賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性-課件

第三節(jié)

基因工程簡(jiǎn)介知識(shí)目標(biāo)：1．

簡(jiǎn)述基因工程的概念2．

簡(jiǎn)述基因操作的三種基本工具的作用3．

簡(jiǎn)述基因工程的原理和基本操作程序4．

舉例說(shuō)出基因工程所取得的成果和發(fā)展前景第三節(jié)

基因工程簡(jiǎn)介知識(shí)目標(biāo)：1基因工程的基本內(nèi)容基因操作的工具基因操作的基本步驟基因工程的成果與發(fā)展前景基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生基因工程與農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)基因工程與環(huán)境保護(hù)基因工程的基本內(nèi)容2精品資料精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒(méi)有總結(jié)一節(jié)課的重點(diǎn)的難點(diǎn)，你是否會(huì)認(rèn)為老師的教學(xué)方法需要改進(jìn)？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽(yáng)曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒(méi)有學(xué)問(wèn)無(wú)顏見(jiàn)爹娘……”“太陽(yáng)當(dāng)空照，花兒對(duì)我笑，小鳥(niǎo)說(shuō)早早早……”賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性--課件4新課標(biāo)：普通高中課程標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)教科書(shū)科技探索之路基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具1.2基因工程的基本操作程序

拓展視野歷史不能忘記中國(guó)科學(xué)家對(duì)PCR的貢獻(xiàn)1.3基因工程的應(yīng)用

拓展視野神奇的基因芯片1.4蛋白質(zhì)工程的崛起選修3現(xiàn)代生物科技專題專題1基因工程新課標(biāo)：普通高中課程標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)教科書(shū)科技探索之路基礎(chǔ)理論5基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程

基因工程理論上三大突破：

（1）DNA是遺傳物質(zhì)——

1943美Avery肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)等。（2）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)——1953美Watson英CrickDNA雙螺旋模型；1958M.Meselson&F.Stahl用實(shí)驗(yàn)證明了半保留復(fù)制，不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。（3）64個(gè)密碼子破譯和中心法則的確立——

1958WatsonandCrick提出中心法則，闡明了遺傳信息的流動(dòng)方向，多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。

密碼形式——使遺傳學(xué)在分子水平上得到解釋，密碼子是通用的基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程6（3）蛋白組分析蛋白質(zhì)合成后，還要進(jìn)行磷酸化、糖基化、除去末端氨基酸、蛋白質(zhì)剪切等翻譯后修飾，僅從核酸的序列并不能完全描述一個(gè)蛋白質(zhì)。盡管分析不同細(xì)胞類型中表達(dá)的蛋白已近20年，直到1995年才由Wilkins和Williams提出一個(gè)與基因組相對(duì)應(yīng)的名詞蛋白組分析的核心技術(shù)是蛋白質(zhì)雙向電泳。

技術(shù)上三大發(fā)明：（1）基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)——1967，T.F.Roth&D.R.Helinski，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的自我復(fù)制能力，并能夠在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移。基因是可以轉(zhuǎn)移的。（2）工具酶的發(fā)明——1972H.C.Smith、W.Arber&D.Nathans從流感嗜血桿菌中分離得到限制性內(nèi)切酶；1970年，逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)使真核細(xì)胞的基因制備成為可能；此后，多種限制酶和連接酶發(fā)現(xiàn)?；蚴强汕懈畹?。（3）DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)——1972年，美Berg第一次構(gòu)建出了體外重組DNA分子。重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功——1973，H.Boyer&S.Cohen選用僅含單一EcoRI酶切位點(diǎn)的載體質(zhì)粒pSC101，使之與非洲爪蟾核糖體蛋白基因的DNA片段重組。重組的DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌DNA中，轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA?；蚬こ陶Q生元年（3）蛋白組分析技術(shù)上三大發(fā)明：7H.Boyer&S.CohenH.Boyer&S.Cohen8技術(shù)進(jìn)一步推動(dòng)基因工程的發(fā)展：（1）第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物問(wèn)世——1980科學(xué)家通過(guò)顯微注射培育出世界第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠。1983，科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。（2）PCR技術(shù)的發(fā)明——1988年，美K.Mullis發(fā)明PCR技術(shù)，使基因工程進(jìn)一步發(fā)展。TheNobelPrizeinChemistry1993"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"KaryB.Mullis

