基因重組與基因工程技術課件

基因重組與基因工程技術課件基因重組與基因工程技術課件

基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNA重組技術的方法，把DNA作為組件，在細胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細胞，使外源基因DNA在宿主細胞中，隨細胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表達，最終獲得基因表達產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀?；蛑亟M技術作為分子生物學最重要、最基本的技術之一，是許多分子生物,生物化學和細胞生物學實驗實施的基礎?；蚬こ桃喾Q遺傳工程，即利

現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人P·伯格（美國,1926－）在1960年以敏銳的科學預見力提出一個大膽的設想：是否可以創(chuàng)造出一種人工方法，把外界的遺傳基因引入動物體內(nèi)，以達到改變遺傳性狀和治療某些疾病的需要呢？1972年，伯格把兩種病毒的DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，首次實現(xiàn)兩種不同生物的DNA體外連接，獲得了第一批重組DNA分子，這標志著基因工程技術的誕生。伯格因此獲得了1980年諾貝爾化學獎。

現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人P·伯格（美國,1926

1973年，美國斯坦福大學教授S·科恩和加州大學舊金山分校教授H·W·博耶將兩個不同的質(zhì)粒（一個是抗四環(huán)素質(zhì)粒，另一個是抗鏈霉素質(zhì)粒）拼接在一起，組成嵌合質(zhì)粒，并將其導入大腸桿菌，當該重組質(zhì)粒進入大腸桿菌體內(nèi)后，這些大腸桿菌能抵抗兩種藥物，而且這種大腸桿菌的后代都具有雙重抗藥性。這表明“雜合質(zhì)粒”在大腸桿菌的細胞分裂時也能自我復制。1973年，美國斯坦福大學教授S·科恩和加州大學舊金科恩隨后以DNA重組技術發(fā)明人的身份向美國專利局申報了世界上第一個基因工程的技術專利。這標志著自然界不同物種間在億萬年中形成的天然屏障被打破了，人類可以根據(jù)自己的意愿定向地改造生物的遺傳特性，甚至創(chuàng)造新的生命類型。

1977年，吉爾伯特（W·Gilbert）分別將編碼胰島素和干擾素的DNA經(jīng)過體外重新拼接后，導入大腸桿菌中，分別使大腸桿菌合成了胰島素和干擾素?？贫麟S后以DNA重組技術發(fā)明人的身份向美國專利局申報DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克?。┍恚ㄟ_目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術路線目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術路線(分)------目的基因及載體的分離需要克隆的DNA片段：化學合成法

cDNA文庫基因組DNA文庫聚合酶鏈式反應目的基因的獲取(分)------目的基因及載體的分離需要克隆的DNA片段：從基因所在生物直接取得--用限制酶剪切供體DNA--用機械的方法eg超聲波從基因所在生物直接取得化學合成法人工合成：根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進行人工合成。適應于編碼小分子多肽的基因。較短的核酸片段（60-80bp）多肽鏈的氨基酸順序mRNA的堿基排列順序相應的基因結(jié)構(gòu)化學合成目的基因化學合成法人工合成：多肽鏈的氨基酸順序mRNA的堿基排列順序化學合成的最大優(yōu)點是可以合成一些分離較困難的基因?；瘜W合成的不足之處在于：

--要已知基因的核苷酸順序；

--基因不能太大，這一方面是測定核苷酸（或氨基酸）順序比較困難，另一方面是因為每次僅能合成幾百ｂｐ的短片段，短片段越多，要連接成正確的基因順序就越困難，得率越低；

--價格昂貴。用途：PCR引物,測序引物,定點突變,核酸雜交探針化學合成的最大優(yōu)點是可以合成一些分離較困難的基因。從基因文庫中篩選將某一種基因DNA用適當?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為G文庫(genomicDNAlibrary)。將某種細胞的全部mRNA通過逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到含全部表達基因的種群，稱為C-文庫(cDNAlibrary)。C-文庫具有組織細胞特異性。從基因文庫中篩選將某一種基因DNA用適當?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA構(gòu)建基因文庫獲取目的基因存在的問題——

費時費事 內(nèi)含子序列反轉(zhuǎn)錄人工合成互補DNA方法的優(yōu)勢——獲取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA構(gòu)建基因文庫獲取目的基因存在的問聚合酶鏈式反應

（polymerasechainreaction,PCR）如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應技術，在體外合成目的基因。但此法可能會造成克隆的目的基因堿基序列的改變。聚合酶鏈式反應

（polymerasechainreac載體DNA的選擇理想載體的基本條件：可轉(zhuǎn)移性,為目的基因提供進入受體細胞的轉(zhuǎn)移能力。合適的復制位點,為目的基因提供在受體細胞中的復制能力或整合能力。多克隆位點：廣泛、特異選擇標志，便于篩選和鑒定分子較小，可容納較大的外源DNA載體DNA的選擇理想載體的基本條件：質(zhì)粒噬菌體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體……種類：質(zhì)粒種類：質(zhì)粒載體的一般結(jié)構(gòu)存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。具有自我復制功能。帶有抗性基因及表型識別等遺傳性標記物。經(jīng)改造后具有多克隆位點。質(zhì)粒載體的一般結(jié)構(gòu)存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。基因重組與基因工程技術課件DNA重組的基本模式

分（離目的基因）

切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克?。┍恚ㄟ_目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向切------限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切酶切切------限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切酶切載體和目的基因的切斷通常采用限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)，簡稱限制酶，分別對載體DNA和目的基因進行切斷，以便于重組。限制酶目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400多種，所識別的順序往往為4-8個堿基對，且有回文結(jié)構(gòu)。由限制酶切斷后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三種情況。形成粘性末端(cohesiveend)者較有利于載體DNA和目的基因的重組。載體和目的基因的切斷通常采用限制性核酸內(nèi)切酶(restric酶切--雙酶切：體系：選擇合適的緩沖體系，尤其是雙酶切反應中。DNA：經(jīng)過純化的，盡量不含有蛋白質(zhì)，酒精等雜質(zhì)。時間：一般為5-7h，載體overnight以保證酶切完全。不能時間過長，以防止內(nèi)切酶的star活性，降低特異性。酶切之后立即回收，小片段用PCR-purificationKit除去，大的片段要用切膠回收去除。酶切T-vectorT-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的TPCR過程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個AT-vectorT-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）

