基因功能分析基本策略課件

第十二章基因功能分析的基本策略第十二章基因功能分析的基本策略1轉基因模型是研究基因功能的主要手段轉基因生物：外源基因導入生物體表達?；虼虬校和庠椿蛱鎿Q內源基因?；蚯贸?。基因敲入?；虺聊簩胩囟ɑ?，抑制內源性基因表達。轉基因模型是研究基因功能的主要手段轉基因生物：2第一節(jié)轉基因技術轉基因技術(transgenictechnology)：將外源基因導入細胞，隨機整合到受體基因組內，并隨細胞分裂而遺傳給后代。細胞模型。轉基因動物。轉基因植物。第一節(jié)轉基因技術轉基因技術(transgenictech3一.轉基因生物的意義20世紀80年代(BrinsterandPalmiter)：著名的轉基因小鼠實驗，金屬硫蛋白基因啟動子驅動大鼠生長激素基因表達。轉基因生物的用途：研究手段：疾病的轉基因動物模型。改良動物性狀：抗病性、耐寒性等。生產(chǎn)產(chǎn)品：抗體、疫苗等的生產(chǎn)。一.轉基因生物的意義20世紀80年代(Brinste4基因功能分析基本策略課件5二、基本原理構建攜帶目的基因的載體。外源基因導入：將目的基因通過顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵或著床前的胚胎細胞中。使目的基因整合到基因組中。將此受精卵或著床前的胚胎細胞再植入受體動物的輸卵管或子宮中。使其發(fā)育成攜帶外源基因的轉基因動物。二、基本原理構建攜帶目的基因的載體。6基本原理供體基因受體的受精卵基本原理供體基因受體的受精卵7基本原理轉基因的受精卵基本原理轉基因的受精卵8基本原理轉基因動物基本原理轉基因動物9基本過程上游—基因改造和載體構建中游—基因轉移、胚胎移植與建系下游—基因整合、表達的檢測與細胞篩選基本過程上游—基因改造和載體構建101.上游—基因改造和載體構建外源基因:完整的轉錄單位,由順式作用元件、結構基因和轉錄終止信號組成。報告基因(reportergene):在表達載體中引入易于檢測的提示重組體存在的基因。GFP、LacZ、AP、LUC。融合基因(fusiongene):將特定的目的基因與報告基因拼接成融合基因，并與順式作用元件拼接成完整的轉錄單位。1.上游—基因改造和載體構建外源基因:完整的轉錄單位,11動物轉基因常用的載體腺病毒載體逆轉錄病毒載體非病毒類載體：如質粒等。動物轉基因常用的載體腺病毒載體122.中游—基因轉移、胚胎移植與建系基因導入技術：物理、化學和生物學方法1)顯微注射法（microinjection)2)胚胎干細胞法（embryonicstemcells,ES細胞）3)逆轉錄病毒感染法4)精子載體法2.中游—基因轉移、胚胎移植與建系基因導入技術：物理、化131)DNA顯微注射法制備超量受精卵。DNA顯微注射。轉移注射卵到輸卵管或子宮。轉基因鼠的鑒定及鼠系建立。1)DNA顯微注射法制備超量受精卵。14DNA顯微注射持卵管DNA注射針精原核卵原核DNA顯微注射持卵管DNA注射針精原核卵原核15基因功能分析基本策略課件16DNA顯微注射DNA顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精原核。顯微鏡下觀察，精原核比卵原核大，容易辨別。線性DNA整合效率比超螺旋DNA高出數(shù)倍，因而用于顯微注射的轉入基因通常是去除載體序列的線狀DNA。DNA顯微注射DNA顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精17DNA顯微注射法的特點DNA大小無限制，最大可達250Kb。隨機整合：在染色體上整合的位點是隨機的，整合的拷貝數(shù)也不一定。轉入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干擾該基因的正常表達，影響轉基因動物的正常發(fā)育和代謝?？傂瘦^低(實際成功率1/1000)。DNA顯微注射法的特點DNA大小無限制，最大可達25018提高顯微注射DNA表達的成功率轉入的外源基因要能夠高效表達，最好是可以誘導表達。轉入基因中應該包含有幫助提高整合效率的序列，如微衛(wèi)星序列。微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列誘導表達啟動子外源基因提高顯微注射DNA表達的成功率轉入的外源基因要能夠高效表19基因功能分析基本策略課件202)胚胎干細胞法胚胎干細胞(embryostemcells,ES細胞)：可人工培養(yǎng)增殖的小鼠胚泡發(fā)育期胚胎細胞，當把這種胚胎細胞重新導入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持著分化成其他類型細胞的能力。ES細胞具有與胚胎細胞相似的形態(tài)特征和分化特性。2)胚胎干細胞法胚胎干細胞(embryostemcel21胚胎干細胞法分離和培養(yǎng)ES細胞。外源基因導入ES細胞。