染色,有細(xì)胞壁者發(fā)射綠色熒光。在原生質(zhì)培養(yǎng)過程中,胞質(zhì)增加,液泡減少,葉綠體或顆粒內(nèi)含物分散于泡質(zhì)中或圍繞于細(xì)胞核周圍.常在1一2周內(nèi)發(fā)生第一次分裂。不同細(xì)胞分裂頻率不同。4、愈傷組織或胚狀體形成
原生質(zhì)體再生的細(xì)胞一旦開始分裂,就可能繼續(xù)生長:A形成細(xì)胞團(tuán),發(fā)育成愈傷組織;B.形成胚狀體,再產(chǎn)生植株;C.形成愈傷組織,再形成胚狀體。隨著細(xì)胞分裂及細(xì)胞團(tuán)形成,已與常規(guī)細(xì)胞和組織培養(yǎng)相同,故培養(yǎng)3—4周需添加含一定量低滲穩(wěn)定劑的新培養(yǎng)基,以滿足細(xì)胞的營養(yǎng),亦利于細(xì)胞團(tuán)及小愈傷組織的生長。
5.植株再生
大多經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)分化再生為完整植株。當(dāng)愈傷組織達(dá)到1—2mm時,轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)器官分化。分化培養(yǎng)基與原生質(zhì)體培養(yǎng)基差別在于:(1)只用蔗糖為碳源,不加滲透穩(wěn)定劑;(2)與原生質(zhì)體培養(yǎng)基相反,細(xì)胞分裂素濃度高于生長素;(3)在誘導(dǎo)器官分化過程中,一般采用15001x左右的高光強(qiáng)。誘導(dǎo)器官分化的溫度與原生質(zhì)體培養(yǎng)基本相同。
(三)原生質(zhì)體培養(yǎng)的目的:
1、利用原生質(zhì)體不具細(xì)胞壁的特性可以進(jìn)行細(xì)胞器移植和外源物的攝取,原生質(zhì)體之間可以進(jìn)行融合而產(chǎn)生雜種細(xì)胞(即體細(xì)胞雜交)。2、是植物基因工程的理想受體,用外源遺傳物質(zhì)對植物原生質(zhì)體進(jìn)行改造和轉(zhuǎn)化,然后誘導(dǎo)分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。3、也是研究細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、體細(xì)胞無性系變異和植物病理學(xué)研究的有用工具。A-E,培養(yǎng)的歐當(dāng)歸(LevisticumofficinaleKoch))原生質(zhì)體分裂再生成植株的過程F-L,培養(yǎng)過程的核變化;F.多核,G.核穿壁,H.無絲分裂,I.染色體橋,J.2n=22,K.L.多倍體.A-D當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv)Diels)原生質(zhì)體培養(yǎng)成再生苗E-H,紅豆草(OnobrychisvicaefoliaScop))原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株二、原生質(zhì)體融合:
在外界因素作用下,兩個或兩個以上植物細(xì)胞合并成一個多核細(xì)胞的過程稱為植物細(xì)胞融合,或植物體細(xì)胞雜交。但由于植物細(xì)胞具有堅硬的細(xì)胞壁,不能直接融合,需經(jīng)酶消化除去細(xì)胞壁釋放出原生質(zhì)體,后者生理、生化及遺傳學(xué)特性與完整細(xì)胞基本相同。在適當(dāng)條件下來源不同的植物原生質(zhì)體可產(chǎn)生融合作用,并可再生細(xì)胞壁,形成完整植株。1、作用:(1)可實現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交,獲得種間雜種,克服有性雜交配子不親合性;(2)可獲得含另一親本非整倍體雜種或胞質(zhì)雜種,且獲得的遺傳變異范圍極廣;(3)一次操作可實現(xiàn)兩個以上親本的融合作用(4)可獲得呈現(xiàn)雙親個體基因型總和的雜種;(5)可形成有性生殖障礙植物的種間雜種;2.促融因素:(1)NaNO3誘導(dǎo),NaNO3可中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷,促進(jìn)原生質(zhì)體聚集,對原生質(zhì)體無損害,但融合率低;(2)高Ca2+和高pH值誘導(dǎo);(3)PEG(聚乙二醇)誘導(dǎo),在高濃度PEG溶
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