LaJolla,CA,USA技術(shù)進(jìn)一步推動(dòng)基因工程的發(fā)展：TheNobelPrize9

4．基因工程的發(fā)展歷史1）1972年美國(guó)Berg,Jackson等人將基因工程的發(fā)展歷史

1）1972年美國(guó)Berg,Jackson等人將猿猴病基因組SV40DNA,噬菌體基因，大腸桿菌半乳糖操縱子，體外重組獲得成功。2）1973年美國(guó)斯坦福大學(xué)Cohen,Boyer等，在體外構(gòu)建含有四環(huán)素，鏈霉素兩個(gè)抗性基因的重組質(zhì)粒分子,導(dǎo)入大腸桿菌后穩(wěn)定復(fù)制，賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性。------（宣告基因工程誕生）3）1978年美國(guó)Genentech公司利用重組大腸桿菌合成人胰島素的先進(jìn)生產(chǎn)工藝----（揭開(kāi)基因工程產(chǎn)業(yè)化的序幕）4）1983年，攜帶有細(xì)菌新霉素抗性基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞獲得成功-------（高等植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)問(wèn)世）5）1990年，美國(guó)科學(xué)家對(duì)一名因腺苷脫氨酶基因缺陷患有重度聯(lián)合免疫缺陷癥的兒童進(jìn)行基因治療獲得成功。-------（分子醫(yī)學(xué)新紀(jì)元）6）1991年，美國(guó)倡導(dǎo)在全球?qū)嵤┤祟惢蚪M計(jì)劃，用15年時(shí)間斥資30億美元，完成12萬(wàn)5000個(gè)人類基因的全部測(cè)序工作。7）1997年，英國(guó)科學(xué)家利用體細(xì)胞克隆技術(shù)復(fù)制出“多利”綿羊。-------（人類可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)制自身的嘗試）2005年，鄧宏魁，丁明孝教授克隆小白鼠在中國(guó)屬首例。4．基因工程的發(fā)展歷史基因工程10

遺傳工程（基因工程）研究的意義（1）說(shuō)明兩種能力A.基因工程，它超越生物種屬界限,具有跨越天然物種屏障的能力.B.把來(lái)自任何一種生物的基因，放置在與其毫無(wú)親緣關(guān)系的新的寄主生物細(xì)胞中的能力。（2）表明一種創(chuàng)造性應(yīng)用這一技術(shù)，有可能按照人們的主觀愿望，創(chuàng)造出自然界中原先并不存在的新的生物類型。（3）簡(jiǎn)化生物物種進(jìn)化程序，加快生物物種進(jìn)化速度.（4）強(qiáng)調(diào)了一種事實(shí)：確定的DNA小片段在新寄主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增的事實(shí)—可以制備到大量純化的DNA片段.（5）從而拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。

賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性--課件11“工欲善其事，必先利其器”DNA重組技術(shù)的基本工具限制性內(nèi)切酶——基因的剪刀DNA連接酶——基因的針線運(yùn)載體——基因的運(yùn)輸工具“工欲善其事，必先利其器”限制性內(nèi)切酶——基因的剪刀121.限制性內(nèi)切酶(RestrictionEndonuclease)概念l

存在于任何一種原核細(xì)菌中.l

識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并在合適的反應(yīng)條件下，使位點(diǎn)上催化雙鏈DNA分子的磷酸二酯鍵斷裂,切割產(chǎn)生5’-P、3’-OH分子,切割成兩種末端：平端和粘端l各種生物呈現(xiàn)特征性的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜.——識(shí)別特定序列l(wèi)

在生物分類,基因定位,基因重組,疾病診斷,刑事偵察領(lǐng)域極為重要1.限制性內(nèi)切酶(RestrictionEndonucle13HamiltonSmith,DanielNathans(USA)andWernerArber(Switzerland)－－1978Nobelprize

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics"HamiltonSmith,DanielNathans14限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：(宿主細(xì)胞的限制和修飾作用)

限制：細(xì)菌的自我保護(hù)系統(tǒng)病毒的侵染修飾：修飾系統(tǒng)－防止自殺（1）兩種不同來(lái)源的入-噬菌體入K，入B；（2）能高頻感染各自大腸桿菌宿主細(xì)胞K株，B株（3）當(dāng)它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時(shí)，感染下降數(shù)千倍。（4）一但入K噬菌體在B株成功，由B株繁殖出入K后代，能感染B株,不能感染原來(lái)K株.

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：(宿主細(xì)胞的限制和修飾作用)（1）兩種15限制性內(nèi)切酶對(duì)抗外來(lái)DNA細(xì)菌細(xì)胞病毒病毒DNA限制性內(nèi)切酶病毒注入DNA分子限制性內(nèi)切酶切割入侵的DNA切割限制性內(nèi)切酶對(duì)抗外來(lái)DNA細(xì)菌細(xì)胞病毒病毒DNA限制性內(nèi)切酶16修飾酶EcoRI修飾酶加甲基修飾酶EcoRI修飾酶17賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性--課件18特點(diǎn)1）識(shí)別序列：4，5或6個(gè)堿基對(duì)EcoRI識(shí)別5’-G/AATTC-3’序列3’-CTTAA/G-5’2）180度旋轉(zhuǎn)對(duì)稱回文結(jié)構(gòu)，對(duì)稱軸在第三，四堿基之間。3）任何一個(gè)DNA分子，每9對(duì)堿基出現(xiàn)一個(gè)II類酶切口。