導入外源基因的ES細胞的子宮轉移。轉基因鼠的鑒定及鼠系建立。胚胎干細胞法分離和培養(yǎng)ES細胞。22胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中分離胚泡內層細胞胰蛋白酶消化解離加飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)胚胎干細胞胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中分離胚泡內層細胞胰蛋白酶消23胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)24胚胎干細胞外源DNA的導入DNA胚胎干細胞囊胚原囊胚轉基因動物磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉錄病毒感染法電穿孔法微注射胚胎干細胞外源DNA的導入DNA磷酸鈣-DNA共沉淀法25外源DNA的整合用于ES細胞的DNA載體一般帶有定點整合元件,避免了隨機整合。定點整合位點應選擇在基因組內編碼非必需產(chǎn)物的地方，以減少整合對細胞正常功能的影響。定點整合位點必須在基因組的可以進行轉錄的地方。外源DNA的整合用于ES細胞的DNA載體一般帶有26胚胎干細胞法的特點定點整合。ES細胞在體外培養(yǎng)，外源DNA導入后可用正-負選擇法篩選擇正確整合的ES細胞,相對較簡單。目前只在小鼠身上獲得成功。胚胎干細胞法的特點定點整合。27基因功能分析基本策略課件283）逆轉錄病毒感染法逆轉錄病毒載體的構建獲得四/八細胞胚胎/囊胚/原腸胚外源DNA導入早期胚胎：獲得病毒顆粒感染早期胚胎包裝細胞與早期胚胎共培養(yǎng)感染后的胚胎植入受體動物子宮，發(fā)育成攜帶外源基因的動物。3）逆轉錄病毒感染法逆轉錄病毒載體的構建29逆轉錄病毒感染法外源基因逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒感染四/八細胞胚胎/囊胚/原腸胚嵌合小鼠純合體小鼠逆轉錄病毒感染法外源基因逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒感染四/八細30逆轉錄病毒感染法的特點通過病毒DNA插入宿主DNA的機制，將外源目的基因整合到宿主基因組，整合效率高。反轉錄病毒載體容量有限，只能轉移小片段DNA(＜10kb)。對家禽類的轉基因研究有重要意義。逆轉錄病毒感染法的特點通過病毒DNA插入宿主DNA的314）精子載體法外源DNA精子卵細胞受精卵轉基因動物共育法脂質體轉染法電穿孔法4）精子載體法外源DNA共育法32DNA精子受精卵DNA卵細胞DNA胚胎干細胞DNA逆轉錄病毒感染磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉錄病毒感染法電穿孔法四細胞胚胎囊胚原腸胚轉基因動物微注射顯微注射DNA精子受精卵DNA卵細胞DNA胚胎干細胞DNA逆轉錄病毒333.下游—基因整合與表達檢測及篩選染色體基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位點和拷貝數(shù)。轉錄水平：轉基因的mRNA的存在與否以及表達水平。蛋白水平：轉基因的蛋白質的表達以及功能檢測。3.下游—基因整合與表達檢測及篩選染色體基因水平：是否整合34鑒定方法PCRSouthernblot染色體原位雜交NorthernblotRT-PCRWesternblot鑒定方法PCR35基因轉移鼠純合鼠系的建立×轉基因雜合鼠未轉基因鼠生殖系細胞中不含轉入基因生殖系細胞中含轉入基因子代多次交配可得到純合轉基因鼠系基因轉移鼠純合鼠系的建立×轉基因雜合鼠未轉基因鼠生殖系細胞中36三、轉基因動物的應用分析動物表型與外源基因的關系，揭示外源基因的功能。建立人類疾病的轉基因動物模型。基因產(chǎn)品的制備：乳腺、膀胱生物反應器。三、轉基因動物的應用分析動物表型與外源基因的關系，揭示外源基37人類疾病的轉基因動物模型完整的動物模型可以模擬人類疾病的起始和發(fā)展，幫助了解疾病的病因和發(fā)展過程。為測試各種可能的治療方案提供一個統(tǒng)一有效的系統(tǒng)。轉基因動物模型提供了人類疾病的研究手段。人類疾病的轉基因動物模型完整的動物模型可以模擬人類疾病的起始38人類疾病的轉基因動物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：老年性癡呆癥(Alzheimer’sdisease)、關節(jié)炎(arthritis)、肌肉營養(yǎng)缺乏癥(musculardistrophy)、腫瘤發(fā)生(tumorigenesis)、高血壓(hypertension)、神經(jīng)退行性疾病(neurodegenenerativedisorder)、內分泌功能障礙(endocrinological

