園林植物遺傳育種學(xué)第八章分子育種

第八章分子育種一、分子育種的概念與程序概念

按照人們的愿望，進行嚴(yán)密的設(shè)計，通過體外DNA重組技術(shù)和DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有物種在短時間內(nèi)趣于完善，以創(chuàng)造出新的生物類型的技術(shù)體系，亦即基因工程。2.植物基因工程植物基因工程是近20年來隨著DNA重組技術(shù)、植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)而發(fā)展起來的現(xiàn)代生物技術(shù)。3.基因工程的基本步驟目的基因的獲取基因載體的選擇與構(gòu)建目的基因與載體的拼接重組子導(dǎo)入受體分子外源基因的表達和產(chǎn)物的分離重組子的檢測4.觀賞植物基因工程的目的基因1、觀賞性開花、花色、花型、花徑相關(guān)基因。2、抗逆性抗蟲、抗旱、耐鹽堿、抗寒相關(guān)基因3、切花壽命4、花期調(diào)控二、基本技術(shù)及原理（一）DNA重組技術(shù)將外源DNA片段與載體分子連接，形成重組DNA分子，再將重組子導(dǎo)入寄主細胞內(nèi)。這一技術(shù)體系稱為DNA重組技術(shù)。DNA

重

組

技

術(shù)（二）基因工程的基本概念1.轉(zhuǎn)化（Transformation)：是指將外源DNA導(dǎo)入受體細胞的過程。2.復(fù)制子（Replicon)：具有一個復(fù)制起點(ori)的DNA分子稱為一個復(fù)制子。3.載體（Vector）：能與外源DNA連接并實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的復(fù)制子。4.重組子（Recombinant）：連接了外源DNA分子的復(fù)制子。（三）基因工程的工具酶限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease)DNA連接酶（ligase)末端修飾酶（五）基因工工程的載體體系統(tǒng)1、質(zhì)粒載載體2、噬菌體體載體3、病毒載載體質(zhì)粒圖譜及及質(zhì)粒構(gòu)建建啟動子外外源基基因終終止子啟啟動動子報告告基因終終止子（標(biāo)記基因因）目的片段選選擇標(biāo)記載體(六)植植物基因工工程的報告告基因定義特點在選擇培養(yǎng)養(yǎng)基上生長長報告基因與與目的基因因嵌和表達達研究調(diào)控區(qū)區(qū)報告基因的的種類新霉素磷酸酸轉(zhuǎn)移酶（（Neomycinephosphotransferase–II,NPTII)基基因氯霉素乙酰?；D(zhuǎn)移酶酶（Chloraphenicolacetyltransferase,CAT）基基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶（Hygromycinphosphotransferase,Hpt）基因因β–葡萄萄糖酸苷酶（β–Glucuronidase,GUS）基因因熒光素酶（Luceferase,Luc））基因抗除草劑（Basta,Bar））基因三、轉(zhuǎn)基因操操作的方法(一)外源DNA導(dǎo)入植植物細胞的方方法載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化方法DNA直接導(dǎo)導(dǎo)入法種質(zhì)系統(tǒng)法外源DNA導(dǎo)導(dǎo)入植物細胞胞的方法1、致癌農(nóng)桿桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體體轉(zhuǎn)化法2、病毒介導(dǎo)導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移移3、基因槍介介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化4、PEG誘誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化5、脂質(zhì)體介介導(dǎo)6、電激法介介導(dǎo)7、超聲波介介導(dǎo)8、顯微注射射9、激光微束束10、種質(zhì)系系統(tǒng)介導(dǎo)基因因轉(zhuǎn)化法1、致癌農(nóng)桿菌介介導(dǎo)的Ti質(zhì)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化化法含有Ti質(zhì)粒粒的致癌農(nóng)桿桿菌與一些植植物的細胞接接觸后，Ti質(zhì)粒的一部部分（T-DNA）可以以導(dǎo)入植物細細胞，整和到到植物基因組組DNA隨其其復(fù)制。根據(jù)據(jù)這一特性可可構(gòu)建一系列列Ti質(zhì)粒載載體，與含含目的片段的的DNA片段段重組，導(dǎo)入入致癌農(nóng)桿菌菌，再采用葉葉盤法、原生生質(zhì)體培養(yǎng)法法、細胞培養(yǎng)養(yǎng)法，通過致致癌農(nóng)桿菌介介導(dǎo)進入植物物細胞。根瘤農(nóng)桿菌及及Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒根瘤農(nóng)桿菌染染色體外的遺遺傳物質(zhì)，為為共價閉合環(huán)環(huán)狀的DNA分子。Ti質(zhì)粒的功功能為農(nóng)桿菌提供供附著于植物物細胞壁的能能力；參與寄主細胞胞合成激素的的能力；誘發(fā)植物產(chǎn)生生冠癭瘤；賦予寄主分解解冠癭堿的能能力；決定寄主范圍圍。Ti質(zhì)粒的結(jié)結(jié)構(gòu)T-DNA區(qū)區(qū)Vir區(qū)Con區(qū)Ori區(qū)Vir區(qū)LBRBETiPlasmidT-DNA區(qū)區(qū)Ori區(qū)Con區(qū)Vir區(qū)操操縱子的基因因結(jié)構(gòu)與功能能Vir區(qū)是一一段長度為35KB操縱縱子包含六個基因因：VirA、VirB、VirC、、VirD、VirE、VirG。。核心區(qū)左邊界右邊界T-DNA的的結(jié)構(gòu)與功能能∶LBRBLBRB植物遺傳轉(zhuǎn)化化的載體系統(tǒng)統(tǒng)一元載體（順順勢載體）雙元載體（反反式載體）農(nóng)桿菌介導(dǎo)的的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的的構(gòu)建PG2TNOSAmprPG1T目的基因報告基因，選擇標(biāo)記基因Vir區(qū)目的基因報告基因，選擇標(biāo)記基因LBRB農(nóng)桿菌導(dǎo)入方方法共培養(yǎng)法葉盤轉(zhuǎn)化法整株感染法原生質(zhì)體共培培養(yǎng)法2、基因槍介介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因因操作基本原理操作步驟優(yōu)點影響轉(zhuǎn)化效率率的因素Bio-RadBiolisticDS-1000/HeandHeptaSystemBio-RadBiolisticDS-1000/HeandHeptaSystem操作步驟預(yù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因操作轉(zhuǎn)基因植株篩篩選和培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株的的鑒定田間釋放影響轉(zhuǎn)化效率率的因素金屬微粒DNA沉淀輔輔助劑DNA純度和和濃度微彈速度植物材料基因槍法的優(yōu)優(yōu)點無宿主限制；；靶受體類型廣廣泛；可控度高；操作簡便。問題：轉(zhuǎn)化效率低；；嵌合體多；穩(wěn)定性差，瞬瞬時表達；外源基因沉默默；整合機理不詳詳。3、PEG誘誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化聚乙二醇（PEG）、多多聚鳥苷酸、、磷酸鈣在高高PH值條件件下誘導(dǎo)原生生質(zhì)體撲獲DNA分子。。步驟：共保溫；稀釋PEG；；非選擇培養(yǎng)；；選擇培養(yǎng)。優(yōu)點：轉(zhuǎn)化順利，對對細胞傷害小?。槐苊馇逗象w的的生成；易于選擇；便于進行理論論研究；受體廣泛。4、脂質(zhì)體介介導(dǎo)用化學(xué)物質(zhì)將將DNA包裹裹成球體，通通過植物原生生質(zhì)體的吞噬噬作用，把DNA導(dǎo)入細細胞。5、電激法介介導(dǎo)利用高壓脈沖沖作用，在原原生質(zhì)體上形形成可逆的瞬瞬間通道，從從而促進外源源DNA的攝攝取。＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－6、超聲波介介導(dǎo)

7、顯顯微注射8、激光微束束9、種質(zhì)系統(tǒng)統(tǒng)介導(dǎo)法生物媒體轉(zhuǎn)化化系統(tǒng)(二)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因操作的的受體系統(tǒng)1、高頻再生生體系的建立立愈傷組織再生生系統(tǒng)直接分化再生生系統(tǒng)原生質(zhì)體再生生系統(tǒng)胚狀體再生系系統(tǒng)生殖細胞再生生系統(tǒng)2、抗生素敏敏感實驗抑制細菌生長長殺死非轉(zhuǎn)化細細胞3、農(nóng)桿菌敏敏感實驗(三)轉(zhuǎn)化化細胞的培養(yǎng)養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因植植株的再生恢復(fù)生長篩選培養(yǎng)植株再生四、轉(zhuǎn)基因植植物的鑒定遺傳鑒定表達鑒定表型分析鑒定定利用報告基因因Northern雜交交Western雜交直接鑒定DNA分子是否否整合到基因因組上。1）擴增目的的片段；2）雜交信號號鑒定。（Southern雜交交）鑒定步驟：篩選鑒定（利利用質(zhì)粒上的的選擇標(biāo)記））報告基因鑒定定（利用質(zhì)粒粒上的報告基基因）遺傳鑒定生長試驗

DNA鑒定-southernRNA鑒定-northern蛋白質(zhì)鑒定-westernSouthernDNA印跡雜交交植物遺傳轉(zhuǎn)化化流程適宜外植體的的選擇及再生生體系的建立立抗生素篩選壓壓的確定及農(nóng)農(nóng)桿菌菌株的的選擇遺傳轉(zhuǎn)化操作作載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化方法DNA直接導(dǎo)導(dǎo)入法種質(zhì)系統(tǒng)法選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株鑒鑒定獲得再生植株株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株的的繁殖與應(yīng)用用利用報告基因因Southern雜交交Northern雜交交Western雜交五、基因工程程的安全性（一）安全問問題的考慮工程菌株的處處理轉(zhuǎn)基因植物的的釋放轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的的安全1.轉(zhuǎn)基因作作物本身成為為雜草；2.轉(zhuǎn)基因作作物使其親緣緣野生種成為為雜草或超級級雜草；3.轉(zhuǎn)基因作作物可能產(chǎn)生生新的病毒或或疾病；4.轉(zhuǎn)基因作作物對非目標(biāo)標(biāo)生物的危險險；5.轉(zhuǎn)基因作作物作為外來來種對新生境境的入侵，使使生物多樣性性受到威脅；；6.轉(zhuǎn)基因作作物對生態(tài)系系統(tǒng)及生態(tài)過過程的影響；；7.其它一一些不可預(yù)計計的風(fēng)險。（二）轉(zhuǎn)基因因植物的風(fēng)險險（三）生物安安全的管理法國為對遺傳傳修飾生物體體(GMO)的評價和立立法成立了兩兩個專門委員員會。第一個是遺傳傳工程委員會會，成立于1975年，，任務(wù)集中于于實驗室的重重組DNA的的研究；1986年又又成立了生物物分子工程委委員會，它的的任務(wù)是評價價遺傳修飾生生物體的大田田試驗、釋放放以及商品化化過程的安全全問題。進入90年代代特別是1992年聯(lián)合合國環(huán)境與發(fā)發(fā)展大會的召召開，更加促促進了國際上上對生物安全全立法工作的的重視，特別別是大會由許許多國家簽署署的兩個綱領(lǐng)領(lǐng)性文件《21世紀(jì)議議程》和《生物多樣性公公約》均在有關(guān)條款款中提到了生生物技術(shù)安全全問題。1993年，，在原國家科科學(xué)技術(shù)委員員會領(lǐng)導(dǎo)下成成立了國家生生物遺傳工程程安全委員會會，由來自衛(wèi)衛(wèi)生部、農(nóng)業(yè)業(yè)部、輕工業(yè)業(yè)部的專家組組成，負責(zé)醫(yī)醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和和輕工業(yè)部門門的生物安全全。目前，在中國國負責(zé)生物安安全的部門有有國家環(huán)?？偪偩帧⒖萍疾坎?、農(nóng)業(yè)部、、衛(wèi)生部、國國家醫(yī)藥管理理局、中國科科學(xué)院和教育育部等。1996年7月10日農(nóng)農(nóng)業(yè)部頒布的的《農(nóng)業(yè)生物物基因工程安安全管理實施施辦法》是一一部較完善、、較好的“實實施辦法”。。農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生生物安全管理理條例中華人民共和和國國務(wù)院令令第304號《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因因生物安全管管理條例》已已經(jīng)2001年5月9日日國務(wù)院第38次常務(wù)會會議通過，現(xiàn)現(xiàn)予公布，自自公布之日起起施行。總總理理朱镕基基2001年年5月23日日植物基因工程程一、植物基因因工程的載體體二、植物基因因工程的報告告基因三、基因轉(zhuǎn)化化的受體系統(tǒng)統(tǒng)