肺炎鏈球菌的分離和鑒定

（優(yōu)選）肺炎鏈球菌的分離和鑒定第一頁，共四十八頁。概述

肺炎鏈球菌（S.pneumoniae），俗稱肺炎球菌（pneumococcus）。經(jīng)常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成帶菌狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或嬰幼兒、老年體弱者易發(fā)生肺炎鏈球菌性肺部感染。第二頁，共四十八頁。

肺炎鏈球菌不產(chǎn)生外毒素，主要靠莢膜侵襲力致病。肺炎鏈球菌主要引起人類大葉性肺炎，肺炎后可繼發(fā)胸膜炎、膿胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻竇炎、支氣管炎、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和敗血癥等。

第三頁，共四十八頁。

細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)不僅對(duì)疾病的病原學(xué)診斷有重要價(jià)值，同時(shí)對(duì)臨床治療的藥物選擇也具有十分重要意義。第四頁，共四十八頁。

一、生物學(xué)性狀第五頁，共四十八頁。1.形態(tài)與染色肺炎鏈球菌革蘭染色呈陽性。球形或矛頭狀，成雙排列，少呈鏈狀。在組織中可形成莢膜（人工培養(yǎng)莢膜逐漸消失），無鞭毛及芽孢。第六頁，共四十八頁。第七頁，共四十八頁。第八頁，共四十八頁。第九頁，共四十八頁。2.培養(yǎng)特點(diǎn)（1）培養(yǎng)基肺炎鏈球菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，需采用質(zhì)量好的哥倫比亞血液平板（

5％馬血或羊血）。第十頁，共四十八頁。（2）分離培養(yǎng)1）標(biāo)本處理

及時(shí)將采集標(biāo)本接種到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上是提高分離率的前提。因?yàn)?，肺炎鏈球菌?duì)干燥、對(duì)寒冷的抵抗力均較弱，在標(biāo)本離開機(jī)體暴露于外界復(fù)雜的環(huán)境中，其存活率十分低，不及時(shí)接種適當(dāng)培養(yǎng)基是導(dǎo)致分離率低的主要原因。第十一頁，共四十八頁。2）選擇性分離培養(yǎng)基培養(yǎng)基中添加5μg/ml慶大霉素有利于肺炎鏈球菌的分離。第十二頁，共四十八頁。3）培養(yǎng)環(huán)境

5～10％CO2、35℃培養(yǎng)24～48h。第十三頁，共四十八頁。（3）肺炎鏈球菌的菌落形態(tài)在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，肺炎鏈球菌形成扁平、中間有凹陷的典型菌落，少數(shù)菌可呈粘液型菌落。第十四頁，共四十八頁。第十五頁，共四十八頁。第十六頁，共四十八頁。第十七頁，共四十八頁。肺炎鏈球菌第十八頁，共四十八頁。肺炎鏈球菌第十九頁，共四十八頁。第二十頁，共四十八頁。肺炎鏈球菌第二十一頁，共四十八頁。3.抗原結(jié)構(gòu)（1）種屬特異性抗原：為菌體多糖抗原，存在于肺炎鏈球菌的細(xì)胞壁。（2）型特異性抗原：是存在于肺炎鏈球菌莢膜中的一種多糖多聚體，可溶于水，據(jù)此抗原可將肺炎鏈球菌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等個(gè)型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最強(qiáng)。（3）菌體核蛋白抗原：存在于菌體深部，為蛋白質(zhì)，無特異性。第二十二頁，共四十八頁。二、肺炎鏈球菌鑒定肺炎鏈球菌的鑒定，主要應(yīng)與甲型溶血性鏈球菌鑒別。其中以膽汁溶菌試驗(yàn)、菊糖發(fā)酵和optochin試驗(yàn)最為常用。必要時(shí)可作莢膜腫脹試驗(yàn)或小鼠毒力試驗(yàn)加以鑒別。在上述試驗(yàn)中，肺炎鏈球菌均應(yīng)陽性，而甲型溶血性鏈球菌為陰性。也可用特異性單克隆乳膠或自動(dòng)化儀器等相應(yīng)鑒定卡作鑒定。第二十三頁，共四十八頁。肺炎鏈球菌鑒定要點(diǎn)

革蘭陽性雙球菌，矛頭狀，不呈鏈；血平皿菌落呈草綠溶血，濕潤(rùn)，菌落表面無小白點(diǎn)；培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)出現(xiàn)臍窩狀；膽汁溶解試驗(yàn)陽性；莢膜腫脹試驗(yàn)陽性；乳膠單克隆抗體凝集陽性。第二十四頁，共四十八頁。1.溶血性檢查肺炎鏈球菌在厭氧或二氧化碳環(huán)境中溶血能力大大加強(qiáng)，草綠色溶血環(huán)很大，可與其他草綠色鏈球菌相區(qū)別。第二十五頁，共四十八頁。2.Optochin(OP，奧普托欣)敏感試驗(yàn)該藥對(duì)肺炎鏈球菌的作用機(jī)制是干擾其葉酸的合成。optochin敏感試驗(yàn)方法是藥敏試驗(yàn)。挑取被檢菌，密涂于血平板上，貼上含5μg/片的optochin紙片，置5~10%CO2的大氣中（或燭缸），35℃孵育過夜。抑菌環(huán)直徑>=14mm為敏感，推斷為肺炎鏈球菌。抑菌環(huán)直徑<14mm時(shí)參照膽汁溶菌試驗(yàn)。肺炎鏈球菌的抑制圈直徑常在20mm以上，甲型溶血性鏈球菌（約98%）小于12mm。

