戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)

液相色譜基礎(chǔ)知識戴安中國HPLC銷售培訓(xùn)2005年戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!關(guān)于色譜色譜是一種分離工具，而不是傳統(tǒng)意義上的分析儀器常見的分離方式：蒸餾、離心、電泳、過濾、超濾等等色譜是其中一種分離工具戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!色譜法簡介色譜法（Chromatography）溯源俄國科學(xué)加1903年發(fā)現(xiàn)色譜的吸附原理，開創(chuàng)了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法并見諸于俄文的文獻(xiàn)1906年正式命名（見諸文獻(xiàn)）色譜法；Chromatography30年代開始廣泛研究和應(yīng)用主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于70年代戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!色譜的發(fā)明人俄國科學(xué)家：M.S.Tswett正式命名“色譜”的文獻(xiàn)戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!什么是液相色譜氣相色譜：流動相是氣相液相色譜：流動相是液相戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!HPLC的儀器配置及流程溶劑色譜泵自動進(jìn)樣器

HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!色譜圖：HPLC圖形結(jié)果（Chromatogram）色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號強度，橫坐標(biāo)為保留時間?！V峰保留時間（分）基線↓峰高峰寬響應(yīng)值戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!液相色譜圖相關(guān)術(shù)語峰面積－PeakArea峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差；σ－StandardError0.607倍峰高處所對應(yīng)峰寬的一半拖尾峰－TailingPeak后沿較前沿平緩的不對稱峰前伸峰－LeadingPeak前沿較后沿平緩的不對稱峰鬼峰－GhostPeak并非由試樣所產(chǎn)生的峰；亦稱假峰戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!液相色譜圖相關(guān)術(shù)語死時間，t0－Deadtime不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間保留時間，tR－Retentiontime組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間死體積，V0－Deadvolume不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積保留體積，VR－Retentionvolume組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!色譜方法轉(zhuǎn)換如果沒有與文獻(xiàn)或要求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進(jìn)樣量轉(zhuǎn)換流速戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!液相色譜原理－基本概念及方法開發(fā)液相色譜實驗所需的基本參數(shù)流動相：種類及配比，等度或梯度固定相：色譜柱類型及內(nèi)徑、長短流動相輸送系統(tǒng)參數(shù)：流速檢測器參數(shù)：紫外檢測波長，靈敏度等溫度控制進(jìn)樣量以上參數(shù)即構(gòu)成一個具體的HPLC方法；亦稱色譜條件戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!什么是色譜的分離度分離度的公式：R：分離程度的量度戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!若N增加2倍或3倍,R會如何變化?分離度方程解析：柱效項戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!色譜柱的柱效N理論塔板數(shù)計算公式：W s

方法Wtan 16 切線法Wh 5.54 半峰高W3s 9 3sW4s 16 4sW5s 25 5s戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!塔板數(shù)與流速的關(guān)系流速（cm/min）

塔板數(shù)×103

戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!分離度方程解析：分離因子項若=1.1or1.4，R會如何變化？戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!分離因子：α定義：

a=1時兩組分分不開，改變a的途徑改變固定相或改變流動相改變溫度改變樣品的本身性質(zhì)戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!若=1,2,10or20,R會如何變化?分離度方程解析：容量因子項戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!