接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克隆）表（達目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向接------載體和目的基因的連接（一）粘性末端連接法：當載體DNA和目的基因均用同一種限制酶進行切斷時，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過粘性末端進行互補粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。較少的情況下，對產(chǎn)生的平端也可直接進行連接。即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的DNA分子。接------載體和目的基因的連接（一）粘性末端連接法：即將載體DNA與目的基因的連接載體DNA與目的基因的連接（二）人工接尾法：即同聚物加尾連接法。當載體和目的基因無法采用同一種限制酶進行切斷，無法得到相同得粘性末端時，可采用此方法。此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3'-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過堿基互補進行粘合，再由DNA連接酶連接。（二）人工接尾法：末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它所催化的反應與DNApolI相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段為引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸達幾百個。末端轉(zhuǎn)移酶常用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）基因重組與基因工程技術課件（三）人工接頭連接法：將人工連接器（linker，即一段人工合成的含有多種限制酶切點的小分子DNA片段，約10~20個核苷酸）連接到平末端DNA分子(載體和目的基因)上，即有可能使用同一種限制酶對載體和目的基因進行切斷，得到可以互補的粘性末端。這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。（三）人工接頭連接法：連接體系的建立：溫度：粘末端連接：12-18℃(16-20hours)

平末端連接：室溫（低于30℃)DNA量：載體分子數(shù)/目的基因分子數(shù)=1：3-5酶量：平端連接時需加大酶量

連接反應體系越小越好，相對而言，酶切體系稍大較好連接體系的建立：連接失敗后--一步一步向上游檢測問題所在，所以分子克隆部分“留一半”的原則有時候是很有用的。酶切是否完全，所以要做載體的自連對照。載體酶切回收是否考慮到切除片段的大小，是否要用切膠回收更保險。連接失敗后--DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克?。┍恚ㄟ_目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向轉(zhuǎn)------重組體的轉(zhuǎn)化受體細胞重組體的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)------重組體的轉(zhuǎn)化受體細胞重組體的轉(zhuǎn)化宿主菌或受體細胞原核系統(tǒng)

--大腸桿菌

--枯草桿菌真核系統(tǒng)

--酵母菌酵母

--昆蟲細胞

--哺乳動物細胞宿主菌或受體細胞原核系統(tǒng)原核細胞的轉(zhuǎn)化（細菌轉(zhuǎn)化）

受體細胞的選擇：限制缺陷型:避免修飾和降解重組缺陷型：避免重組整合轉(zhuǎn)化親和型：較高的可轉(zhuǎn)化性遺傳互補型：利于篩選感染缺陷型：防止感染原核細胞的轉(zhuǎn)化（細菌轉(zhuǎn)化）受體細胞的選擇：感受態(tài)細胞（competentcell）所謂感受態(tài)，就是細菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌，需誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2等化學試劑法）的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞（Competentcells）。感受態(tài)細胞（competentcell）所謂感受態(tài)，就大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(化學方法)大腸桿菌細胞大腸桿菌感受態(tài)細胞CaCl2處理目前常用的感受態(tài)細胞制備方法是CaCl2法,CaCl2

法簡便易行,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求,制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時,可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(化學方法)大腸桿菌細胞大腸桿菌感一、受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α單菌落,接種于3-5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12小時左右,直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600＝0.5左右。二、感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘，然后于4℃下3000g離心10分鐘。棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2

溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘后，4℃下3000g離心10分鐘。棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細胞懸液。感受態(tài)細胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年。感受態(tài)細胞的制備的操作步驟一、受體菌的培養(yǎng)感受態(tài)細胞的制備的操作步驟

為了提高轉(zhuǎn)化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：細胞生長狀態(tài)和密度:不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時,細胞密度在5×107個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。試劑的質(zhì)量:所用的試劑,如CaCl2

等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行,所用器皿,如離心管,tip頭等經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入,為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。為了提高轉(zhuǎn)化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：大腸桿菌細胞大腸桿菌感受態(tài)細胞得到噬菌斑或單菌落與重組DNA共同冰浴而后42℃短暫熱刺激CaCl2處理受體細菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細菌重組體轉(zhuǎn)入細菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞大腸桿菌感受態(tài)細胞得到噬菌斑或單菌落與重組DNA從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細胞懸液,室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。加入pBS質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后。42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。向管中加入1mlLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細菌恢復正常生長狀態(tài),并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr)。將上述菌液搖勻后取100μl涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)16-24小時。計算轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化的操作步驟從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細胞懸液,室溫下使其解凍，

為了提高轉(zhuǎn)化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：

用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受態(tài)細胞達到飽和。當所轉(zhuǎn)化的ＤＮＡ很難得時（如用從相對難得的樣品中提取mRNA而合成的cDNA),這就顯得格外重要。

一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5％。對照實驗為了提高轉(zhuǎn)化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化：在高壓電場下使細胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個穿孔足夠大并可維持足夠的時間，使外源DNA進入受體細胞。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高2~3個數(shù)量級。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化方法E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化：在高壓電場下使細胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，真核細胞的轉(zhuǎn)染受體細胞系統(tǒng)永生細胞系細胞特異性的選擇標記對抗某種藥物真核細胞的轉(zhuǎn)染受體細胞系統(tǒng)對抗某種藥物電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術：主要用于動物細胞的轉(zhuǎn)染。將DNA溶液加入到CaCl2中，然后在強烈震蕩下加入由Na2HPO4和NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產(chǎn)生磷酸鈣沉淀并將DNA包裹在沉淀中。將這些沉淀加入到細胞中，利用細胞的胞飲作用將DNA導入到細胞中。磷酸鈣一方面可以增加細胞的通透性，一方面可以避免DNA被細胞內(nèi)的核酸酶水解。磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染重組體