第二十六頁，共四十八頁。

也有例外，我們?cè)趯?shí)際工作中檢出過耐optochin的肺炎鏈球菌，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的緩癥鏈球菌和部分口腔鏈球菌對(duì)optochin的抑菌環(huán)直徑>=14mm。應(yīng)注意鑒別。但大多數(shù)肺炎鏈球菌對(duì)苯唑西林（Oxacillin,OX）是敏感的(除外PRP)，而緩癥鏈球菌和口腔鏈球菌對(duì)OX耐藥。這可作為輔助鑒別點(diǎn)。第二十七頁，共四十八頁。第二十八頁，共四十八頁。肺炎鏈球菌第二十九頁，共四十八頁。肺炎鏈球菌第三十頁，共四十八頁。第三十一頁，共四十八頁。第三十二頁，共四十八頁。3.膽汁溶菌試驗(yàn)

自溶酶是一種L-丙氨酸--N-乙酰胞壁酰胺酶，能切斷肽聚糖上L-丙氨酸與N-乙酰胞壁酸間的連接鍵，從而破壞細(xì)胞壁，使菌溶解。自溶酶在菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期被激活，也可被膽汁或膽鹽等活性物質(zhì)激活，從而促進(jìn)培養(yǎng)物中的菌體溶解。肺炎鏈球菌膽汁溶菌試驗(yàn)為陽性，甲型溶血性鏈球菌的膽汁溶菌試驗(yàn)為陰性。第三十三頁，共四十八頁。

（1）試管法:

取新鮮培養(yǎng)物分裝于兩支試管內(nèi)（每支1ml），其中一支加入10%的去氧膽酸鈉溶液0.1ml或純牛膽汁0.2ml，另一支加入無菌鹽水兩滴（對(duì)照），15min后，陽性者細(xì)菌被溶解，試管內(nèi)液體呈透明狀，陰性者無變化。第三十四頁，共四十八頁。第三十五頁，共四十八頁。

（2）平皿法:

加一滴10%的去氧膽酸鈉溶液或純牛膽汁于被檢菌菌苔上，15min后，陽性者細(xì)菌菌苔被溶解，陰性者無變化。試驗(yàn)應(yīng)有已知肺炎鏈球菌作陽性對(duì)照。第三十六頁，共四十八頁。第三十七頁，共四十八頁。第三十八頁，共四十八頁。膽溶陰性第三十九頁，共四十八頁。4.乳膠凝集試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、快速、特異性高。第四十頁，共四十八頁。第四十一頁，共四十八頁。第四十二頁，共四十八頁。5.莢膜腫脹試驗(yàn)

取一滴抗血清與一滴菌懸液混勻，加少量美藍(lán)液混合后加蓋片，室溫10~20min后，用油鏡檢查，如查到菌體呈蘭色，周圍繞有界限明顯未染色的膨大空白圈為陽性?？捎糜诜窝祖溓蚓姆中?。第四十三頁，共四十八頁。6.凝集試驗(yàn)

包括血清凝集試驗(yàn)、SPA（葡萄球菌蛋白A）協(xié)同凝集試驗(yàn)、反向乳膠凝集試驗(yàn)等方法。第四十四頁，共四十八頁。表1非β溶血鏈球菌的鑒別————————————————————————————————————菌種Optochin膽汁膽汁6.5%NaCl吡咯烷衛(wèi)星現(xiàn)象CAMP血清群敏感溶菌七葉苷肉湯酮酶————————————————————————————————————肺炎鏈球菌++——————牛鏈球菌——+————D無乳鏈球菌———d——+B草綠色鏈球菌————————營(yíng)養(yǎng)變異鏈球菌————++——————————————————————————————————————*d.不同菌株第四十五頁，共四十八頁。三、肺炎鏈球菌的藥敏試驗(yàn)

K-B法：采用Mueller-Hinton瓊脂＋5％羊血培養(yǎng)基。直接菌落懸液法(0.5麥?zhǔn)蠁挝痪?，?5分鐘內(nèi)接種完)作為接種液。稀釋法：包括瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法和Etest法。培養(yǎng)條件：為35℃、5％CO2培養(yǎng)20～24小時(shí)。質(zhì)控菌株ATCC49619。第四十六頁，共四十八頁。4.肺炎鏈球菌感染的治療青霉素G敏感均可直接用青霉素G進(jìn)行治療;青霉素G中度耐藥株可用大劑量青霉素G進(jìn)行治療；如重度耐藥可選用三代頭孢菌素加萬古霉素或利福平進(jìn)行治療