k值k項k對分離度影響

00011/2.5022/3.6733/4.751010/11.912020/21.95容量因子k與分離度的關(guān)系與R的關(guān)系戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!改變?nèi)萘恳蜃覭’的例子譜圖戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!液相色譜原理－更進(jìn)一步的探討離子型化合物的分離方式多數(shù)化合物是離子型的！使用離子交換柱：離子交換法主要用于“強”陰、陽離子使用反相柱離子抑制色譜法：通過改變流動相的pH值，使樣品成中性離子對色譜法：加入“對離子”，使樣品呈中性戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!離子抑制色譜實例而在乙腈/水并且pH=7時，多數(shù)組份保留時間很短，無法完全分離。戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!在高pH值下用離子抑制色譜柱：D18-613(聚合物基質(zhì))，室溫流動相：乙腈/0.01MNH4OH +0.01MTBA流速：1.0ml/min檢測：UV-240nm樣品：巴比妥的衍生物①巴比妥②己瑣巴比妥③甲基苯巴比妥④速可巴比妥戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!離子對色譜機理戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!使用六烷基磺酸鹽Packing: BondapakC18Column: 4mmIDx30cmSolvent: Methanol/Waterwith0.005M HEXANESulfonicAcid& 1%HOAc(50/50)FlowRate:2.0ml/minDetector:UV,254nm,0.1AUFS1.MaleicAcid2.Phenylephrine-HCl3.Phenylpropanolamine-HCl4.Naphazoline-HCl5.Phenacetin6.PyrilamineMaleate戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!開發(fā)液相色譜方法的考慮因素分離度是色譜分離中主要考慮的因素除分離度之外，在開發(fā)色譜方法時，以下幾個因素也都要考慮：靈敏度載樣量分析速度溶劑損耗成本容易使用色譜柱壽命效率戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!色譜泵及液相色譜對泵的要求穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速可靠且充分的溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的自動溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的梯度形成有效的流速范圍制備色譜或微柱、窄柱色譜更為關(guān)注滯后體積僅僅應(yīng)用于梯度實驗?zāi)康模涸谌魏吻闆r下保持最高精度戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!梯度：低壓混合低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合對脫氣要求高不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積如設(shè)計不當(dāng)，梯度的

準(zhǔn)確性受影響滯后體積（系統(tǒng)

體積）設(shè)計合理戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!梯度滯后大小的影響滯后體積太大會引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚2分鐘響應(yīng)，沒有問題對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚20分鐘響應(yīng)，不能接受滯后體積的不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好普通分析型液相色譜的滯后體積為2~4ml戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!色譜柱反壓變化對梯度實驗的影響P680ALPGwithoutpulsedamperBack-pressure:

60bar,85barand

105barVariation:<1%5681012-100200400600900mAUMinutesMethylparabeneEthylparabenePropylparabeneButylparabene5681012-100200400600900mAUMinutesMethylparabeneEthylparabenePropylparabeneButylparabenePumpwithpulsedamperBack-pressure:

60bar,85barand