+

磷酸鈣微粒內(nèi)吞作用重組體進入細胞大顆粒轉(zhuǎn)染方法電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染重組基因槍轉(zhuǎn)染法：利用被電場或機械加速的金屬微粒能夠進入細胞內(nèi)的基本原理，先將DNA溶液與鎢、金等金屬微粒一起保溫，使DNA吸附在金屬微粒表面，隨高速的金屬微粒直接進入細胞內(nèi)。激光微束穿孔法：利用直徑很小、能量很高的激光束在細胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA進入細胞。顯微注射法：利用毛細管直接將DNA注入細胞內(nèi)。脂質(zhì)體（liposome）介導法：將DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，通過脂質(zhì)體與細胞膜的融合而將DNA導入細胞內(nèi)。多聚物介導法：利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等與二價陽離子、DNA混合形成沉淀顆粒，通過細胞的胞飲作用而進入細胞內(nèi)?；驑屴D(zhuǎn)染法：利用被電場或機械加速的金屬微粒能夠進入細胞內(nèi)的DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）

篩（選陽性克?。┍恚ㄟ_目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向重組體克隆的篩選與鑒定轉(zhuǎn)化后的克隆群體：重組體克隆的篩選與鑒定轉(zhuǎn)化后的克隆群體：陽性重組子的篩選與鑒定遺傳檢測法(根據(jù)重組載體的標志作篩選)--插入失活法--α-互補法限制性酶切法PCR法雜交篩選法免疫學方法核苷酸序列測定法陽性重組子的篩選與鑒定遺傳檢測法(根據(jù)重組載體的標志作篩選)遺傳檢測法菌株為某種抗生缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素，卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。遺傳檢測法菌株為某種抗生缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如對于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進行篩選。如pBR322中帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因，當將目的基因插入抗四環(huán)素基因后，就可引起該基因失活，細菌對氨芐青霉素耐藥，而對四環(huán)素敏感。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長的細菌即為帶重組體的細菌。對于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進行篩選如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板α-互補法——藍白篩選現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和N端１４６個氨基酸偏碼區(qū)（全長1201氨基酸）。這個編碼區(qū)中插入一個多克隆位點。受體菌是Z基因突變型，只含編碼β－半乳糖苷酶Ｃ端aa的序列。當外源基因插入時，在IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）誘導下合成β－半乳糖苷酶N端片斷，和受體菌的C端片斷溶為一體后，可產(chǎn)生蛋白質(zhì)間的互補，形成有活性的β－半乳糖苷酶，稱α互補。具有α互補的細菌培養(yǎng)在含IPTG及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培養(yǎng)基上。X-gal本身是無色的，在半乳糖苷酶的水解下產(chǎn)生蘭色的物質(zhì)（被水解為無色的半乳糖及深蘭色的5-溴-4-氯靛蘭），因此會形成藍色菌落。而當有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入突變失活，則不能產(chǎn)生α互補，因此菌落是白色的。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。IPTG起誘導表達的作用，相當于乳糖，但它的誘導效率遠高于乳糖。α-互補法——藍白篩選現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含α-互補法α-互補法限制性酶切法

經(jīng)過粗篩后的含重組體的細菌，還需進行限制酶譜分析進一步鑒定。將單一細菌進行擴增后分別提取其DNA，用重組時所用的同一限制酶進行酶切，再將其與不含目的基因的載體一起進行電泳比較分析，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)目的基因片段的電泳帶即證明重組體中帶有目的基因。限制性酶切法經(jīng)過粗篩后的含重組體的細菌，還需進凝膠電泳檢測加樣孔DNAMarker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒

重組質(zhì)粒酶切重組質(zhì)粒的PCR擴增片段凝膠電泳檢測加樣孔DNAMarker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組PCR法利用的目標引物(例如分離目的基因所使用的引物)，抽提需要篩選的克隆的重組DNA作為模板,進行PCR擴增,根據(jù)是否擴增出目的片段來確定陽性克隆。PCR法利用的目標引物(例如分離目的基因所使用的引物)，抽提雜交篩選法為了進一步鑒定重組基因體中的目的基因，可采用與目的基因部分互補的DNA片段作為探針，與含有重組體的細菌菌落進行雜交，經(jīng)放射自顯影，如結(jié)果為陽性，即可確定重組體中帶目的基因。32P標記的DNA分子探針雜交放射自顯影法雜交篩選法為了進一步鑒定重組基因體中的目的基因，可采用與目的基因重組與基因工程技術課件依據(jù)：堿基互補配對原則步驟：①合成核酸探針（與所需基因互補的核苷酸短鏈，并用同位素標記）②升高溫度或改變pH使DNA變性③分子雜交（常用原位分子雜交）如果基因文庫中的一個DNA片段能和探針結(jié)合形成雙鏈，這一片段即含有所需基因。分子雜交依據(jù)：堿基互補配對原則分子雜交免疫化學檢測法濾膜（固定抗體）+免疫化學檢測法濾膜（固定抗體）+DNA序列分析法該方法通常是用在目的基因篩選后最終的鑒定。ACTGAAGGCTDNA序列分析法該方法通常是用在目的基因篩選后最終的鑒定。A真核細胞的篩選新霉素抗性選擇系統(tǒng)：新霉素是原核生物的抗生素，對真核生物沒有抑制作用，但新霉素的類似物G418對真核細胞及原核細胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真核細胞中表達并能使G418失活（neo基因編碼一個磷酸轉(zhuǎn)移酶），細胞可以生長。真核細胞的篩選新霉素抗性選擇系統(tǒng)：真核細胞的篩選標記新霉素類藥物G418篩選AmNeoPoriG418滅活（-）蛋白質(zhì)合成真核細胞的篩選標記新霉素類藥物G418篩選AmNeoPortk-細胞突變株篩選轉(zhuǎn)染細胞選擇原理：

