硅膠柱層析技術(shù)課件

硅膠柱層析技術(shù)常說的過柱子應(yīng)該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。其實硅膠柱層析技術(shù)也可以稱作硅膠吸附柱色譜技術(shù)色譜法，又稱層析法。是一種以分配平衡為機理的分配方法。色譜體系包含兩個相，一個是固定相，一個是流動相。當兩相相對運動時，反復(fù)多次的利用混合物中所含各組分分配平衡性質(zhì)的差異，最后達到彼此分離的目的。色譜法按固定相的狀態(tài)可分為柱色譜、平板色譜和棒色譜三種，而實驗室中最常用的是柱層析和薄層層析，以及它們之間的配合應(yīng)用。2.3裝柱2.3.1吸附劑的加入①干法：將吸附劑一次加入色譜管，振動管壁使其均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入開始層析時使用的流動相，或?qū)⑸V管下端出口加活塞，加入適量的流動相，旋開活塞使流動相緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤濕下沉，在管內(nèi)形成松緊適度的吸附層。操作過程中應(yīng)保持有充分的流動相留在吸附層的上面。②濕法：將吸附劑與流動相混合，攪拌以除去空氣泡，徐徐傾入色譜管中，然后再加入流動相，將附著于管壁的吸附劑洗下，使色譜柱表面平整。俟填裝吸附劑所用流動相從色譜柱自然流下，液面將與柱表面相平時，即加試樣溶液。2.3.2試樣的加入①將試樣溶于層析時使用的流動相中，再沿色譜管壁緩緩加入。注意勿使吸附劑翻起。②或?qū)⒃嚇尤苡谶m當?shù)娜軇┲?，與少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發(fā)去盡后使呈松散狀；將混有試樣的吸附劑加在已制備好的色譜柱上面。如試樣在常用溶劑中不溶解，可將試樣與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。2.4洗脫除另有規(guī)定外，通常按流動相洗脫能力大小，遞增變換流動相的品種和比例，分別分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時，再改變流動相的品種和比例。操作過程中應(yīng)保持有充分的流動相留在吸附層的上面。2.5檢測2.5.1初步檢測當沖洗溶劑流出一定量后，可對流出液進行初步檢測，并且將錐形瓶更換成小試管進行收集。一般只進行初步的快捷檢測，因此通常是取一小薄層板，用鉛筆和直尺將硅膠板分劃成多個小方塊，并按一定的次序編號。取一根內(nèi)徑為0.3mm左右的玻璃毛細管蘸取少量流出液，點于薄層板的一個小格內(nèi)，待半點干后，然后用物理的或化學(xué)的方法檢測。2.5.2正式檢測①點樣:取分部收集的沖洗溶液進行分別直接點樣,如果沖洗溶液太稀,濃度太小,可先濃縮.點樣的容器一般用玻璃毛細管,點樣斑點的直徑一般為3-5mm.②展開:在普通的展開槽中進行,展開方式常選用上行展開.③展開劑:使用沖洗溶液.④顯色:一般常用物理檢測法和化學(xué)檢測法.物理檢測法中首先有紫外光法,紫外光常用兩種波長(254nm與365nm).其次是碘蒸氣顯色法.化學(xué)檢出法通常驚醒顯色劑直接噴霧.顯色劑有通用顯色劑和專用顯色劑.通用顯色劑最常見的是硫酸-乙醇或甲醇(1:1)溶液,噴霧后,有的化合物立即反應(yīng),但多數(shù)化合物需加熱后經(jīng)歷數(shù)分鐘才顯色,不同化合物的反應(yīng)不同,所以顏色也往往不同.專用顯色劑是指對某個或某一類化合物顯色的試劑,利用化合物本身的特有性質(zhì),或利用其所含的某些官能團的特殊反應(yīng).展開后根據(jù)斑點的,可以粗略的估計待分離物的含量的大小.3、色譜柱的選擇柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產(chǎn)品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。①減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)（有時在柱子外面有水汽凝結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長）。②加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。③常壓柱色譜，又稱柱層析，是色譜法中最常見的一種。它的突出優(yōu)點是，分離效率比經(jīng)典的化學(xué)分離方法高的多，與其他色譜法相比，不需要昂貴的儀器設(shè)備，更換流動相和吸附劑方便，消耗材料少，成本低，適合分離取樣量從克到微克級范圍很寬的各種樣品，因此在化學(xué)實驗室中至今仍被廣泛應(yīng)用。①微量圓環(huán)法:將欲分離的物質(zhì),按常規(guī)方法點在薄板,兩點相距2-3cm,再用毛細管吸取所實驗的溶劑系統(tǒng),垂直放于樣點中心,讓溶劑自毛細管中依中立流出進行展開,干燥后顯色.觀察斑點的分離情況.背試物質(zhì)為未知化和物時,常先用低極性溶劑展開,如式樣留在圓點不動,則需增加溶劑的極性或增大洗脫液的量,如移動過快,則必須用較低極性的溶劑來調(diào)整.②小型色譜法.用普通的載薄片制成薄板,把欲分離的物質(zhì)點載薄板上,放于小型玻璃缸或廣口瓶中展開,干燥后顯色,觀察斑點分離情況.4.3顯色展開后,如物質(zhì)有色,可明顯的在薄層上觀察到它們的位置.如無色,則要通過一定的方法顯色,定位,一邊確定斑點的位置及大小.4.4常用溶劑的極性常用溶劑的極性順序：石油醚〈環(huán)己烷/己烷〈苯〈乙醚〈氯仿〈乙酸乙酯〈正丁醇〈丙酮〈乙醇〈甲醇〈水。在薄層色譜中,當溶劑的極性太大時.會使待分離物全部接近溶劑前沿,當溶劑的極性太小時,又會使待分離物幾乎全部保留在圓點,這兩種情況都是待分離物得不到分離.使用單一溶劑，往往不能達到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個高極性和低極性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區(qū)分度的作用，常用的溶劑組合有：Petroleumether/Ethylacetate,Petroleumether/Acetone,Petroleumether/Ether,Petroleumether/CH2Cl2,CH2Cl2/ethylacetate,ethylacetate/MeOH,CHCl3/ethylacetate柱層析