105barVariation:>2%Acclaim120,C18,5μm,4.6x100mm;0.5mL/min;25°C;5μLinjectionvolume;UVdetectionat256nm;Eluent(A)Waterand(B)Acetonitril;Gradient:30%bto100%Bin10min;Methyl-,Ethyl-,Propyl-andButylparabene,10mg/Leach戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!HPLC檢測器應(yīng)提供的功能對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系但是：由于受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會產(chǎn)生響應(yīng)與濃度之間關(guān)系的與線性偏離現(xiàn)象并不是所有的檢測器是線性的受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!不同種類的檢測器的分類整體性質(zhì)示差折光檢測器蒸發(fā)光散射檢測器電導(dǎo)檢測器溶質(zhì)性質(zhì)熒光檢測器固定波長可變波長光電二極管矩陣電化學(xué)檢測器放射化學(xué)檢測器氮/硫檢測器質(zhì)譜檢測器紫外/可見光檢測器戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!靈敏度：信噪比靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認(rèn)更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性 6:1NS戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!選擇液相色譜的檢測器要考慮的因素：你要分離的化合物/樣品的化學(xué)特性化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量及紫外光譜等等流動相的影響（溶劑、緩沖鹽改性劑等）梯度還是等度靈敏度需求是否有雙檢測的需求戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!可供選擇的液相色譜檢測器Absorbance(UV/Vis)ChemiluminescenceCircularDichroism(Chiral)ConductivityElectrochemicalEvaporativeLightScatteringFluorescenceLaserInducedFlorescenceLaserInterferometerLaserPolarimeterMassSpectrometric(LC/MS)NitrogenSpecificDetectorNuclearMagneticResonanceOfflineMethodsOpticalRotationDetectorPhotoDiodeArrayRefractiveIndexRadiochemicalSulfurSpecificDetectorVisetryMultiAngleLightScattering戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!示差檢測器－基本原理檢測基于被分析物的折光指數(shù)的差異測量樣品流路與參比流路在折光指數(shù)上的差別當(dāng)折光指數(shù)差異最大時靈敏度也達(dá)到最大并不測量絕對的折光指數(shù)而是測定折光指數(shù)的差別（DifferentialRI）典型的應(yīng)用領(lǐng)域沒有紫外吸收、熒光的化合物，例如：碳水化合物（Carbohydrates）、聚合物（Polymers）脂肪酸（FattyAcids）及油脂類（Lipids）戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!示差檢測器的優(yōu)點－通用性根據(jù)隨機統(tǒng)計；任何一對液體都會有大約0.07的折光率差異因此；除非正好被分析的樣品與溶液的折光指數(shù)完全相同，都會被檢測到SeparationofLactose-ReduceMilkMV-20-100102030405060708090100110Minutes4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.010.511.011.512.012.5葡萄糖乳糖半乳糖戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!示差檢測器的缺點－不適宜作梯度流動相： A=CH3CN/H2O75:25 B=CH3CN流速： 1.4mL/min色譜柱： NH2色譜柱溫： 30oC檢測溫度： 35oCMV-2600-2400-2200-2000-1800-1600-1400-1200-1000-800-600-400-2000200400Minutes0246810121416182022242628300%B25%BChromatographyForum:IsRIwithaReversePhasegradientpossible?

