細(xì)胞生物學(xué)-細(xì)胞周期的調(diào)控 (2)課件

第二節(jié)細(xì)胞周期的調(diào)控

MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)的調(diào)控

卵細(xì)胞促成熟因子,matuation-promotingfactor細(xì)胞促分裂因子,mitosis-promotingfactorM期促進(jìn)因子,M-phase-promotingfactor一、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用Johnson和Rao(1970)將Hela細(xì)胞同步于不同階段，然后與M期細(xì)胞混合，在滅活仙臺(tái)病毒介導(dǎo)下，誘導(dǎo)細(xì)胞融合。結(jié)果----------使間期細(xì)胞出現(xiàn)類似于有絲分裂期的形態(tài)變化：染色質(zhì)凝集，核被膜破裂及核仁消失，將這種現(xiàn)象叫做染色體超前凝集(prematurechromosomecondensation)。卵細(xì)胞提取物注射實(shí)驗(yàn)Masui和Markert在體外用孕酮誘導(dǎo)非洲爪蟾的卵母細(xì)胞成熟Meaning?

：孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟；成熟卵細(xì)胞質(zhì)中，含有卵母細(xì)胞成熟的因子，即促成熟因子MPF（maturationpromotingfactor）

。用成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)注射到卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。1988年Maller實(shí)驗(yàn)室的J.Lohka純化了爪蟾的MPF，經(jīng)鑒定由32KD和45KD兩種蛋白組成，二者結(jié)合可使多種蛋白質(zhì)磷酸化。MPF的純化細(xì)胞周期基因的發(fā)現(xiàn)LelandHartwell七十年代初，美國(guó)西雅圖的華盛頓大學(xué)LelandHartwell，

以芽殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，利用阻斷在不同細(xì)胞周期階段的溫度敏感突變株，分離出了幾十個(gè)與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(celldivisioncyclegene，cdc)。他發(fā)現(xiàn)的一群基因，成為八十年代和九十年代人們研究細(xì)胞周期的主要對(duì)象。如芽殖酵母的cdc28基因，在G2/M轉(zhuǎn)換點(diǎn)發(fā)揮重要的功能。PaulNurse和美國(guó)科羅拉多大學(xué)的Maller合作證明（1990）證明P32實(shí)際上是CDC2的同源物。TimHunt和Maller合作證明P45是cyclinB的同源物，從而將細(xì)胞周期三個(gè)領(lǐng)域的研究聯(lián)系在一起。PaulNurse(human-yeastgenes);TimHunt(cyclin)LelandH.Hartwell

R.Timothy(Tim)Hunt

2001年諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了美國(guó)科學(xué)家LelandHartwell和英國(guó)科學(xué)家蒂TimHunt、PaulNurse

，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制。三、周期蛋白自發(fā)現(xiàn)周期蛋白后，在不長(zhǎng)的時(shí)間里有數(shù)十種周期蛋白被克隆和分離。如酵母的Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6，在脊椎動(dòng)物的A1-2、B1-3

、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。周期蛋白框，介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合.M期G1期不同周期蛋白的表達(dá)時(shí)期不同，與不同的CDK結(jié)合，調(diào)節(jié)不同CDK激酶的活性。

部分哺乳動(dòng)物和酵母細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞周期中的積累及其與CDK激酶活性的關(guān)系。已知30余種，在脊椎動(dòng)物中為A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分為4類：G1型、G1/S型、S型、M型。不同類型的CDK/cyclin復(fù)合體四、CDK激酶和CDK激酶抑制物在酵母cdc2和cdc28基因被分離后，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)工作構(gòu)建了人類、爪蟾和果蠅的cDNA文庫(kù)，得到了一系列與cdc2相關(guān)的基因。他們有兩個(gè)共同的特點(diǎn)，一是含有一段類似的氨基酸序列，二是都必須和細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故名細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)。已經(jīng)命名的CDK激酶包括：CDK1-8。cdc2最早被發(fā)現(xiàn)，被命名為CDK1。各種CDK分子都含有一段類似的CDK激酶結(jié)構(gòu)域，其中一段PSTAIRE的序列相當(dāng)保守，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。另外，一些位點(diǎn)的磷酸化與激酶的活性有關(guān)。