disfunction)、動脈硬化癥及其他很多疾病。人類疾病的轉基因動物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：39利用轉基因動物反應器生產(chǎn)藥用蛋白轉基因動物反應器：乳腺、膀胱、血液生物反應器等?？鼓窱II：轉基因綿羊的乳汁中。β乳球蛋白紅細胞生成素凝血因子VIII凝血因子IX生長激素利用轉基因動物反應器生產(chǎn)藥用蛋白轉基因動物反應器：乳腺、膀胱40轉基因改良移植器官改造異種來源器官的遺傳性狀，使之適應于人體器官或組織的移植。1997年起，利用遺傳改良的轉基因豬肝做為嚴重肝病患者的離體生命支持物。轉基因改良移植器官改造異種來源器官的遺傳性狀，使之適應于人體41動物的克隆1996年，首次實現(xiàn)動物的無性生殖。由綿羊的乳腺細胞提供細胞核，卵細胞提供細胞質發(fā)育而來。核移植技術（NuclearTransfer)動物的克隆1996年，首次實現(xiàn)動物的無性生殖。42核移植技術（NuclearTransfer)核移植技術（NuclearTransfer)43基因功能分析基本策略課件44第二節(jié)基因打靶基因打靶(GeneTargeting)

：通過DNA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內研究此基因的功能?；蚯贸?geneknockout):將某個基因定向去除。基因敲入(geneknockin):定向將一段基因序列替代另一段基因序列。第二節(jié)基因打靶基因打靶(GeneTargeting)45一、基因打靶的基本程序打靶載體的構建。打靶載體導入ES細胞及其鑒定?；蚯贸鼸S細胞注射入胚泡。胚泡植入假孕小鼠的子宮。嵌合體的雜交建立基因打靶的純合鼠系。一、基因打靶的基本程序打靶載體的構建。461.打靶載體的構建同源基因片段質粒載體HB1HB2neor基因HSV-tk基因1.打靶載體的構建同源基因片段質粒載體HB1HB2neor472.打靶載體導入ES細胞磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉錄病毒感染法電穿孔法脂質體轉染法顯微注射法2.打靶載體導入ES細胞磷酸鈣-DNA共沉淀法48打靶載體的正-負選擇與整合位點兩端區(qū)域同源的兩段DNA序列(HB1和HB2)。目的基因。編碼抗G418的新霉素磷酸轉移酶基因（neor基因）。2個不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分別來自I型II型單純皰疹病毒。打靶載體的正-負選擇與整合位點兩端區(qū)域同源的兩段DNA序49打靶載體的正篩選