ByXXXXXXXXX:Ihaveagoodseparationofamulti-substituted,cyclohexanethatfullyresolves~12differentoligomers.IcandetecttheponentsbyMS,butIwouldliketouseastandardLCdetectorinstead.Thereisvirtuallynoadsorptionabove230nmandbelow230nmpicksupsolventinterference.I’mconsideringusingRIdetectionandafterwardsubtractingablankrun.IsthereanyhopeofthisworkingorwouldIbewastingmytime?.chromforum./戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!吸光度（AbsorbanceUV/Vis）檢測目前實驗室中最流行的選擇多數(shù)公司約75%的檢測器是吸光度檢測器（其中50%是多波長，25%是PDA）測量通過溶液后的紫外或可見光光強度的損失吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測物的最大吸收波長處檢測時靈敏度最大戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!吸光度檢測器（UV/Vis）－缺點由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測器對某些化合物的檢測靈敏度不及其他檢測器樣品中不同化合物的最大吸收波長不同時，需要使用多波長檢測，或使用折衷的波長受流動相組成的影響：用截止波長以上至少5～10nm作為工作波長緩沖鹽、離子對試劑、胺改性劑也會有影響戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!背景吸收對紫外檢測器噪音的影響UVSpectrumofEluentswith0.1%TFAAgainstHPLCGradeH2OBlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20with0.1%TFA50%ACNwith0.1%TFA戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!為何如此重要？五個小肽的5ng進(jìn)樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別出所有峰。在不好的色譜系統(tǒng)中，個峰則消失在基線噪音中。戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!熒光（Fluorescence）檢測發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子達(dá)到激發(fā)態(tài)，其返回到基態(tài)時發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光基態(tài)激發(fā)態(tài)S1S0激發(fā)（1）振動能（2）發(fā)射（3）1.分子在吸收UV或可見光后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，分子達(dá)到不穩(wěn)定的高能量狀態(tài)。2.電子失去過剩的能量成為振動能，并達(dá)到最低的激發(fā)單重態(tài)。3.電子失去能量達(dá)到基態(tài)時發(fā)出熒光共軛及芳香族化合物最容易有熒光現(xiàn)象戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!熒光檢測器的應(yīng)用環(huán)境中的污染物多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、飲料食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素染料維生素及衍生氨基酸生物技術(shù)及制藥氨基甲酸酯類殺蟲劑黃曲霉毒素多環(huán)芳烴（PAH）維生素戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!熒光檢測器的缺點不是所有化合物都有熒光，需要衍生檢測器對溶解氣體及其他淬滅物質(zhì)（如甲醇）敏感對Ex及Em的最佳，易受溫度、溶劑的極性和粘度、溶劑的pH值及樣品濃度影響多數(shù)儀器的批次間差異較大，同一型號的不同熒光檢測器會得到不同的結(jié)果。有的儀器信號及噪音大于另一臺2～3倍，光電倍增管的特征是導(dǎo)致這個現(xiàn)象的原因。戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!濃度對芘（Pyrene）最大激發(fā)波長的影響EmissionExcitation~10–3M~10–5M在正己烷中From:Turro,N.J.,ModernMolecularPhotochemistryMenloParkCA,Benjamin/CummingsPublishing,1978戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!蒸發(fā)光散射檢測器原理EvaporativeLightScattering簡稱：ELSD戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁!ELSD－缺點不能使用不揮發(fā)性的流動相（例如：磷酸鹽）要求使用霧化氣源（典型的是氮氣）不同的色譜條件下霧化及除溶劑的參數(shù)需要重新優(yōu)化破壞性技術(shù)蒸發(fā)出的溶劑要因到戶外或通風(fēng)櫥里對揮發(fā)性化合物的檢測不理想一般得到的是非線性校正曲線某些化合物的檢測靈敏度不如其他檢測器戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁!PDA檢測器－特點三維水平的吸光度檢測器二極管矩陣檢測器是在1982年首度出現(xiàn)的在整個UV-Vis帶寬上檢測吸光度都需要相應(yīng)的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁!光學(xué)分辨率（帶寬）好的光譜分辨率可得到高質(zhì)量的光譜信息230.00250.00270.00nmBenzene3.0nmvs