時(shí)相蛋白激酶周期蛋白G2→MCdk1周期蛋白A，BG1→SCdk2周期蛋白ESCdk2周期蛋白A?Cdk3?G1

Cdk4周期蛋白D1，D2，D3G1

Cdk5周期蛋白D1，D2，D3G1

Cdk6周期蛋白D1，D2，D3哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期蛋白與周期蛋白依賴性蛋白激酶這類蛋白激酶常以磷酸化的形式直接作用于細(xì)胞周期，包括DNA合成的啟動(dòng)和終止，核膜、核仁的崩解和重新形成，核纖層的降解和重新聚合，紡綞體的形成和消失等。它們可根據(jù)作用的時(shí)期不同分為G1、G1/S、S期CDK，及M期CDK。Cdkactivitycanbesuppressedbothbyinhibitoryphosphorylationandbyinhibitoryproteins(CKIs).P27—Cdkinhibitorproteins(CKIs)蛋白激酶的活性可以受到某些激酶的磷酸化作用所抑制，脫磷酸而有活性。Cdkassociatessuccessivelywithdifferentcyclinstotriggerthedifferenteventsofthecycle.Cdkactivityisusuallyterminatedbycyclindegradation.酵母細(xì)胞周期的調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期的調(diào)控哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期受一個(gè)小型Cdks家族的調(diào)節(jié)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期中起作用的Cdks,Cdk1、Cdk2、Cdk3…等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也能表達(dá)多種周期蛋白:周期蛋白A、B、D和E。（一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用CDK1激酶（p34cdc2激酶），由p34cdc2蛋白（或p34cdc28蛋白）與周期蛋白B組成。CyclinB的合成在G2/M時(shí)達(dá)到高峰，隨著M期的結(jié)束而發(fā)生降解，細(xì)胞從G2期向M期的轉(zhuǎn)變受此蛋白的調(diào)節(jié)。周期蛋白在CDK1激酶活性調(diào)節(jié)中的作用細(xì)胞中CDK激酶的活性受到多種因素的調(diào)控CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化絲氨酸和蘇氨酸），參與細(xì)胞的多種功能。cyclinB/A與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細(xì)胞周期事件（二）M期周期蛋白與分裂中期向分裂后期轉(zhuǎn)化細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)到中期后，M期周期蛋白A和B降解，CDK1激酶活性喪失，蛋白去磷酸化，由中期向后期轉(zhuǎn)化。M期周期蛋白N端有破壞框。在中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，通過(guò)一種未知的途徑，激活泛素酶復(fù)合物，將泛素連接在M期周期蛋白上，導(dǎo)致其被蛋白酶體降解.1.泛素的羧基端通過(guò)與泛素激活酶(E1)的半胱氨酸殘基形成硫酯鍵而激活。2.泛素從E1轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶(E2)的半胱氨酸殘基。3.E2和泛素連接酶(E3)一起將泛素轉(zhuǎn)移到底物蛋白的賴氨酸殘基,在那里進(jìn)行泛素的聚合化,最后作為蛋白酶體的降解底物,被快速降解。泛素加到周期蛋白上需要三種不同的酶介導(dǎo):泛素連接酶(E3)又稱為后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase-promotingcomplex,APC)至少有8種成分組成，分別稱為APC1至APC8。APC可以促使M期周期蛋白泛素化途徑降解，此外也調(diào)節(jié)其他一些與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的非周期蛋白類蛋白質(zhì)的降解。

后期促進(jìn)因子APC活性的受到多種調(diào)節(jié)。首先，APC活性受MPF的調(diào)節(jié)。其次，APC受到Cdc20的正調(diào)控；Cdc20位于染色體的動(dòng)粒上.

在未被被動(dòng)粒微管捕捉的動(dòng)粒上Mad2蛋白與Cdc20結(jié)合抑制其活性若動(dòng)粒被動(dòng)粒微管捕捉,則Mad2從動(dòng)粒上消失,對(duì)Cdc20的抑制解除,促使APC活化，紡錘體裝配不完全，或所有動(dòng)粒不能被動(dòng)粒微管全部捕捉，APC則不能被激活。紡錘體裝配檢驗(yàn)點(diǎn)（三）G1/S期轉(zhuǎn)化與G1期周期蛋白依賴性CDK激酶細(xì)胞由G1向S期轉(zhuǎn)化受G1期周期蛋白依賴性激酶所控制：

G1期激酶：CDK4、CDK6

G1期周期蛋白：cyclinD,E。cyclinD的合成對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子有強(qiáng)烈的依賴性RbbindwithE2FtranscriptionfactorRb是G1/S期轉(zhuǎn)化的負(fù)性調(diào)控因子,在G1晚期通過(guò)磷酸化而失活

Rb蛋白磷酸化→與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子（E2F）釋放→S期所需的基因轉(zhuǎn)錄的阻斷被解除→細(xì)胞進(jìn)入S期；Rb蛋白為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，Rb）基因編碼周期蛋白E與CDK2結(jié)合，使之激活,使與RB類似的蛋白質(zhì)底物p107磷酸化而解除其對(duì)E2F的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S限制點(diǎn)而進(jìn)入S期。周期蛋白E在G1晚期表達(dá),進(jìn)入S期后降解.除G1期周期蛋白依賴性CDK激酶外,細(xì)胞內(nèi)還存在其它的多種因子對(duì)DNA復(fù)制起始活動(dòng)的調(diào)節(jié).復(fù)制起始點(diǎn)識(shí)別復(fù)合體（Originrecognitioncomplex,ORC），識(shí)別并結(jié)合DNA復(fù)制起始點(diǎn)是DNA復(fù)制所必須的.一