特點(diǎn)19限制性內(nèi)切酶及其緩沖液限制性內(nèi)切酶及其緩沖液20賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性--課件212.DNA連接酶（DNAligase）DNA雙鏈分子上相鄰3’羥基和5’磷酸基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，形成3’-5’磷酸二酯鍵，使原來(lái)斷開(kāi)的缺口重新連接起來(lái)。

DNA片斷怎么連起來(lái)？2.DNA連接酶（DNAligase）DNA雙鏈分子上相鄰223.運(yùn)載體載體的三大功能：

1）為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。2）為外源基因提供在受體細(xì)胞的的復(fù)制能力或整合力。3）為外源基因提供在受體細(xì)胞的的擴(kuò)增和表達(dá)能力。

用什么方法將目的基因送入細(xì)胞？假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣“分子運(yùn)輸車”應(yīng)該具備什么特點(diǎn)？3.運(yùn)載體載體的三大功能：1）為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的23

理想載體具備四個(gè)條件：1)具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，提高導(dǎo)入細(xì)胞的效率?！獙?duì)受體細(xì)胞無(wú)害、易分離。2)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)，使外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳?！茏晕覐?fù)制3)具有多種單一的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)，有利于外源基因的拼接插入——有切割位點(diǎn)4)具有合適的選擇標(biāo)記（報(bào)告基因），便于DNA重組分子的檢測(cè)?！羞z傳標(biāo)記基因4.36(kb)大腸桿菌源質(zhì)粒；含復(fù)制起始位點(diǎn)，能在大腸桿菌中高拷貝復(fù)制；含氨卞青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr）選擇標(biāo)記基因，對(duì)重組子進(jìn)行篩選；含多個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；克隆載體；理想載體具備四個(gè)條件：1)具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，提高導(dǎo)24載體有兩個(gè)抗藥性基因，插入失活一個(gè)抗藥性基因，而在另一個(gè)基因篩選標(biāo)記存活的是轉(zhuǎn)化子，在插入失活的基因篩選標(biāo)記中不存活的是轉(zhuǎn)化子。

載體有兩個(gè)抗藥性基因，插入失活一個(gè)抗藥性基因，而在另一個(gè)基因25質(zhì)粒的構(gòu)建與改造1)刪除不必要的DNA區(qū)域，縮小分子量，提高外源DNA片段裝載量。2)滅活某些質(zhì)粒的編碼基因。3)加入易于識(shí)別的選擇標(biāo)記基因。4）選擇標(biāo)記基因內(nèi)引入內(nèi)切酶的識(shí)別及酶切位點(diǎn)的序列——多克隆接頭(Polylinker)。5)加入特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件。質(zhì)粒的構(gòu)建與改造26實(shí)驗(yàn)：模擬重組DNA實(shí)驗(yàn)：模擬重組DNA27入-雙鏈?zhǔn)删w

由頭部外殼蛋白和48.5kb雙鏈DNA組成，入-DNA兩端各有一個(gè)12堿基組成互補(bǔ)單鏈,稱cos末端，cos末端將DNA引入頭部，噬菌體的頭部空殼蛋白對(duì)入–DNA的包裝與其序列無(wú)關(guān),只識(shí)別COS位點(diǎn)。固體平板培養(yǎng)基出現(xiàn)透明斑點(diǎn)（噬菌斑）.液體培養(yǎng)液由混濁變澄清，說(shuō)明大腸桿菌完全被裂解。噬菌斑是經(jīng)過(guò)若干裂解周期形成宿主菌死亡區(qū)域。

入-雙鏈?zhǔn)删w由頭部外殼蛋白和48.5kb雙28提取目的基因目的基因與運(yùn)載體結(jié)合將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)和表達(dá)基因工程的基本操作程序提取目的基因基因工程的基本操作程序29基因工程的基本過(guò)程1)切用限制性內(nèi)切酶切開(kāi)外源基因和載體分子。2）接用連接酶將外源基因連接到載體分子上。3）轉(zhuǎn)借助細(xì)胞轉(zhuǎn)化將DNA重組分子導(dǎo)入細(xì)胞。4）增培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，擴(kuò)增DNA重組分子。5）檢篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞及目的基因。

基因工程的基本過(guò)程30鳥(niǎo)槍法(Shotgun)將某種生物體的全基因組或單一染色體切成大小適宜的片段，分別連接到載體上，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，形成一套重組克隆，篩選出含有目的基因期望重組子。鳥(niǎo)槍法局限性：如同盲人打鳥(niǎo)而得名，工作量很大，克隆含有目的基因的片段。90%真核生物中目的基因中含有內(nèi)含子，真核生物中目的基因不能在原核細(xì)菌中表達(dá)。