tk(胸苷激酶)基因的篩選：受體細胞必須是相應的tk-，將細胞培養(yǎng)在含HAT（H：黃嘌呤，A：氨甲喋呤，T：胸苷）的培養(yǎng)基中。在A存在下，核苷酸的從頭合成途徑被阻斷，不能合成AMP、TMP及GMP。這三種核苷酸的合成只能有補償途徑合成，必須具有tk基因的存在細胞才可生長。tk-細胞突變株篩選轉(zhuǎn)染細胞選擇原理：氨基喋呤篩選法氨基喋呤(HAT選擇)核酸從頭合成（-）核酸補救合成（TK酶）TK-TK+氨基喋呤篩選法氨基喋呤核酸從頭合成（-）核酸補救合成（TK酶DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克?。?/p>

表（達目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向外源基因在宿主細胞中的表達外源基因在宿主細胞中的表達重組子目的基因的mRNA表達蛋白質(zhì)大腸桿菌（E.coli）受體細胞外源基因在宿主細胞中的表達重組子目的基因的mRNA表達蛋白質(zhì)大腸桿菌（E.coli）原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達特點原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進行。原核生物形成多順反子mRNA：mRNA在合成過程中和多個核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。一般不含內(nèi)含子（intron），沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)。原核生物中功能相關的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。操縱子是一組功能上相關，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個遺傳單位。原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達特點原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形D原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)：

啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。一般長40-60bp，富含A-T堿基對具有保守序列：-10區(qū)（pribnowbox）：TATAAT

-35區(qū)：終止子（terminator，T）:位于基因3’端,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)：與翻譯有關的原核細胞結(jié)構(gòu)：——核糖體結(jié)合位點翻譯起始密碼子AUG或GUGSD順序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11bp長約3-9bpmRNA與16s核糖體亞基間的識別與結(jié)合序列與翻譯有關的原核細胞結(jié)構(gòu)：——核糖體結(jié)合位點

人類對大腸桿菌經(jīng)過長期的研究，對其特性和遺傳背景了解得最清楚，大腸桿菌培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快、價格低廉，人們用大腸桿菌用外源基因的表達工具已有幾十年的經(jīng)驗積累，大腸桿菌表達外源基因產(chǎn)物的水平遠高于其它基因表達系統(tǒng)，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的80%。因此大腸桿菌是目前應用最廣泛的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。設計外源基因在大腸桿菌表達就需要外源基因在大腸桿菌中表達所需要的元件，包括轉(zhuǎn)錄起始必需的啟動子、翻譯起始所必需的核糖體識別序列等；外源基因表達的產(chǎn)物可能會對大腸桿菌有毒害作用，會影響細菌的生存繁殖，所以大多數(shù)表達載體都帶有誘導性表達所需要的元件，即有操縱子序列以及與之配套的調(diào)控基因等；外源基因還應當插入到適合于表達的位置，所以表達載體中要設有適合的多克隆位點；此外還應具備基因克隆篩選的條件，包括在細胞中復制必需的復制起始序列、篩選標志如抗藥性基因等。人類對大腸桿菌經(jīng)過長期的研究，對其特性和遺傳外源基因在原核表達系統(tǒng)中表達的必要條件：刪除內(nèi)含子和5’非編碼區(qū)外源基因置于強啟動子和SD順序控制下維持正確開放閱讀框架（ORF）mRNA穩(wěn)定且可有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不被降解外源基因在原核表達系統(tǒng)中表達的必要條件：原核表達載體(expressingvector)特點：帶表達構(gòu)件—轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的DNA序列大腸桿菌表達載體：含啟動子—核糖體結(jié)合位點—克隆位點—轉(zhuǎn)錄終止信號啟動子：trp-lac(tac)啟動子、λ噬菌體PL啟動子、T7噬菌體啟動子核糖體結(jié)合位點(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密碼子(ATG)和SD序列轉(zhuǎn)錄終止序列原核表達載體(expressingvector)特點：帶表影響外源基因在原核細胞中表達效率的因素：啟動子終止子SDmRNA多肽鏈影響外源基因在原核細胞中表達效率的因素：啟動子終止子SDmR啟動子的選擇和改造強啟動子可調(diào)控啟動子P啟動子：建立表達載體時，選擇強啟動子。

啟動子最佳作用距離-轉(zhuǎn)錄起始點啟動子的選擇和改造P啟動子：建立表達載體時，選擇強啟動子。常見原核強啟動子：Plac：受Lac阻遏蛋白負調(diào)，受IPTG的誘導Ptrp：取自大腸桿菌色氨酸操縱子。Ptac:Lac啟動子和Trp啟動子的雜合啟動子。PL和PR啟動子：噬菌體早期左/右向啟動子，受λ噬菌體CI基因負調(diào)控。溫度誘導。常見原核強啟動子：PromotersforE.coliPromotersforE.coli終止子：強終止子、二聚體終止子終止子啟動子轉(zhuǎn)錄過度影響目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率干擾基因載體的復制等生物學功能增加受體細胞的無效能量消耗終止子：強終止子、二聚體終止子終止子啟動子轉(zhuǎn)錄過度SD序列：影響翻譯效率SD序列與16SrRNA的互補性SD的后續(xù)序列的核苷酸組成SD與起始密碼之間的距離mRNASDSD序列：影響翻譯效率SD序列與16SrRNA的互補性mRN融合型表達載體：----融合蛋白非融合型表達載體：---天然完整蛋白分泌型表達載體：----產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙原核表達載體的類型融合型表達載體：----融合蛋白原核表達載體的類型融合型表達載體