tk1HB1neorHB2tk2載體載體同源重組neorG418正篩選，細胞存活染色體染色體打靶載體的正篩選tk1HB1neor50打靶載體的負篩選

tk1HB1neorHB2tk2染色體染色體非特異性整合

GCV負篩選，細胞死亡打靶載體的負篩選tk1HB1neor51PCR鑒定在打靶載體的HB1和HB2之間，加上一個載體和鼠的基因組中都沒有的獨特DNA序列（US）。如發(fā)生隨機整合，PCR無法擴增出預期的DNA片段。如果整合于特定位點時，則PCR可以擴增出預期大小的片段。PCR鑒定在打靶載體的HB1和HB2之間，加上一個52PCR鑒定：特異整合tk1HB1USneorHB2tk2P2P1PCR反應有特異條帶特異整合PCR鑒定：特異整合tk1HB1USneo53基因敲除小鼠的獲得基因敲除ES細胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮嵌合體的雜交育種：同源重組只發(fā)生在一條染色體上，因而同源重組后只能得到嵌合體，將嵌合體雜交，即可得到純合子?！粱蚯贸∈蟮墨@得基因敲除ES細胞注射入胚泡×54基因功能分析基本策略課件55基因敲除和RNA干擾基因敲除是在基因水平將某個基因定點去除，動物整體水平。RNA干擾不是敲除基因，而是誘導RNA的特異性降解，干擾基因的表達。一般是在細胞水平。基因敲除和RNA干擾基因敲除是在基因水平將某個基因定點去56第三節(jié)RNA干擾1990年，Jorgense等通過轉基因改造牽牛花顏色。外源基因不但不能加深花的顏色，反而造成內源基因表達的降低。

第三節(jié)RNA干擾1990年，Jorgense等通過57RNA干擾是dsRNA導致的基因沉默1998年，F(xiàn)ire等在C.elegans中用antisenseRNA抑制基因表達。dsRNA比sense或antisenseRNA都好。注射甚至口服dsRNA都能誘發(fā)基因沉默。很少量的雙鏈RNA就能誘發(fā)C.elegans整體的基因沉默，甚至能傳遞到子一代。RNA干擾：RNAinterference(RNAi)

RNA干擾是dsRNA導致的基因沉默1998年，F(xiàn)ir58RNAi是真核生物中廣泛存在的現(xiàn)象

植物：干擾因素自葉脈向外擴散，綠色熒光蛋白(GFP)基因被抑制，顯露出紅色。

線蟲：左側為GFP轉基因線蟲；右側線蟲則經(jīng)GFPdsRNA處理。部分細胞RNAi相關蛋白表達較低，仍有綠色熒光。

Hela細胞：經(jīng)ORC6siRNA作用后，細胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象。綠色為tubulin，紅色為DNA。ORC6細胞分裂調控蛋白。

果蠅：右側果蠅為野生型，左側為shRNA

造成的色素缺乏的缺陷型。RNAi是真核生物中廣泛存在的現(xiàn)象植物：干擾因素自葉脈向59RNA干擾RNA干擾：雙鏈RNA誘導的同源mRNA降解。RNA干擾技術可以用于基因敲除，選擇性關閉特定細胞基因。RNA干擾RNA干擾：雙鏈RNA誘導的同源mRNA60siRNA的產(chǎn)生Dicer：RNaseIII的一種，可降解dsRNA成siRNA。ShortinterferingRNA(siRNA)：21~23ntsiRNA的產(chǎn)生Dicer：RNaseIII的一種，可61siRNA誘導同源序列的降解RNA-InducedSilencingComplex產(chǎn)生兩種后果：同源mRNA的降解。同源mRNA翻譯受阻。siRNA誘導同源序列的降解RNA-InducedSil62基因沉默的機制是多方面的dsRNA造成的mRNA降解。Post-translationalgenesilencingdsRNA造成同源性基因的甲基化和表達關閉。dsRNA造成染色質結構變化。dsRNA對蛋白質的合成產(chǎn)生影響?；虺聊臋C制是多方面的dsRNA造成的mRNA降解。63RNAi和基因敲除在基因組DNA上，通過同源重組進行的基因敲除。在mRNA水平進行的基因敲除：AntisenseoligonucleotidesRibozymeRNAinterference：dsRNA；siRNA；shRNARNAi和基因敲除在基因組DNA上，通過同源重組進行的64dsRNA能夠誘發(fā)細胞的抗病毒反應在哺乳動物存在干擾素相關的抗病毒體系。dsRNA激活dsRNA-dependentproteinkinase(PKR)，進一步誘導非序列依賴的內源性RNA降解。在胚胎期細胞，上述非特異的抗病毒體系尚未形成。通過dsRNA可以誘導序列特異的RNAi。dsRNA能夠誘發(fā)細胞的抗病毒反應在哺乳動物存在干擾素相關65siRNA與shRNA<30bpsiRNA可以誘導RNAi，并克服哺乳細胞的障礙。ShorthairpinRNA：