（1）目的基因組DNA片段的制備。如：機(jī)械切割，用超聲波處理，采用合適強(qiáng)度和時(shí)間。切割的DNA片段控制一定大小范圍內(nèi)，上限是載體最大裝載量，下限應(yīng)大于目的基因長(zhǎng)度。（2）外源DNA片段的全克隆。選質(zhì)粒或DNA作為載體。受體細(xì)胞選大腸桿菌。（3）期望重組子的篩選。菌落，菌斑原位雜交法，外源基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法。（4）目的基因的定位。在已知克隆的DNA片段上準(zhǔn)確定位目的基因后，進(jìn)行序列測(cè)定。提取目的基因鳥(niǎo)槍法(Shotgun)提取目的基因31賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性--課件32cDNA法：cDNA文庫(kù)（cDNABank）cDNA是與mRNA互補(bǔ)的DNA(ComplementaryDNA)，將供體生物細(xì)胞的mRNA分離出來(lái)，利用逆轉(zhuǎn)錄酶在體外合成cDNA，克隆在受體細(xì)胞內(nèi)，篩選獲得含有目的基因編碼序列的重組克隆。優(yōu)點(diǎn)：（1）能選擇性克隆蛋白編碼基因，由mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA對(duì)特的基因而言只有一種可能性。（2）cDNA法克隆基因相當(dāng)“純凈”，不含5’端調(diào)控區(qū)，剔除內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，有利于原核細(xì)胞的表達(dá)。（3）比相應(yīng)的基因組拷貝要小數(shù)十倍，2-3Kb或更小，便于穩(wěn)定地克隆在表達(dá)型質(zhì)粒上。

cDNA法：cDNA文庫(kù)（cDNABank）33發(fā)明PCR，公司獎(jiǎng)勵(lì)10,000美元獎(jiǎng)金專利賣給Hoffmann-LaRoche公司賣了3億美元Mullis得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)發(fā)明PCR，公司獎(jiǎng)勵(lì)10,000美元獎(jiǎng)金34利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR擴(kuò)增上億個(gè)拷貝（幾個(gè)小時(shí)），而癌癥細(xì)胞以高復(fù)制能力而著稱，完成同樣的多制工作一個(gè)癌癥細(xì)胞需要整整一個(gè)月。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR擴(kuò)增上億個(gè)拷貝（幾個(gè)小時(shí)），35化學(xué)合成法：前提a.如果目的基因的全序列是已知的，用化學(xué)合成法直接合成。b.DNA自動(dòng)合成儀可合成不超過(guò)50個(gè)堿基寡聚核苷酸單鏈。c.用于核酸雜交的探針，分子克隆的人工接頭，PCR擴(kuò)增的引物。d.由單鏈寡聚核苷酸通過(guò)退火直接裝備雙鏈DNA片段或基因?；瘜W(xué)合成法：前提36基因文庫(kù)，理論上它含有某一生物染色體的所有DNA片段，包括基因編碼區(qū)和間隔區(qū)DNA。由鳥(niǎo)槍法和cDNA法構(gòu)建。鳥(niǎo)槍法構(gòu)建的為基因組文庫(kù)(GenomicBank)。cDNA文庫(kù),含有生物體的全套蛋白質(zhì)編碼序列,不含DNA調(diào)控序列從cDNA文庫(kù)篩選蛋白質(zhì)編碼基因，比從基因文庫(kù)篩選要簡(jiǎn)捷?；蛭膸?kù)，理論上它含有某一生物染色體的所有DNA片段，包括基37目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合——表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因啟動(dòng)子和終止子標(biāo)記基因核糖體結(jié)合位點(diǎn)的強(qiáng)弱克隆基因的拷貝數(shù)所表達(dá)的蛋白質(zhì)的最終細(xì)胞定位翻譯的效率所表達(dá)的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性目的是使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，遺傳到下一代，同時(shí)使目的基因表達(dá)發(fā)揮作用。目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合——表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因目的是使目的38什么是強(qiáng)啟動(dòng)子？與RNA聚合酶結(jié)合能力強(qiáng),因此，其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄水平高、頻繁持續(xù)強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)的弱點(diǎn)能量枯竭導(dǎo)致宿主細(xì)胞生長(zhǎng)受阻質(zhì)粒容易丟失什么是強(qiáng)啟動(dòng)子？與RNA聚合酶結(jié)合能力強(qiáng),因此，其介導(dǎo)的基因39將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞40目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞：細(xì)菌轉(zhuǎn)化五個(gè)步驟1）感受態(tài)的形成感受態(tài)細(xì)胞能分泌一種小分子量的激活蛋白，感受因子，誘導(dǎo)特征性蛋白（細(xì)胞溶素）合成，使細(xì)胞壁部分溶解,暴露膜上DNA結(jié)合的蛋白。2）轉(zhuǎn)化因子結(jié)合受體菌膜上的結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)化因子的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)特異結(jié)合。單鏈DNA,RNA,DNA-RNA雜合雙鏈都不能結(jié)合在膜上。3）轉(zhuǎn)化因子吸收雙鏈DNA結(jié)構(gòu)與蛋白特異結(jié)合后，激活核酸酶，一條鏈被降解，另一條被吸受到受體菌中。4）整合復(fù)合物前體形成整合復(fù)合物前體：進(jìn)入受體細(xì)胞單鏈DNA與蛋白特異結(jié)合。保護(hù)單鏈DNA不被酶降解。5）轉(zhuǎn)化因子單鏈DNA整合單鏈DNA通過(guò)同源重組，置換受體染色體同源區(qū)域，形成異源雜合雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞：細(xì)菌轉(zhuǎn)化五個(gè)步驟41將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞土壤農(nóng)桿菌法基因槍法花粉管通道法1987年，周光宇中國(guó)的轉(zhuǎn)基因棉花原理不明將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞土壤農(nóng)桿菌法1987年，周光宇中國(guó)的轉(zhuǎn)42土壤農(nóng)桿菌法冠癭病土壤農(nóng)桿菌法冠癭病43侵染雙子葉植物侵染雙子葉植物44賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性--課件45基因槍法打一槍即可10000個(gè)整合細(xì)胞/槍火藥、氣壓等300-600米/秒DNA隨機(jī)插入，原理不明基因槍法打一槍即可10000個(gè)整合細(xì)胞/槍46目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞如：顯微注射法DNA損失少無(wú)需選擇標(biāo)記基因整合效率高目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞如：顯微注射法DNA損失少47目的基因的檢測(cè)和表達(dá)基因克隆→用于在選定的host中表達(dá)但是克隆的基因不一定能表達(dá)克隆載體不一定是好的表達(dá)載體目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何去察覺(jué)？目的基因的檢測(cè)和表達(dá)基因克隆→用于在選定的host中表達(dá)目的481。抗藥性篩選法