PSDForeignDNA融合型表達載體融合基因優(yōu)點：表達效率高產(chǎn)物穩(wěn)定易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定易純化：利用融合原核多肽的特性融合型表達載體PSDForeignDNA融合型表達載體融技術關鍵：

克隆基因插入原核序列3’端而維持正確閱讀框架。選擇合適酶切位點加人工合成的DNA接頭構(gòu)建位相載體技術關鍵：位相載體--含有3種讀碼框的系列載體位相載體--含有3種讀碼框的系列載體Ptac：IPTG誘導GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子位相載體融合型載體----pGEX系列Ptac：IPTG誘導融合型載體----pGEX系列非融合型表達載體PSDForeignDNA非融合型表達載體非融合基因主要元件：強啟動子

SD：

ATG：第一個密碼子非融合型表達載體PSDForeignDNA非融合型表達載非融合型表達載體--pPL-LamdaPL啟動子---溫度誘導插入位點--HpaI非融合型表達載體--pPL-LamdaPL啟動子---溫度誘分泌型表達載體：主要元件：啟動子和SD序列信號肽序列：SD下游，編碼信號肽，可引導蛋白跨膜優(yōu)點：分泌表達，避免降解。分泌型表達載體：分泌型表達載體--pINIII-ompA1分泌型表達載體--pINIII-ompA1沒有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進行mRNA的剪接，所以只能表達cDNA而不能表達真核的基因組基因；沒有真核翻譯后加工的功能，表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構(gòu)像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)常沒有足夠的生物學活性；表達的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會在細菌內(nèi)聚集成包涵體（inclusionbody），尤其當表達目的蛋白量超過細菌體總蛋白量10%時，就很容易形成包涵體。生成包涵體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成速度太快，多肽鏈相互纏繞，缺乏使多肽鏈正確折疊的因素，導致疏水基因外露等。細菌裂解后，包涵體的離心后的沉淀中，雖然有利于目的蛋白的初步純化，但無生物活性的不溶性蛋白，要經(jīng)過復性（renaturation），使其重新散開、重新折疊成具有天然蛋白構(gòu)象和良好生物活性的蛋白質(zhì)，常常是一件很困難的事情。也可以設計載體使大腸桿菌分泌表達出可溶性目的蛋白，但表達量往往不高。原核表達系統(tǒng)的缺點沒有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進行mRNA的剪接，所以只能表具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)具翻譯后修飾系統(tǒng)可實現(xiàn)真正的分泌表達基因治療真核表達系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢真核基因結(jié)構(gòu)及表達調(diào)控特點真核基因組的復雜性：真核基因組龐大，具大量非編碼序列---mRNA豐度不同結(jié)構(gòu)復雜：染色質(zhì)、核膜、線粒體---表達調(diào)控多樣不連續(xù)性：內(nèi)含子、外顯子沒有操縱子結(jié)構(gòu)真核基因結(jié)構(gòu)及表達調(diào)控特點真核基因組的復雜性：據(jù)受體細胞及表達載體的不同分為3種：酵母表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)昆蟲細胞表達系統(tǒng)據(jù)受體細胞及表達載體的不同分為3種：

要表達真核生物的蛋白質(zhì)，采用真核表達系統(tǒng)自然應比原核系統(tǒng)優(yōu)越。真核表達載體至少要含兩類序列：原核質(zhì)粒的序列，包括在大腸桿菌中起作用的復制起始序列、能用在細菌中篩選克隆的抗藥性基因標志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組DNA克隆、并復制繁殖得到足夠使用的數(shù)量。②在真核宿主細胞中表達重組基因所需要的元件，包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止和加poly-A信號序列、mRNA剪接信號序列、能在宿主細胞中復制或增殖的序列，能用在宿主細胞中篩選的標志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內(nèi)切酶識別位點等。

要表達真核生物的蛋白質(zhì)，采用真核表達系統(tǒng)自然應比原真核表達載體真核表達元件：啟動子/增強子克隆位點終止信號和加poly(A)信號剪接識別信號復制與選擇元件真核表達載體真核表達元件：外源基因的表達：胞內(nèi)表達分泌表達：在MCS前加入信號肽序列缺點:不能實現(xiàn)全部的翻譯后修飾功能外源基因的表達：ExampleExampleIPTG------->T7RNApol--------->His6-cDNACalreticulinasanexample(CalreticulinisanERchaperone)鈣網(wǎng)蛋白

calreticulin

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種需Ca2+的凝集素樣分子伴侶蛋白(inhibitsT7pol)InducibilityinE.coli:viaT7RNApolymeraseaninducibleIPTG------->T7RNApol----OFFON+IPTGLacrepressorLysozymeTosquelchbackgroundlowlevelofT7polcalreticulinLacrepressorLacrepressorgeneOFFON+IPTGLacrepressorLysozy(competeswithhis)Purificationoftheclonedgeneproduct(Nitriloaceticacid

chelate,NTA)(competeswithhis)PurificatioMBP=maltosebindingproteinGST=glutathione-S-transferaseAssortedproteintagsusedforpurification(bindstobiotinsite)(Getsbiotinylatedinvivo)(Amp-resistance)(IgG-bindingdomainfromProteinA)MBP=maltosebindingproteinAEnterokinase: AspAspAspAspLys……ORTagremovalafterpurificationORTEVprotease(tobaccoetchvirus):Glu-X-X-Tyr-X-Gln-SerEnterokinase: AspAspAsp目的蛋白的分離純化親和柱分子篩離子交換疏水層析抗原抗體目的蛋白目的蛋白的分離純化親和柱目的蛋白基因重組與基因工程技術課件基因重組與基因工程技術課件