(shRNA)可達成穩(wěn)定的基因敲除。siRNA與shRNA<30bpsiRNA可以誘導66shRNA表達載體系統(tǒng)shRNA表達載體系統(tǒng)67miRNA表達載體系統(tǒng)miRNA表達載體系統(tǒng)68siRNA設計原則siRNAantisense鏈5’端穩(wěn)定性較低時具有更好的效率。必要時采用專業(yè)軟件進行設計。采用多個siRNA片段，并篩選其中最有效的。有時siRNA的干擾效果只表現(xiàn)在蛋白水平。盡可能使用較低的siRNA濃度，以保證其特異性。設立補救試驗可進一步確認RNAi與效果之間的關系。siRNA設計原則siRNAantisense鏈5’69shRNA與siRNA應用的局限在某些細胞的特定狀態(tài)下，shRNA或siRNA仍能夠誘發(fā)細胞的抗病毒反應。miRNA在與其靶基因mRNA不完全匹配的情況下仍能夠誘發(fā)RNAi。在有14bp匹配的情況下就能夠誘發(fā)干擾。siRNA可在翻譯水平發(fā)揮作用，有研究發(fā)現(xiàn)，它能夠造成大量蛋白翻譯的降低。shRNA與siRNA應用的局限在某些細胞的特定狀態(tài)下70shRNA與siRNA的比較siRNA應用非常方便，干擾效力往往比較高。只能進行達成瞬時的基因表達抑制。