1.0nm

損失分辨率，UV最大波長移動

1.0nm3.0nm190nm5.0nm戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁!PDA的優(yōu)點及缺點優(yōu)點通用的UV/Vis檢測好的選擇性、線性提供色譜峰的UV/Vis光譜圖（峰確認(rèn)）可提供純度估計缺點低光學(xué)通量（較窄的帶寬通量）與普通UV/Vis相比更復(fù)雜，容易漂移燈輸出能量隨時間降低戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁!除去溶劑離子化前的準(zhǔn)備：霧化（Nebulization）蒸發(fā)溶劑或解吸附（Evaporation/orDesorption）大氣壓下或減壓下（AtmosphereorPressurereduction）離子化（Ionization－IonSource）LiquidGasLCMSCo(l)C+/-(l)C+/-(g)Co(g)EvaporationDesorptionLC/MSInterface戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁!LC-MS技術(shù)的應(yīng)用戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁!色譜的數(shù)據(jù)類型采集類型：單離子模式（SIR）掃描模式（Scan）總離子流（TIC或BPC）ESI+ve180-400m/zTICESI-ve180-400m/zTIC極性切換：正離子負(fù)離子戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁!液相色譜的分離依然重要標(biāo)稱分子量在250的化合物的數(shù)量超過了1500！Adaptedfrom:R.Willoughbyetal‘AGlobalViewofLC/MS’,1998戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第55頁!其他重要的檢測器電化學(xué)檢測器Electrochemical電導(dǎo)檢測器ConductivityWRC有機及無機離子兒茶酚胺Catecholamines亞硝胺Nitrosamines有機酸Organicacids碳水化合物Carbohydrates氨基酸AminoAcids戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第56頁!液相色譜對數(shù)據(jù)處理最基本的要求數(shù)據(jù)的采集數(shù)據(jù)的處理數(shù)據(jù)的報告液相色譜的數(shù)據(jù)處理及其要求色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第57頁!能使用先進(jìn)的檢測方式及特殊應(yīng)用光電二極管矩陣（PDA）、質(zhì)譜（MS）檢測不同領(lǐng)域的應(yīng)用及其特殊計算從基本要求的基礎(chǔ)上擴展色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第58頁!網(wǎng)絡(luò)及系統(tǒng)管理能力配置規(guī)?？蓴U展災(zāi)難防御與恢復(fù)系統(tǒng)安全性開放結(jié)構(gòu)存檔功能從基本需求的基礎(chǔ)上擴展色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第59頁!色譜分離的機理分離是一個物理的過程流動相（MobilePhase）固定相（StationaryPhase）樣品（溶解于流動相中的溶質(zhì)）戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第60頁!什么是高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡稱：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器……廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學(xué)/食品及農(nóng)業(yè)……在技術(shù)，理論及應(yīng)用上仍處于發(fā)展階段戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第61頁!HPLC的儀器配置及流程色譜泵自動進(jìn)樣器色譜柱及柱溫箱檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)溶劑戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第62頁!液相色譜圖相關(guān)術(shù)語色譜峰－Peak色譜柱流出組分通過檢測器時產(chǎn)生的響應(yīng)信號的微分曲線峰底－PeakBase峰的起點與終點之間連接的直線峰高－PeakHeight峰最大值到峰底的距離峰寬－PeakWidth在峰兩側(cè)拐點處所作切線與峰底相交兩點之間的距離半（高）峰寬－PeakWidthatHalfHeight通過峰高的中點作平行于峰底的直線，其與峰兩側(cè)相交兩點之間的距離戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第63頁!液相色譜圖相關(guān)術(shù)語基線－Baseline在正常操作條件下，僅由流動相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號的曲線基線飄移－BaselineDrift基線隨時間定向的緩慢變化基線噪聲；N－BaselineNoise由各種因素所引起的基線波動譜帶擴展－BandBroadening由于縱向擴散,傳質(zhì)阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內(nèi)移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第64頁!液相色譜應(yīng)用：制備型液相色譜分離及純化樣品是液相色譜原理的直接利用對分離及純化的要求化合物的穩(wěn)定性樣品的復(fù)雜性制備量的要求純度的要求，及純度的鑒定方法的安全性戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第65頁!液相色譜應(yīng)用：分析型液相色譜定量分析主要基于與標(biāo)準(zhǔn)品的比較是其最大應(yīng)用領(lǐng)域定性分析；不是色譜的強項基于樣品的保留時間比較借助于和其聯(lián)用的紫外、質(zhì)譜或其他檢測器對定量及定性分析的要求靈敏度、精度及準(zhǔn)確度的要求樣品量的要求；復(fù)雜樣品的分析能力容易使用戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第66頁!評價液相色譜方法的標(biāo)準(zhǔn)問題：什么樣的分離結(jié)果是好的？分離度？戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第67頁!影響分離度的因素：K’、α及N分離度方程：

K‘是容量因子，表達(dá)了被分離組分與柱填料之間作用的強弱

α是分離因子，描述兩個被分離組份分離的好壞程度，是化學(xué)因素N是理論塔板數(shù)，描述色譜峰譜帶展寬的程度戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第68頁!N＝理論塔板數(shù)：分離效率的量度PW=.5PW=2戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第69頁!峰寬與塔板數(shù)的關(guān)系理論塔板數(shù)峰寬（L）k＝2，Vo＝1000L戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第70頁!分離度與N的關(guān)系戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第71頁!＝分離因子：峰分離程度的量度V1V2V3V0時間0.5125戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第72頁!通過改變流動相改變α，同樣強度的不同溶劑改變色譜柱改變分離因子α的例子戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第73頁!K＝容量因子：保留能力的量度V0V1V2V3時間0.5125戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第74頁!容量因子k

與峰高的關(guān)系改變k’值的方法：調(diào)節(jié)流動相的極性、pH、離子強度等梯度淋洗戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第75頁!α、k’及