基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNA重組技術的方法，把DNA作為組件，在細胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細胞，使外源基因DNA在宿主細胞中，隨細胞的繁殖而增殖（cloning，克?。蜃詈蟮玫奖磉_，最終獲得基因表達產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀?；蛑亟M技術作為分子生物學最重要、最基本的技術之一，是許多分子生物,生物化學和細胞生物學實驗實施的基礎?；蚬こ桃喾Q遺傳工程，即利

現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人P·伯格（美國,1926－）在1960年以敏銳的科學預見力提出一個大膽的設想：是否可以創(chuàng)造出一種人工方法，把外界的遺傳基因引入動物體內(nèi)，以達到改變遺傳性狀和治療某些疾病的需要呢？1972年，伯格把兩種病毒的DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，首次實現(xiàn)兩種不同生物的DNA體外連接，獲得了第一批重組DNA分子，這標志著基因工程技術的誕生。伯格因此獲得了1980年諾貝爾化學獎。

現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人P·伯格（美國,1926

1973年，美國斯坦福大學教授S·科恩和加州大學舊金山分校教授H·W·博耶將兩個不同的質(zhì)粒（一個是抗四環(huán)素質(zhì)粒，另一個是抗鏈霉素質(zhì)粒）拼接在一起，組成嵌合質(zhì)粒，并將其導入大腸桿菌，當該重組質(zhì)粒進入大腸桿菌體內(nèi)后，這些大腸桿菌能抵抗兩種藥物，而且這種大腸桿菌的后代都具有雙重抗藥性。這表明“雜合質(zhì)?！痹诖竽c桿菌的細胞分裂時也能自我復制。1973年，美國斯坦福大學教授S·科恩和加州大學舊金科恩隨后以DNA重組技術發(fā)明人的身份向美國專利局申報了世界上第一個基因工程的技術專利。這標志著自然界不同物種間在億萬年中形成的天然屏障被打破了，人類可以根據(jù)自己的意愿定向地改造生物的遺傳特性，甚至創(chuàng)造新的生命類型。

1977年，吉爾伯特（W·Gilbert）分別將編碼胰島素和干擾素的DNA經(jīng)過體外重新拼接后，導入大腸桿菌中，分別使大腸桿菌合成了胰島素和干擾素?？贫麟S后以DNA重組技術發(fā)明人的身份向美國專利局申報DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克?。┍恚ㄟ_目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術路線目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術路線(分)------目的基因及載體的分離需要克隆的DNA片段：化學合成法

cDNA文庫基因組DNA文庫聚合酶鏈式反應目的基因的獲取(分)------目的基因及載體的分離需要克隆的DNA片段：從基因所在生物直接取得--用限制酶剪切供體DNA--用機械的方法eg超聲波從基因所在生物直接取得化學合成法人工合成：根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進行人工合成。適應于編碼小分子多肽的基因。較短的核酸片段（60-80bp）多肽鏈的氨基酸順序mRNA的堿基排列順序相應的基因結(jié)構(gòu)化學合成目的基因化學合成法人工合成：多肽鏈的氨基酸順序mRNA的堿基排列順序化學合成的最大優(yōu)點是可以合成一些分離較困難的基因?；瘜W合成的不足之處在于：

--要已知基因的核苷酸順序；

--基因不能太大，這一方面是測定核苷酸（或氨基酸）順序比較困難，另一方面是因為每次僅能合成幾百ｂｐ的短片段，短片段越多，要連接成正確的基因順序就越困難，得率越低；

--價格昂貴。用途：PCR引物,測序引物,定點突變,核酸雜交探針化學合成的最大優(yōu)點是可以合成一些分離較困難的基因。從基因文庫中篩選將某一種基因DNA用適當?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為G文庫(genomicDNAlibrary)。將某種細胞的全部mRNA通過逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到含全部表達基因的種群，稱為C-文庫(cDNAlibrary)。C-文庫具有組織細胞特異性。從基因文庫中篩選將某一種基因DNA用適當?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA構(gòu)建基因文庫獲取目的基因存在的問題——

費時費事 內(nèi)含子序列反轉(zhuǎn)錄人工合成互補DNA方法的優(yōu)勢——獲取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA構(gòu)建基因文庫獲取目的基因存在的問聚合酶鏈式反應

（polymerasechainreaction,PCR）如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應技術，在體外合成目的基因。但此法可能會造成克隆的目的基因堿基序列的改變。聚合酶鏈式反應

（polymerasechainreac載體DNA的選擇理想載體的基本條件：可轉(zhuǎn)移性,為目的基因提供進入受體細胞的轉(zhuǎn)移能力。合適的復制位點,為目的基因提供在受體細胞中的復制能力或整合能力。多克隆位點：廣泛、特異選擇標志，便于篩選和鑒定分子較小，可容納較大的外源DNA載體DNA的選擇理想載體的基本條件：質(zhì)粒噬菌體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體……種類：質(zhì)粒種類：質(zhì)粒載體的一般結(jié)構(gòu)存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。具有自我復制功能。帶有抗性基因及表型識別等遺傳性標記物。經(jīng)改造后具有多克隆位點。質(zhì)粒載體的一般結(jié)構(gòu)存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子?；蛑亟M與基因工程技術課件DNA重組的基本模式

分（離目的基因）

切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克?。┍恚ㄟ_目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向切------限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切酶切切------限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切酶切載體和目的基因的切斷通常采用限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)，簡稱限制酶，分別對載體DNA和目的基因進行切斷，以便于重組。限制酶目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400多種，所識別的順序往往為4-8個堿基對，且有回文結(jié)構(gòu)。由限制酶切斷后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三種情況。形成粘性末端(cohesiveend)者較有利于載體DNA和目的基因的重組。載體和目的基因的切斷通常采用限制性核酸內(nèi)切酶(restric酶切--雙酶切：體系：選擇合適的緩沖體系，尤其是雙酶切反應中。DNA：經(jīng)過純化的，盡量不含有蛋白質(zhì)，酒精等雜質(zhì)。時間：一般為5-7h，載體overnight以保證酶切完全。不能時間過長，以防止內(nèi)切酶的star活性，降低特異性。酶切之后立即回收，小片段用PCR-purificationKit除去，大的片段要用切膠回收去除。酶切T-vectorT-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的TPCR過程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個AT-vectorT-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）