在線蟲和植物，siRNA可擴增，但哺乳細胞不能。shRNA前期工作比較復雜?？梢赃M行穩(wěn)定的基因表達抑制。shRNA與siRNA的比較siRNA71第十二章基因功能分析的基本策略第十二章基因功能分析的基本策略72轉基因模型是研究基因功能的主要手段轉基因生物：外源基因導入生物體表達?；虼虬校和庠椿蛱鎿Q內源基因?；蚯贸??；蚯萌??；虺聊簩胩囟ɑ?，抑制內源性基因表達。轉基因模型是研究基因功能的主要手段轉基因生物：73第一節(jié)轉基因技術轉基因技術(transgenictechnology)：將外源基因導入細胞，隨機整合到受體基因組內，并隨細胞分裂而遺傳給后代。細胞模型。轉基因動物。轉基因植物。第一節(jié)轉基因技術轉基因技術(transgenictech74一.轉基因生物的意義20世紀80年代(BrinsterandPalmiter)：著名的轉基因小鼠實驗，金屬硫蛋白基因啟動子驅動大鼠生長激素基因表達。轉基因生物的用途：研究手段：疾病的轉基因動物模型。改良動物性狀：抗病性、耐寒性等。生產(chǎn)產(chǎn)品：抗體、疫苗等的生產(chǎn)。一.轉基因生物的意義20世紀80年代(Brinste75基因功能分析基本策略課件76二、基本原理構建攜帶目的基因的載體。外源基因導入：將目的基因通過顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵或著床前的胚胎細胞中。使目的基因整合到基因組中。將此受精卵或著床前的胚胎細胞再植入受體動物的輸卵管或子宮中。使其發(fā)育成攜帶外源基因的轉基因動物。二、基本原理構建攜帶目的基因的載體。77基本原理供體基因受體的受精卵基本原理供體基因受體的受精卵78基本原理轉基因的受精卵基本原理轉基因的受精卵79基本原理轉基因動物基本原理轉基因動物80基本過程上游—基因改造和載體構建中游—基因轉移、胚胎移植與建系下游—基因整合、表達的檢測與細胞篩選基本過程上游—基因改造和載體構建811.上游—基因改造和載體構建外源基因:完整的轉錄單位,由順式作用元件、結構基因和轉錄終止信號組成。報告基因(reportergene):在表達載體中引入易于檢測的提示重組體存在的基因。GFP、LacZ、AP、LUC。融合基因(fusiongene):將特定的目的基因與報告基因拼接成融合基因，并與順式作用元件拼接成完整的轉錄單位。1.上游—基因改造和載體構建外源基因:完整的轉錄單位,82動物轉基因常用的載體腺病毒載體逆轉錄病毒載體非病毒類載體：如質粒等。動物轉基因常用的載體腺病毒載體832.中游—基因轉移、胚胎移植與建系基因導入技術：物理、化學和生物學方法1)顯微注射法（microinjection)2)胚胎干細胞法（embryonicstemcells,ES細胞）3)逆轉錄病毒感染法4)精子載體法2.中游—基因轉移、胚胎移植與建系基因導入技術：物理、化841)DNA顯微注射法制備超量受精卵。DNA顯微注射。轉移注射卵到輸卵管或子宮。轉基因鼠的鑒定及鼠系建立。1)DNA顯微注射法制備超量受精卵。85DNA顯微注射持卵管DNA注射針精原核卵原核DNA顯微注射持卵管DNA注射針精原核卵原核86基因功能分析基本策略課件87DNA顯微注射DNA顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精原核。顯微鏡下觀察，精原核比卵原核大，容易辨別。線性DNA整合效率比超螺旋DNA高出數(shù)倍，因而用于顯微注射的轉入基因通常是去除載體序列的線狀DNA。DNA顯微注射DNA顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精88DNA顯微注射法的特點DNA大小無限制，最大可達250Kb。隨機整合：在染色體上整合的位點是隨機的，整合的拷貝數(shù)也不一定。轉入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干擾該基因的正常表達，影響轉基因動物的正常發(fā)育和代謝?？傂瘦^低(實際成功率1/1000)。DNA顯微注射法的特點DNA大小無限制，最大可達25089提高顯微注射DNA表達的成功率轉入的外源基因要能夠高效表達，最好是可以誘導表達。轉入基因中應該包含有幫助提高整合效率的序列，如微衛(wèi)星序列。微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星序列誘導表達啟動子外源基因提高顯微注射DNA表達的成功率轉入的外源基因要能夠高效表90基因功能分析基本策略課件912)胚胎干細胞法胚胎干細胞(embryostemcells,ES細胞)：可人工培養(yǎng)增殖的小鼠胚泡發(fā)育期胚胎細胞，當把這種胚胎細胞重新導入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持著分化成其他類型細胞的能力。ES細胞具有與胚胎細胞相似的形態(tài)特征和分化特性。2)胚胎干細胞法胚胎干細胞(embryostemcel92胚胎干細胞法分離和培養(yǎng)ES細胞。