2.營(yíng)養(yǎng)缺陷性篩選法載體分子攜帶營(yíng)養(yǎng)成分（氨基酸，核苷酸）的生物合成基因，受體細(xì)胞基因突變，不能合成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。兩者構(gòu)成營(yíng)養(yǎng)缺陷。在缺少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基上受體細(xì)胞不存活，存活的是轉(zhuǎn)化子。3.顯色模型篩選法LacZ,?-半乳糖苷酶基因，用于篩選重組子。4.植物細(xì)胞中的報(bào)告基因：顏色、發(fā)光、抗生素、除草劑等1。抗藥性篩選法49第三節(jié)

基因工程簡(jiǎn)介知識(shí)目標(biāo)：1．

簡(jiǎn)述基因工程的概念2．

簡(jiǎn)述基因操作的三種基本工具的作用3．

簡(jiǎn)述基因工程的原理和基本操作程序4．

舉例說(shuō)出基因工程所取得的成果和發(fā)展前景第三節(jié)

基因工程簡(jiǎn)介知識(shí)目標(biāo)：50基因工程的基本內(nèi)容基因操作的工具基因操作的基本步驟基因工程的成果與發(fā)展前景基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生基因工程與農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)基因工程與環(huán)境保護(hù)基因工程的基本內(nèi)容51精品資料精品資料52你怎么稱呼老師？如果老師最后沒(méi)有總結(jié)一節(jié)課的重點(diǎn)的難點(diǎn)，你是否會(huì)認(rèn)為老師的教學(xué)方法需要改進(jìn)？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽(yáng)曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒(méi)有學(xué)問(wèn)無(wú)顏見(jiàn)爹娘……”“太陽(yáng)當(dāng)空照，花兒對(duì)我笑，小鳥(niǎo)說(shuō)早早早……”賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性--課件53新課標(biāo)：普通高中課程標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)教科書(shū)科技探索之路基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具1.2基因工程的基本操作程序

拓展視野歷史不能忘記中國(guó)科學(xué)家對(duì)PCR的貢獻(xiàn)1.3基因工程的應(yīng)用

拓展視野神奇的基因芯片1.4蛋白質(zhì)工程的崛起選修3現(xiàn)代生物科技專題專題1基因工程新課標(biāo)：普通高中課程標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)教科書(shū)科技探索之路基礎(chǔ)理論54基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程

基因工程理論上三大突破：

（1）DNA是遺傳物質(zhì)——

1943美Avery肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)等。（2）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)——1953美Watson英CrickDNA雙螺旋模型；1958M.Meselson&F.Stahl用實(shí)驗(yàn)證明了半保留復(fù)制，不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。（3）64個(gè)密碼子破譯和中心法則的確立——

1958WatsonandCrick提出中心法則，闡明了遺傳信息的流動(dòng)方向，多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。