接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克?。┍恚ㄟ_目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向接------載體和目的基因的連接（一）粘性末端連接法：當載體DNA和目的基因均用同一種限制酶進行切斷時，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過粘性末端進行互補粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。較少的情況下，對產(chǎn)生的平端也可直接進行連接。即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的DNA分子。接------載體和目的基因的連接（一）粘性末端連接法：即將載體DNA與目的基因的連接載體DNA與目的基因的連接（二）人工接尾法：即同聚物加尾連接法。當載體和目的基因無法采用同一種限制酶進行切斷，無法得到相同得粘性末端時，可采用此方法。此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3'-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過堿基互補進行粘合，再由DNA連接酶連接。（二）人工接尾法：末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它所催化的反應與DNApolI相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段為引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸達幾百個。末端轉(zhuǎn)移酶常用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）基因重組與基因工程技術課件（三）人工接頭連接法：將人工連接器（linker，即一段人工合成的含有多種限制酶切點的小分子DNA片段，約10~20個核苷酸）連接到平末端DNA分子(載體和目的基因)上，即有可能使用同一種限制酶對載體和目的基因進行切斷，得到可以互補的粘性末端。這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。（三）人工接頭連接法：連接體系的建立：溫度：粘末端連接：12-18℃(16-20hours)

平末端連接：室溫（低于30℃)DNA量：載體分子數(shù)/目的基因分子數(shù)=1：3-5酶量：平端連接時需加大酶量

連接反應體系越小越好，相對而言，酶切體系稍大較好連接體系的建立：連接失敗后--一步一步向上游檢測問題所在，所以分子克隆部分“留一半”的原則有時候是很有用的。酶切是否完全，所以要做載體的自連對照。載體酶切回收是否考慮到切除片段的大小，是否要用切膠回收更保險。連接失敗后--DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）篩（選陽性克隆）表（達目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向轉(zhuǎn)------重組體的轉(zhuǎn)化受體細胞重組體的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)------重組體的轉(zhuǎn)化受體細胞重組體的轉(zhuǎn)化宿主菌或受體細胞原核系統(tǒng)

--大腸桿菌

--枯草桿菌真核系統(tǒng)

--酵母菌酵母

--昆蟲細胞

--哺乳動物細胞宿主菌或受體細胞原核系統(tǒng)原核細胞的轉(zhuǎn)化（細菌轉(zhuǎn)化）

受體細胞的選擇：限制缺陷型:避免修飾和降解重組缺陷型：避免重組整合轉(zhuǎn)化親和型：較高的可轉(zhuǎn)化性遺傳互補型：利于篩選感染缺陷型：防止感染原核細胞的轉(zhuǎn)化（細菌轉(zhuǎn)化）受體細胞的選擇：感受態(tài)細胞（competentcell）所謂感受態(tài)，就是細菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌，需誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2等化學試劑法）的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞（Competentcells）。感受態(tài)細胞（competentcell）所謂感受態(tài)，就大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(化學方法)大腸桿菌細胞大腸桿菌感受態(tài)細胞CaCl2處理目前常用的感受態(tài)細胞制備方法是CaCl2法,CaCl2

法簡便易行,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求,制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時,可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(化學方法)大腸桿菌細胞大腸桿菌感一、受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α單菌落,接種于3-5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12小時左右,直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600＝0.5左右。二、感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘，然后于4℃下3000g離心10分鐘。棄去上清,用預冷的0.05mol/L的CaCl2

溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘后，4℃下3000g離心10分鐘。棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細胞懸液。感受態(tài)細胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年。感受態(tài)細胞的制備的操作步驟一、受體菌的培養(yǎng)感受態(tài)細胞的制備的操作步驟

為了提高轉(zhuǎn)化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：細胞生長狀態(tài)和密度:不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時,細胞密度在5×107個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。試劑的質(zhì)量:所用的試劑,如CaCl2

等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行,所用器皿,如離心管,tip頭等經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入,為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。為了提高轉(zhuǎn)化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：大腸桿菌細胞大腸桿菌感受態(tài)細胞得到噬菌斑或單菌落與重組DNA共同冰浴而后42℃短暫熱刺激CaCl2處理受體細菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細菌重組體轉(zhuǎn)入細菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞大腸桿菌感受態(tài)細胞得到噬菌斑或單菌落與重組DNA從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細胞懸液,室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。加入pBS質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后。42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。向管中加入1mlLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細菌恢復正常生長狀態(tài),并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr)。將上述菌液搖勻后取100μl涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)16-24小時。計算轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化的操作步驟從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細胞懸液,室溫下使其解凍，

為了提高轉(zhuǎn)化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：

用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受態(tài)細胞達到飽和。當所轉(zhuǎn)化的ＤＮＡ很難得時（如用從相對難得的樣品中提取mRNA而合成的cDNA),這就顯得格外重要。

一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5％。對照實驗為了提高轉(zhuǎn)化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化：在高壓電場下使細胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個穿孔足夠大并可維持足夠的時間，使外源DNA進入受體細胞。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高2~3個數(shù)量級。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化方法E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化：在高壓電場下使細胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，真核細胞的轉(zhuǎn)染受體細胞系統(tǒng)永生細胞系細胞特異性的選擇標記對抗某種藥物真核細胞的轉(zhuǎn)染受體細胞系統(tǒng)對抗某種藥物電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術：主要用于動物細胞的轉(zhuǎn)染。將DNA溶液加入到CaCl2中，然后在強烈震蕩下加入由Na2HPO4和NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產(chǎn)生磷酸鈣沉淀并將DNA包裹在沉淀中。將這些沉淀加入到細胞中，利用細胞的胞飲作用將DNA導入到細胞中。磷酸鈣一方面可以增加細胞的通透性，一方面可以避免DNA被細胞內(nèi)的核酸酶水解。磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染重組體