外源基因導入ES細胞。導入外源基因的ES細胞的子宮轉移。轉基因鼠的鑒定及鼠系建立。胚胎干細胞法分離和培養(yǎng)ES細胞。93胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中分離胚泡內層細胞胰蛋白酶消化解離加飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)胚胎干細胞胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中分離胚泡內層細胞胰蛋白酶消94胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)95胚胎干細胞外源DNA的導入DNA胚胎干細胞囊胚原囊胚轉基因動物磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉錄病毒感染法電穿孔法微注射胚胎干細胞外源DNA的導入DNA磷酸鈣-DNA共沉淀法96外源DNA的整合用于ES細胞的DNA載體一般帶有定點整合元件,避免了隨機整合。定點整合位點應選擇在基因組內編碼非必需產(chǎn)物的地方，以減少整合對細胞正常功能的影響。定點整合位點必須在基因組的可以進行轉錄的地方。外源DNA的整合用于ES細胞的DNA載體一般帶有97胚胎干細胞法的特點定點整合。ES細胞在體外培養(yǎng)，外源DNA導入后可用正-負選擇法篩選擇正確整合的ES細胞,相對較簡單。目前只在小鼠身上獲得成功。胚胎干細胞法的特點定點整合。98基因功能分析基本策略課件993）逆轉錄病毒感染法逆轉錄病毒載體的構建獲得四/八細胞胚胎/囊胚/原腸胚外源DNA導入早期胚胎：獲得病毒顆粒感染早期胚胎包裝細胞與早期胚胎共培養(yǎng)感染后的胚胎植入受體動物子宮，發(fā)育成攜帶外源基因的動物。3）逆轉錄病毒感染法逆轉錄病毒載體的構建100逆轉錄病毒感染法外源基因逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒感染四/八細胞胚胎/囊胚/原腸胚嵌合小鼠純合體小鼠逆轉錄病毒感染法外源基因逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒感染四/八細101逆轉錄病毒感染法的特點通過病毒DNA插入宿主DNA的機制，將外源目的基因整合到宿主基因組，整合效率高。反轉錄病毒載體容量有限，只能轉移小片段DNA(＜10kb)。對家禽類的轉基因研究有重要意義。逆轉錄病毒感染法的特點通過病毒DNA插入宿主DNA的1024）精子載體法外源DNA精子卵細胞受精卵轉基因動物共育法脂質體轉染法電穿孔法4）精子載體法外源DNA共育法103DNA精子受精卵DNA卵細胞DNA胚胎干細胞DNA逆轉錄病毒感染磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉錄病毒感染法電穿孔法四細胞胚胎囊胚原腸胚轉基因動物微注射顯微注射DNA精子受精卵DNA卵細胞DNA胚胎干細胞DNA逆轉錄病毒1043.下游—基因整合與表達檢測及篩選染色體基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位點和拷貝數(shù)。轉錄水平：轉基因的mRNA的存在與否以及表達水平。蛋白水平：轉基因的蛋白質的表達以及功能檢測。3.下游—基因整合與表達檢測及篩選染色體基因水平：是否整合105鑒定方法PCRSouthernblot染色體原位雜交NorthernblotRT-PCRWesternblot鑒定方法PCR106基因轉移鼠純合鼠系的建立×轉基因雜合鼠未轉基因鼠生殖系細胞中不含轉入基因生殖系細胞中含轉入基因子代多次交配可得到純合轉基因鼠系基因轉移鼠純合鼠系的建立×轉基因雜合鼠未轉基因鼠生殖系細胞中107三、轉基因動物的應用分析動物表型與外源基因的關系，揭示外源基因的功能。建立人類疾病的轉基因動物模型?；虍a(chǎn)品的制備：乳腺、膀胱生物反應器。三、轉基因動物的應用分析動物表型與外源基因的關系，揭示外源基108人類疾病的轉基因動物模型完整的動物模型可以模擬人類疾病的起始和發(fā)展，幫助了解疾病的病因和發(fā)展過程。為測試各種可能的治療方案提供一個統(tǒng)一有效的系統(tǒng)。轉基因動物模型提供了人類疾病的研究手段。人類疾病的轉基因動物模型完整的動物模型可以模擬人類疾病的起始109人類疾病的轉基因動物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：老年性癡呆癥(Alzheimer’sdisease)、關節(jié)炎(arthritis)、肌肉營養(yǎng)缺乏癥(musculardistrophy)、腫瘤發(fā)生(tumorigenesis)、高血壓(hypertension)、神經(jīng)退行性疾病(neurodegenenerativedisorder)、內分泌功能障礙(endocrinological