N如何控制分離度戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第76頁!離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動相的pH值，抑制樣品離子的電離主要適用于弱酸性化合物的分離降低流動相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8（較保險值3-7）內(nèi)戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第77頁!離子抑制色譜的使用范圍下列情況下不能使用離子抑制方法，如果：一些酸在pH低于2時還保持離子化一些堿在pH高于7時還保持離子化可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物或其他耐堿性流動相的反相柱，在pH高于7時用離子抑制法使用“離子對色譜法” 戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第78頁!離子對色譜法在反相色譜流動相內(nèi)加入“離子對”試劑與樣品中可電離的組份形成“對離子”在反相色譜柱上分離離子型化合物離子對試劑的類型：磷酸季丁銨（PICA），適用于弱酸烷基磺酸鹽（PICB），適用于弱堿烷基長度不同，形成對離子的能力不同通常有：B5，B6，B7，B8–后面的數(shù)字是碳鏈的長度磷酸二丁胺（PICD4），適用于弱堿戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第79頁!使用五烷基磺酸鹽Packing: BondapakC18Column: 4mmIDx30cmSolvent: Methanol/H2Owith0.005MPENTANE SulfonicAcid&1%HOAc(50/50)FlowRate:2.0ml/minDetector:UV,254nm,0.1AUFS1.MaleicAcid2.Phenylephrine-HCl3.Phenylpropanolamine-HCl4.Naphazoline-HCl5.Phenacetin6.PyrilamineMaleate戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第80頁!用離子對、還是用離子抑制方法？戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第81頁!基本的HPLC系統(tǒng)溶劑

色譜泵自動進(jìn)樣器HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第82頁!梯度：高壓混合高壓梯度使用多臺色譜泵，在泵后混合配置靈活、簡單，脫氣簡單易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第83頁!梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時)滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測器進(jìn)樣器色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意∶滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼器、混合器及其管路比例閥檢測器進(jìn)樣器ABCD色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度阻尼器混合器戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第84頁!滯后體積變化的影響設(shè)計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第85頁!液相色譜的檢測器常規(guī)檢測器示差折光檢測器（RefractiveIndex）紫外/可見光吸收檢測器（UV-Vis）熒光檢測器（Fluorescence）蒸發(fā)光散射檢測器（EvaporativeLightScattering）其他檢測器（OtherDetectors）高端檢測器光電二極管矩陣檢測器（PhotodiodeArray）質(zhì)譜檢測器（MassSpectrometry）戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第86頁!用于HPLC的檢測器沒有任何一種單獨的檢測器可以適應(yīng)所有的液相色譜分離！HPLC檢測器可以分為：溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（Solutepropertydetectors）對溶質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，一般不反應(yīng)流動相的變化（選擇型）整體性質(zhì)檢測器（Bulkpropertydetectors）不管是否有溶質(zhì)，對流動相任何物理性質(zhì)的變化作出響應(yīng)（通用型）戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第87頁!理想的HPLC檢測器高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng)對壓力、溫度及流速等變化不敏感長時間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第88頁!方法開發(fā)的過程Adaptedfrom:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;PracticalHPLCMethodDevelopment2ndEd.,Wiley-Interscience,NewYork,1997,p.21.得到樣品信息，確定分離目標(biāo)2.確定特定HPLC過程、樣品預(yù)處理等的需求3.選擇檢測器及其條件4.選擇HPLC方法；初步分離；建立最佳分離條件5.優(yōu)化分離條件6.檢查特定過程的問題及需要7.定量校正8.日常使用的確認(rèn)戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第89頁!選擇液相色譜的檢測器通用檢測器 RIELSD MS靈敏度 mg ng pg 線性范圍 104 否 103流速敏感 是 否 是溫度敏感 是 否 否破壞性 否 是 是選擇性檢測器 ABS FL ECCond MS靈敏度 ng pg fg pg pg線性范圍 105 103 106 105 103流速敏感 否 否 是 是 是溫度敏感 否 否 是 是 是破壞性 否 否 是 否 是戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第90頁!示差折光（RefractiveIndex）檢測示差折光檢測器（RI）是個商品化的液相色譜檢測器（上世紀(jì)六十年代末、七十年代初）通常被認(rèn)為是一種通用檢測器檢測溶液中所有被溶解的溶質(zhì)－非特異性任何光學(xué)介質(zhì)的折光率都被定義為光在該介質(zhì)中與真空中的速度之比值RS戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第91頁!示差檢測器的優(yōu)、缺點優(yōu)點通用檢測器容易使用；通常來說是比較耐用的檢測器維護(hù)成本低缺點靈敏度低、選擇性差對流速、溫度及粘度的變化敏感不能用于梯度方法色譜峰可能是正的，也可能是負(fù)的戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第92頁!示差檢測器的缺點－靈敏度缺乏靈敏度－和其他檢測器相比，RI檢測器一般靈敏度較低UV@254nmS/N>15000:1MV-30.00-25.00-20.00-15.00-10.00-5.000.005.0010.0015.00Minutes2.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.5AU0.000.020.040.060.080.100.120.14RefractiveIndexS/N~125:1流動相： MeOH/H2O60:40流速： 1.0mL/min色譜柱： C18色譜柱溫：30oC檢測溫度：35oC樣品： ParabenMixture戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第93頁!示差檢測器的缺點－對溫度敏感流動相－甲醇@0.25mL/minute檢測器溫度－35?C；沒有使用柱溫箱Temp.(DegC)18.519.019.520.0MV-1.000.001.002.00Minutes51015202530354045505560657075室溫變化RI基線戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第94頁!吸光度檢測器（UV/Vis）－優(yōu)點這種檢測器簡單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實驗并且是非破壞性的大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度一般來說靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabensat254nm戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第95頁!背景吸收的影響背景吸收降低了線性范圍多數(shù)流動相有紫外吸收實際濃度理想10吸光度210背景吸收戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第96頁!溶劑混合的基線噪音色譜條件色譜柱： C18,