+

磷酸鈣微粒內(nèi)吞作用重組體進入細胞大顆粒轉(zhuǎn)染方法電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染重組基因槍轉(zhuǎn)染法：利用被電場或機械加速的金屬微粒能夠進入細胞內(nèi)的基本原理，先將DNA溶液與鎢、金等金屬微粒一起保溫，使DNA吸附在金屬微粒表面，隨高速的金屬微粒直接進入細胞內(nèi)。激光微束穿孔法：利用直徑很小、能量很高的激光束在細胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA進入細胞。顯微注射法：利用毛細管直接將DNA注入細胞內(nèi)。脂質(zhì)體（liposome）介導法：將DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，通過脂質(zhì)體與細胞膜的融合而將DNA導入細胞內(nèi)。多聚物介導法：利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等與二價陽離子、DNA混合形成沉淀顆粒，通過細胞的胞飲作用而進入細胞內(nèi)?；驑屴D(zhuǎn)染法：利用被電場或機械加速的金屬微粒能夠進入細胞內(nèi)的DNA重組的基本模式

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉(zhuǎn)（化宿主細胞）

篩（選陽性克隆）表（達目的基因）“縱向”體系DNA重組的基本模式分（離目的基因）“縱向重組體克隆的篩選與鑒定轉(zhuǎn)化后的克隆群體：重組體克隆的篩選與鑒定轉(zhuǎn)化后的克隆群體：陽性重組子的篩選與鑒定遺傳檢測法(根據(jù)重組載體的標志作篩選)--插入失活法--α-互補法限制性酶切法PCR法雜交篩選法免疫學方法核苷酸序列測定法陽性重組子的篩選與鑒定遺傳檢測法(根據(jù)重組載體的標志作篩選)遺傳檢測法菌株為某種抗生缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素，卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。遺傳檢測法菌株為某種抗生缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如對于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進行篩選。如pBR322中帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因，當將目的基因插入抗四環(huán)素基因后，就可引起該基因失活，細菌對氨芐青霉素耐藥，而對四環(huán)素敏感。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長的細菌即為帶重組體的細菌。對于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進行篩選如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板α-互補法——藍白篩選現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和N端１４６個氨基酸偏碼區(qū)（全長1201氨基酸）。這個編碼區(qū)中插入一個多克隆位點。受體菌是Z基因突變型，只含編碼β－半乳糖苷酶Ｃ端aa的序列。當外源基因插入時，在IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）誘導下合成β－半乳糖苷酶N端片斷，和受體菌的C端片斷溶為一體后，可產(chǎn)生蛋白質(zhì)間的互補，形成有活性的β－半乳糖苷酶，稱α互補。具有α互補的細菌培養(yǎng)在含IPTG及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培養(yǎng)基上。X-gal本身是無色的，在半乳糖苷酶的水解下產(chǎn)生蘭色的物質(zhì)（被水解為無色的半乳糖及深蘭色的5-溴-4-氯靛蘭），因此會形成藍色菌落。而當有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入突變失活，則不能產(chǎn)生α互補，因此菌落是白色的。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。IPTG起誘導表達的作用，相當于乳糖，但它的誘導效率遠高于乳糖。α-互補法——藍白篩選現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含α-互補法α-互補法限制性酶切法

經(jīng)過粗篩后的含重組體的細菌，還需進行限制酶譜分析進一步鑒定。將單一細菌進行擴增后分別提取其DNA，用重組時所用的同一限制酶進行酶切，再將其與不含目的基因的載體一起進行電泳比較分析，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)目的基因片段的電泳帶即證明重組體中帶有目的基因。限制性酶切法經(jīng)過粗篩后的含重組體的細菌，還需進凝膠電泳檢測加樣孔DNAMarker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒

重組質(zhì)粒酶切重組質(zhì)粒的PCR擴增片段凝膠電泳檢測加樣孔DNAMarker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組PCR法利用的目標引物(例如分離目的基因所使用的引物)，抽提需要篩選的克隆的重組DNA作為模板,進行PCR擴增,根據(jù)是否擴增出目的片段來確定陽性克隆。PCR法利用的目標引物(例如分離目的基因所使用的引物)，抽提雜交篩選法為了進一步鑒定重組基因體中的目的基因，可采用與目的基因部分互補的DNA片段作為探針，與含有重組體的細菌菌落進行雜交，經(jīng)放射自顯影，如結(jié)果為陽性，即可確定重組體中帶目的基因。32P標記的DNA分子探針雜交放射自顯影法雜交篩選法為了進一步鑒定重組基因體中的目的基因，可采用與目的基因重組與基因工程技術課件依據(jù)：堿基互補配對原則步驟：①合成核酸探針（與所需基因互補的核苷酸短鏈，并用同位素標記）②升高溫度或改變pH使DNA變性③分子雜交（常用原位分子雜交）如果基因文庫中的一個DNA片段能和探針結(jié)合形成雙鏈，這一片段即含有所需基因。分子雜交依據(jù)：堿基互補配對原則分子雜交免疫化學檢測法濾膜（固定抗體）+免疫化學檢測法濾膜（固定抗體）+DNA序列分析法該方法通常是用在目的基因篩選后最終的鑒定。ACTGAAGGCTDNA序列分析法該方法通常是用在目的基因篩選后最終的鑒定。A真核細胞的篩選新霉素抗性選擇系統(tǒng)：新霉素是原核生物的抗生素，對真核生物沒有抑制作用，但新霉素的類似物G418對真核細胞及原核細胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真核細胞中表達并能使G41