密碼形式——使遺傳學(xué)在分子水平上得到解釋，密碼子是通用的基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程55（3）蛋白組分析蛋白質(zhì)合成后，還要進(jìn)行磷酸化、糖基化、除去末端氨基酸、蛋白質(zhì)剪切等翻譯后修飾，僅從核酸的序列并不能完全描述一個(gè)蛋白質(zhì)。盡管分析不同細(xì)胞類型中表達(dá)的蛋白已近20年，直到1995年才由Wilkins和Williams提出一個(gè)與基因組相對(duì)應(yīng)的名詞蛋白組分析的核心技術(shù)是蛋白質(zhì)雙向電泳。

技術(shù)上三大發(fā)明：（1）基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)——1967，T.F.Roth&D.R.Helinski，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的自我復(fù)制能力，并能夠在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移?；蚴强梢赞D(zhuǎn)移的。（2）工具酶的發(fā)明——1972H.C.Smith、W.Arber&D.Nathans從流感嗜血桿菌中分離得到限制性內(nèi)切酶；1970年，逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)使真核細(xì)胞的基因制備成為可能；此后，多種限制酶和連接酶發(fā)現(xiàn)?；蚴强汕懈畹?。（3）DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)——1972年，美Berg第一次構(gòu)建出了體外重組DNA分子。重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功——1973，H.Boyer&S.Cohen選用僅含單一EcoRI酶切位點(diǎn)的載體質(zhì)粒pSC101，使之與非洲爪蟾核糖體蛋白基因的DNA片段重組。重組的DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌DNA中，轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA?；蚬こ陶Q生元年（3）蛋白組分析技術(shù)上三大發(fā)明：56H.Boyer&S.CohenH.Boyer&S.Cohen57技術(shù)進(jìn)一步推動(dòng)基因工程的發(fā)展：（1）第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物問(wèn)世——1980科學(xué)家通過(guò)顯微注射培育出世界第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠。1983，科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。（2）PCR技術(shù)的發(fā)明——1988年，美K.Mullis發(fā)明PCR技術(shù)，使基因工程進(jìn)一步發(fā)展。TheNobelPrizeinChemistry1993"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"KaryB.Mullis

LaJolla,CA,USA技術(shù)進(jìn)一步推動(dòng)基因工程的發(fā)展：TheNobelPrize58

4．基因工程的發(fā)展歷史1）1972年美國(guó)Berg,Jackson等人將基因工程的發(fā)展歷史

1）1972年美國(guó)Berg,Jackson等人將猿猴病基因組SV40DNA,噬菌體基因，大腸桿菌半乳糖操縱子，體外重組獲得成功。2）1973年美國(guó)斯坦福大學(xué)Cohen,Boyer等，在體外構(gòu)建含有四環(huán)素，鏈霉素兩個(gè)抗性基因的重組質(zhì)粒分子,導(dǎo)入大腸桿菌后穩(wěn)定復(fù)制，賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性。------（宣告基因工程誕生）3）1978年美國(guó)Genentech公司利用重組大腸桿菌合成人胰島素的先進(jìn)生產(chǎn)工藝----（揭開(kāi)基因工程產(chǎn)業(yè)化的序幕）4）1983年，攜帶有細(xì)菌新霉素抗性基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞獲得成功-------（高等植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)問(wèn)世）5）1990年，美國(guó)科學(xué)家對(duì)一名因腺苷脫氨酶基因缺陷患有重度聯(lián)合免疫缺陷癥的兒童進(jìn)行基因治療獲得成功。-------（分子醫(yī)學(xué)新紀(jì)元）6）1991年，美國(guó)倡導(dǎo)在全球?qū)嵤┤祟惢蚪M計(jì)劃，用15年時(shí)間斥資30億美元，完成12萬(wàn)5000個(gè)人類基因的全部測(cè)序工作。7）1997年，英國(guó)科學(xué)家利用體細(xì)胞克隆技術(shù)復(fù)制出“多利”綿羊。-------（人類可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)制自身的嘗試）2005年，鄧宏魁，丁明孝教授克隆小白鼠在中國(guó)屬首例。4．基因工程的發(fā)展歷史基因工程59

遺傳工程（基因工程）研究的意義（1）說(shuō)明兩種能力A.基因工程，它超越生物種屬界限,具有跨越天然物種屏障的能力.B.把來(lái)自任何一種生物的基因，放置在與其毫無(wú)親緣關(guān)系的新的寄主生物細(xì)胞中的能力。（2）表明一種創(chuàng)造性應(yīng)用這一技術(shù)，有可能按照人們的主觀愿望，創(chuàng)造出自然界中原先并不存在的新的生物類型。（3）簡(jiǎn)化生物物種進(jìn)化程序，加快生物物種進(jìn)化速度.（4）強(qiáng)調(diào)了一種事實(shí)：確定的DNA小片段在新寄主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增的事實(shí)—可以制備到大量純化的DNA片段.（5）從而拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。

賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性--課件60“工欲善其事，必先利其器”DNA重組技術(shù)的基本工具限制性內(nèi)切酶——基因的剪刀DNA連接酶——基因的針線運(yùn)載體——基因的運(yùn)輸工具“工欲善其事，必先利其器”限制性內(nèi)切酶——基因的剪刀611.限制性內(nèi)切酶(RestrictionEndonuclease)概念l

存在于任何一種原核細(xì)菌中.l

識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并在合適的反應(yīng)條件下，使位點(diǎn)上催化雙鏈DNA分子的磷酸二酯鍵斷裂,切割產(chǎn)生5’-P、3’-OH分子,切割成兩種末端：平端和粘端l各種生物呈現(xiàn)特征性的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜.——識(shí)別特定序列l(wèi)

在生物分類,基因定位,基因重組,疾病診斷,刑事偵察領(lǐng)域極為重要1.限制性內(nèi)切酶(RestrictionEndonucle62HamiltonSmith,DanielNathans(USA)andWernerArber(Switzerland)－－1978Nobelprize

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics"HamiltonSmith,DanielNathans63限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：(宿主細(xì)胞的限制和修飾作用)

限制：細(xì)菌的自我保護(hù)系統(tǒng)病毒的侵染修飾：修飾系統(tǒng)－防止自殺（1）兩種不同來(lái)源的入-噬菌體入K，入B；（2）能高頻感染各自大腸桿菌宿主細(xì)胞K株，B株（3）當(dāng)它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時(shí)，感染下降數(shù)千倍。（4）一但入K噬菌體在B株成功，由B株繁殖出入K后代，能感染B株,不能感染原來(lái)K株.

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：(宿主細(xì)胞的限制和修飾作用)（1）兩種64限制性內(nèi)切酶對(duì)抗外來(lái)DNA細(xì)菌細(xì)胞病毒病毒DNA限制性內(nèi)切酶病毒注入DNA分子限制性內(nèi)切酶切割入侵的DNA切割限制性內(nèi)切酶對(duì)抗外來(lái)DNA細(xì)菌細(xì)胞病毒病毒DNA限制性內(nèi)切酶65修飾酶EcoRI修飾酶加甲基修飾酶EcoRI修飾酶66賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性--課件67特點(diǎn)1）識(shí)別序列：4，5或6個(gè)堿基對(duì)EcoRI識(shí)別5’-G/AATTC-3’序列3’-CTTAA/G-5’2）180度旋轉(zhuǎn)對(duì)稱回文結(jié)構(gòu)，對(duì)稱軸在第三，四堿基之間。3）任何一個(gè)DNA分子，每9對(duì)堿基出現(xiàn)一個(gè)II類酶切口。

特點(diǎn)68限制性內(nèi)切酶及其緩沖液限制性內(nèi)切酶及其緩沖液69賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性--課件702.DNA連接酶（DNAligase）DNA雙鏈分子上相鄰3’羥基和5’磷酸基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，形成3’-5’磷酸二酯鍵，使原來(lái)斷開(kāi)的缺口重新連接起來(lái)。

DNA片斷怎么連起來(lái)？2.DNA連接酶（DNAligase）DNA雙鏈分子上相鄰713.運(yùn)載體載體的三大功能：

1）為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。2）為外源基因提供在受體細(xì)胞的的復(fù)制能力或整合力。3）為外源基因提供在受體細(xì)胞的的擴(kuò)增和表達(dá)能力。

用什么方法將目的基因送入細(xì)胞？假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣“分子運(yùn)輸車”應(yīng)該具備什么特點(diǎn)？3.運(yùn)載體載體的三大功能：1）為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的72

理想載體具備四個(gè)條件：1)具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，提高導(dǎo)入細(xì)胞的效率?！獙?duì)受體細(xì)胞無(wú)害、易分離。2)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)，使外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳?！茏晕覐?fù)制3)具有多種單一的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)，有利于外源基因的拼接插入——有切割位點(diǎn)4)具有合適的選擇標(biāo)記（報(bào)告基因），便于DNA重組分子的檢測(cè)?！羞z傳標(biāo)記基因4.36(kb)大腸桿菌源質(zhì)粒；含復(fù)制起始位點(diǎn)，能在大腸桿菌中高拷貝復(fù)制；含氨卞青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr）選擇標(biāo)記基因，對(duì)重組子進(jìn)行篩選；含多個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；克隆載體；理想載體具備四個(gè)條件：1)具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，提高導(dǎo)73載體有兩個(gè)抗藥性基因，插入失活一個(gè)抗藥性基因，而在另一個(gè)基因篩選標(biāo)記存活的是轉(zhuǎn)化子，在插入失活的基因篩選標(biāo)記中不存活的是轉(zhuǎn)化子。