disfunction)、動脈硬化癥及其他很多疾病。人類疾病的轉基因動物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：110利用轉基因動物反應器生產(chǎn)藥用蛋白轉基因動物反應器：乳腺、膀胱、血液生物反應器等?？鼓窱II：轉基因綿羊的乳汁中。β乳球蛋白紅細胞生成素凝血因子VIII凝血因子IX生長激素利用轉基因動物反應器生產(chǎn)藥用蛋白轉基因動物反應器：乳腺、膀胱111轉基因改良移植器官改造異種來源器官的遺傳性狀，使之適應于人體器官或組織的移植。1997年起，利用遺傳改良的轉基因豬肝做為嚴重肝病患者的離體生命支持物。轉基因改良移植器官改造異種來源器官的遺傳性狀，使之適應于人體112動物的克隆1996年，首次實現(xiàn)動物的無性生殖。由綿羊的乳腺細胞提供細胞核，卵細胞提供細胞質發(fā)育而來。核移植技術（NuclearTransfer)動物的克隆1996年，首次實現(xiàn)動物的無性生殖。113核移植技術（NuclearTransfer)核移植技術（NuclearTransfer)114基因功能分析基本策略課件115第二節(jié)基因打靶基因打靶(GeneTargeting)

：通過DNA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內研究此基因的功能。基因敲除(geneknockout):將某個基因定向去除。基因敲入(geneknockin):定向將一段基因序列替代另一段基因序列。第二節(jié)基因打靶基因打靶(GeneTargeting)116一、基因打靶的基本程序打靶載體的構建。打靶載體導入ES細胞及其鑒定。基因敲除ES細胞注射入胚泡。胚泡植入假孕小鼠的子宮。嵌合體的雜交建立基因打靶的純合鼠系。一、基因打靶的基本程序打靶載體的構建。1171.打靶載體的構建同源基因片段質粒載體HB1HB2neor基因HSV-tk基因1.打靶載體的構建同源基因片段質粒載體HB1HB2neor1182.打靶載體導入ES細胞磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉錄病毒感染法電穿孔法脂質體轉染法顯微注射法2.打靶載體導入ES細胞磷酸鈣-DNA共沉淀法119打靶載體的正-負選擇與整合位點兩端區(qū)域同源的兩段DNA序列(HB1和HB2)。目的基因。編碼抗G418的新霉素磷酸轉移酶基因（neor基因）。2個不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分別來自I型II型單純皰疹病毒。打靶載體的正-負選擇與整合位點兩端區(qū)域同源的兩段DNA序120打靶載體的正篩選

tk1HB1neorHB2tk2載體載體同源重組neorG418正篩選，細胞存活染色體染色體打靶載體的正篩選tk1HB1neor121打靶載體的負篩選

tk1HB1neorHB2tk2染色體染色體非特異性整合

GCV負篩選，細胞死亡打靶載體的負篩選tk1HB1neor122PCR鑒定在打靶載體的HB1和HB2之間，加上一個載體和鼠的基因組中都沒有的獨特DNA序列（US）。如發(fā)生隨機整合，PCR無法擴增出預期的DNA片段。如果整合于特定位點時，則PCR可以擴增出預期大小的片段。PCR鑒定在打靶載體的HB1和HB2之間，加上一個123PCR鑒定：特異整合tk1HB1USneorHB2tk2P2P1PCR反應有特異條帶特異整合PCR鑒定：特異整合tk1HB1USneo124基因敲除小鼠的獲得基因敲除ES細胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮嵌合體的雜交育種：同源重組只發(fā)生在一條染色體上，因而同源重組后只能得到嵌合體，將嵌合體雜交，即可得到純合子?！粱蚯贸∈蟮墨@得基因敲除ES細胞注射入胚泡×125基因功能分析基本策略課件126基因敲除和RNA干擾基因敲除是在基因水平將某個基因定點去除，動物整體水平。RNA干擾不是敲除基因，而是誘導RNA的特異性降解，干擾基因的表達。一般是在細胞水平?；蚯贸蚏NA干擾基因敲除是在基因水平將某個基因定點去127第三節(jié)RNA干擾1990年，Jorgense等通過轉基因改造牽?；伾?。外源基因不但不能加深花的顏色，反而造成內源基因表達的降低。

第三節(jié)RNA干擾1990年，Jorgense等通過128RNA干擾是dsRNA導致的基因沉默1998年，F(xiàn)ire等在C.elegans中用antisenseRNA抑制基因表達。dsRNA比sense或antisenseRNA都好。注射甚至口服dsRNA都能誘發(fā)基因沉默。很少量的雙鏈RNA就能誘發(fā)C.elegans整體的基因沉默，甚至能傳遞到子一代。RNA干擾：RNAinterference(RNAi)

RNA干擾是dsRNA導致的基因沉默1998年，F(xiàn)ir129RNAi是真核生物中廣泛存在的現(xiàn)象

植物：干擾因素自葉脈向外擴散，綠色熒光蛋白(GFP)基因被抑制，顯露出紅色。

線蟲：左側為GFP轉基因線蟲；右側線蟲則經(jīng)GFPdsRNA處理。部分細胞RNAi相關蛋白表達較低，仍有綠色熒光。

Hela細胞：經(jīng)ORC6siRNA作用后，細胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象。綠色為tubulin，紅色為DNA。ORC6細胞分裂調控蛋白。

果蠅：右側果蠅為野生型，左側為shRNA

造成的色素缺乏的缺陷型。RNAi