極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng)極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸1、稱量

200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。2、攪成勻漿加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分攪拌。如果洗脫劑是石油醚/乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明溶劑中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話，必須預(yù)先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對酸敏感，不能用氯仿體系過柱。勻漿法3、裝柱將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入約1/3體積石油醚（氯仿），裝上蓄液球，打開柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi)。隨著沉降，會有一些硅膠沾在蓄液球內(nèi)，用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。4、壓實沉降完成后，加入更多的石油醚（氯仿），用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無論走常壓柱或加壓柱，都應(yīng)進行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過柱時由于柱床萎縮產(chǎn)生開裂。5、上樣干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑，而不會沖壞硅膠表面。6、過柱和收集柱層析實際上是在擴散和分離之間的權(quán)衡。太低的洗脫強度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子：10mg上樣量，1g硅膠H，0.5ml收一餾分；1-2g上樣量，50g硅膠（200-300目），20-50ml收一餾分。TIPS:1.先根據(jù)TLC方法篩選好洗脫劑，使兩相鄰物質(zhì)Rf值之差最大化2.將柱子必須裝平整、均勻3.考慮有限柱填料的吸附量4.可考慮用梯度法分開并洗脫柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產(chǎn)品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)（有時在柱子外面有水汽凝結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長）。加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。關(guān)于無水無氧柱，適用于對氧，水敏感，易分解的產(chǎn)品。現(xiàn)在見到的柱子徑高比一般在1：5～10，書中寫硅膠量是樣品量的30～40倍，具體的選擇要具體分析。如果所需組分和雜質(zhì)分的比較開（是指在所需組分rf在0.2～0.4，雜質(zhì)相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我覺得可以增加柱子的直徑，比如用3cm的，也可以減小淋洗劑的極性等等。關(guān)于濕法、干法上樣濕法上樣，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好，不然溶劑就成了淋洗劑了。很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒關(guān)系?？墒怯械纳蠘雍笤诠枘z上又會析出，這一般都是比較大量的樣品才會出現(xiàn)，是因為硅膠對樣品的吸附飽和，而樣品本身又是比較好的固體才會發(fā)生，這就應(yīng)該先重結(jié)晶，得到大部分的產(chǎn)品后再柱分，如果不能重結(jié)晶那就不管它了，直接過就是了，樣品隨著淋洗劑流動會溶解的。干法上樣，一般用于固體或粘度大的液體樣品。樣品用低沸點易溶溶劑溶解，加入1-3倍的粗硅膠，晾干或旋干，干燥的標準是硅膠成細粉而不粘在瓶壁上。裝好的柱子上留一段溶劑，把吸附了樣品的硅膠慢慢到進去，震動柱子或再加一些溶劑，把粘在柱壁上的硅膠洗下。由于某些原因，用到的淋洗劑多是大包裝的（便宜嘛），我們這里是用10升或25升的塑料桶裝的，就要注意這些工業(yè)品的純度是較低的。經(jīng)常能夠從送來的大桶底部看見有色的雜質(zhì)，其他的雜質(zhì)就可想而知了，所以在比較嚴格的柱分時就要對溶劑重蒸。當然過原料時就可以免去這一步了，反正下面還有提純的方法。另外溶劑在過柱子后最好也回收使用，一方面環(huán)保，另一方面也能節(jié)省部分經(jīng)費，缺點是要消耗一定的人工。這里要注意的是，一般在過柱同時進行的是減壓旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于揮發(fā)度的不同會導(dǎo)致極性的變化，一般會使得極性變大，在梯度淋洗時比較合適，正好極性越來越大了。在過完柱子后，溶劑最后回收要采用常壓，因為在減壓旋蒸時會有部分低沸點的雜質(zhì)一起出來，常壓時就會減少這種現(xiàn)象，如果雜質(zhì)和你下面要過的樣品有反應(yīng)那就慘了。關(guān)于操作問題1裝柱柱子下面的活塞一定不要涂潤滑劑，會被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的，可以采用四氟節(jié)門（T型四氟節(jié)門三通接頭）的。干法和濕法裝柱覺得沒什么區(qū)別，只要能把柱子裝實就行。裝完的柱子應(yīng)該要適度的緊密（太密了淋洗劑走的太慢），一定要均勻（不然樣品就會從一側(cè)斜著下來）。書中寫的都是不能見到氣泡，我覺得在大多數(shù)情況下有些小氣泡沒太大的影響，一加壓氣泡就全下來了。當然如果你裝的柱子總是有氣泡就說明需要多練習(xí)了。但是柱子更忌諱的是開裂，甭管豎的還是橫的，都會影響分離效果，甚至作廢！2加樣用少量的溶劑溶樣品加樣，加完后將下面的活塞打開，待溶劑層下降至石英砂面時，再加少量的低極性溶劑，然后再打開活塞，如此兩三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑，一開始不要加壓，等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離（2～4cm就夠了），再加壓，這樣避免了溶劑（如二氯甲烷等