5μm,3.9x150mmat35oC.流動相： A:0.1%TFAinWater. B:0.1%TFAinAcetonitrile.梯度：5-40%Bin35min.流速：1.0mL/min.樣品：水（10μLinj.vol.）檢測：214nm圖1；好的梯度系統(tǒng)

圖2；一般的二元梯度系統(tǒng)圖3；一般的四元梯度系統(tǒng)戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第97頁!基線噪音對積分的影響1.2241.1831.183Caffeine@271nm戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第98頁!熒光檢測器原理戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第99頁!熒光檢測器的優(yōu)點選擇性提高靈敏度提高（在pg/fg范圍）低背景技術(shù)mV-0.100.000.100.200.300.400.50Minutes5.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.006.8949.639MDA及MDMA柱上200pgExcitation=280Emission=360戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第100頁!溶劑中溶解的氣體對響應(yīng)值的影響MinutesColumn-PAHColumn@27oCEluentA:WaterEluentB:AcetonitrileGradient:60%Bto100%Busingcurve9in12minutesHold11minutesBacktoinitialconditionsFlowRate1.2ml/minInjection:20ulTimeprogrammedwavelengthchanges20.521.022.01000MV充分脫氣未充分脫氣FluorescenceDetector1231.Benzo(b)flouranthene-400ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200ppb3.Benzo(a)pyrene-200ppb戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第101頁!蒸發(fā)光散射（EvaporativeLightScattering）用氮氣把流動相吹成細(xì)霧狀流動相的液滴通過一個預(yù)加熱的腔體后被蒸發(fā)掉蒸發(fā)的溶劑被從檢測器中除去溶質(zhì)的揮發(fā)性小于流動相，因此產(chǎn)生顆粒束與光束相交被顆粒散射的光由光電倍增管（PMT）收集PMT的輸出與溶質(zhì)的存在量呈比

例關(guān)系戴安公司3-戴安HPLC液相色譜基礎(chǔ)共115頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第102頁!ELSD－優(yōu)點及應(yīng)