載體有兩個(gè)抗藥性基因，插入失活一個(gè)抗藥性基因，而在另一個(gè)基因74質(zhì)粒的構(gòu)建與改造1)刪除不必要的DNA區(qū)域，縮小分子量，提高外源DNA片段裝載量。2)滅活某些質(zhì)粒的編碼基因。3)加入易于識(shí)別的選擇標(biāo)記基因。4）選擇標(biāo)記基因內(nèi)引入內(nèi)切酶的識(shí)別及酶切位點(diǎn)的序列——多克隆接頭(Polylinker)。5)加入特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件。質(zhì)粒的構(gòu)建與改造75實(shí)驗(yàn)：模擬重組DNA實(shí)驗(yàn)：模擬重組DNA76入-雙鏈?zhǔn)删w

由頭部外殼蛋白和48.5kb雙鏈DNA組成，入-DNA兩端各有一個(gè)12堿基組成互補(bǔ)單鏈,稱cos末端，cos末端將DNA引入頭部，噬菌體的頭部空殼蛋白對(duì)入–DNA的包裝與其序列無(wú)關(guān),只識(shí)別COS位點(diǎn)。固體平板培養(yǎng)基出現(xiàn)透明斑點(diǎn)（噬菌斑）.液體培養(yǎng)液由混濁變澄清，說(shuō)明大腸桿菌完全被裂解。噬菌斑是經(jīng)過(guò)若干裂解周期形成宿主菌死亡區(qū)域。

入-雙鏈?zhǔn)删w由頭部外殼蛋白和48.5kb雙77提取目的基因目的基因與運(yùn)載體結(jié)合將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)和表達(dá)基因工程的基本操作程序提取目的基因基因工程的基本操作程序78基因工程的基本過(guò)程1)切用限制性內(nèi)切酶切開(kāi)外源基因和載體分子。2）接用連接酶將外源基因連接到載體分子上。3）轉(zhuǎn)借助細(xì)胞轉(zhuǎn)化將DNA重組分子導(dǎo)入細(xì)胞。4）增培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，擴(kuò)增DNA重組分子。5）檢篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞及目的基因。

基因工程的基本過(guò)程79鳥(niǎo)槍法(Shotgun)將某種生物體的全基因組或單一染色體切成大小適宜的片段，分別連接到載體上，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，形成一套重組克隆，篩選出含有目的基因期望重組子。鳥(niǎo)槍法局限性：如同盲人打鳥(niǎo)而得名，工作量很大，克隆含有目的基因的片段。90%真核生物中目的基因中含有內(nèi)含子，真核生物中目的基因不能在原核細(xì)菌中表達(dá)。

（1）目的基因組DNA片段的制備。如：機(jī)械切割，用超聲波處理，采用合適強(qiáng)度和時(shí)間。切割的DNA片段控制一定大小范圍內(nèi)，上限是載體最大裝載量，下限應(yīng)大于目的基因長(zhǎng)度。（2）外源DNA片段的全克隆。選質(zhì)?；駾NA作為載體。受體細(xì)胞選大腸桿菌。（3）期望重組子的篩選。菌落，菌斑原位雜交法，外源基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法。（4）目的基因的定位。在已知克隆的DNA片段上準(zhǔn)確定位目的基因后，進(jìn)行序列測(cè)定。提取目的基因鳥(niǎo)槍法(Shotgun)提取目的基因80賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性--課件81cDNA法：cDNA文庫(kù)（cDNABank）cDNA是與mRNA互補(bǔ)的DNA(ComplementaryDNA)，將供體生物細(xì)胞的mRNA分離出來(lái)，利用逆轉(zhuǎn)錄酶在體外合成cDNA，克隆在受體細(xì)胞內(nèi)，篩選獲得含有目的基因編碼序列的重組克隆。優(yōu)點(diǎn)：（1）能選擇性克隆蛋白編碼基因，由mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA對(duì)特的基因而言只有一種可能性。（2）cDNA法克隆基因相當(dāng)“純凈”，不含5’端調(diào)控區(qū)，剔除內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，有利于原核細(xì)胞的表達(dá)。（3）比相應(yīng)的基因組拷貝要小數(shù)十倍，2-3Kb或更小，便于穩(wěn)定地克隆在表達(dá)型質(zhì)粒上。

cDNA法：cDNA文庫(kù)（cDNABank）82發(fā)明PCR，公司獎(jiǎng)勵(lì)10,000美元獎(jiǎng)金專利賣給Hoffmann-LaRoche公司賣了3億美元Mullis得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)發(fā)明PCR，公司獎(jiǎng)勵(lì)10,000美元獎(jiǎng)金83利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR擴(kuò)增上億個(gè)拷貝（幾個(gè)小時(shí)），而癌癥細(xì)胞以高復(fù)制能力而著稱，完成同樣的多制工作一個(gè)癌癥細(xì)胞需要整整一個(gè)月。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR