DNA的重組與轉(zhuǎn)座培訓(xùn)課程課件

一節(jié)DNA重組

同源重組特異位點(diǎn)重組二節(jié)DNA轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子的概念轉(zhuǎn)座子的分類轉(zhuǎn)座過程發(fā)生和機(jī)制轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征真核生物的轉(zhuǎn)座因子第六章DNA的重組與轉(zhuǎn)座一節(jié)DNA重組第六章DNA的重組與轉(zhuǎn)座1

重組和突變是產(chǎn)生遺傳變異的兩大主要因素，但二者的分子機(jī)制截然不同：重組是已經(jīng)存在的遺傳信息發(fā)生重排，而突變是改變基因組中的堿基。但二者在分子機(jī)制上又是相互影響的。

一概念

DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合稱為DNA的重組(遺傳重組或基因重排)。

第一節(jié)DNA的重組重組和突變是產(chǎn)生遺傳變異的兩大主要因素，但二者2

二DNA重組的意義對(duì)生物進(jìn)化起著關(guān)鍵作用。能迅速增加群體的遺傳多樣性(diversity)，使有利突變與不利突變分開，通過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息；提供修復(fù)機(jī)制；調(diào)節(jié)基因表達(dá)等。二DNA重組的意義3

三重組主要類型

1同源重組2特異位點(diǎn)重組3異常重組

其共同點(diǎn)是雙股DNA間的物質(zhì)交換，但發(fā)生的情況不同。三重組主要類型其共同點(diǎn)是雙股DNA間的物41同源重組

◎發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。1同源重組5

◎Holliday重組模型

RobinHolliday于1964年提出了重組的雜合DNA模型，又稱Holliday模型。該模型對(duì)重組過程的解釋如下：同源的非姐妹染色單體聯(lián)會(huì)；同源非姐妹染色單體DNA中兩個(gè)方向相同的單鏈，在DNA內(nèi)切酶的作用下，在相同位置同時(shí)切開；切開的單鏈交換重接;形成交聯(lián)橋結(jié)構(gòu)；交聯(lián)橋沿配對(duì)DNA分子“移動(dòng)”。兩個(gè)親本DNA分子間造成一大段異源雙鏈DNA（Holliday結(jié)構(gòu)）繞交聯(lián)橋旋轉(zhuǎn)180度；形成Holliday異構(gòu)體；通過兩種方式之一切斷DNA單鏈，若左右切，則形成非重組體，若上下切則形成重組體。

◎Holliday重組模型6片段重組體拼接重組體

無(wú)論Holliday結(jié)構(gòu)斷裂是否導(dǎo)致旁側(cè)遺傳標(biāo)記的重組，他們都含有一個(gè)異源雙鏈DNA區(qū)。片段重組體拼接重組體無(wú)論Holliday結(jié)構(gòu)斷裂是7◎異源雙鏈與基因轉(zhuǎn)變

異源雙鏈DNA：由不同親本雙鏈分子中的互補(bǔ)單鏈產(chǎn)生堿基配對(duì)的雙鏈DNA，在遺傳重組中產(chǎn)生。基因轉(zhuǎn)變：一個(gè)基因轉(zhuǎn)變?yōu)樗牡任换虻倪z傳學(xué)現(xiàn)象。◎異源雙鏈與基因轉(zhuǎn)變8

基因轉(zhuǎn)變的實(shí)質(zhì)：重組過程中留下的局部異源雙鏈區(qū)，在細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別下不同的酶切/不酶切產(chǎn)生的結(jié)果。不同的切除會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果?！粱蜣D(zhuǎn)變的實(shí)質(zhì)：重組過程中留下的局部異源雙鏈區(qū)，9◎細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組機(jī)制

細(xì)菌接合：指通過細(xì)菌細(xì)胞的直接接觸，遺傳信息從供體單向轉(zhuǎn)移到受體的過程。致育因子：能夠促使染色體基因轉(zhuǎn)移的接合質(zhì)粒稱為致育因子。簡(jiǎn)稱性因子或F因子。

轉(zhuǎn)化(transformation)：指細(xì)菌品系吸收了外源DNA(轉(zhuǎn)化因子)而發(fā)生遺傳性狀改變的現(xiàn)象。具有攝取環(huán)境中游離DNA分子能力的細(xì)菌稱為感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)。有些細(xì)菌在自然條件下就可成為感受態(tài)；在實(shí)驗(yàn)室也可用高濃度Ca2+誘導(dǎo)細(xì)菌成為感受態(tài)?！痢蚣?xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組機(jī)制致育因子：能夠促使染10

轉(zhuǎn)導(dǎo)作用:當(dāng)病毒從被感染的供體細(xì)胞釋放出來﹑再次感染另一細(xì)胞時(shí),發(fā)生在供體細(xì)胞和受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組.整合

細(xì)菌的融合(transduction)：細(xì)菌細(xì)胞膜融合導(dǎo)致的基因轉(zhuǎn)移和重組叫細(xì)胞融合?！赁D(zhuǎn)導(dǎo)作用:當(dāng)病毒從被感染的供體細(xì)胞釋放出來﹑再11

◎同源重組的酶學(xué)機(jī)制DNA分子之間的交換僅涉及DNA分子重組機(jī)制和限制區(qū)域的這一部分，而不是整個(gè)染色體。有三種情況:由斷裂分子產(chǎn)生的單鏈與非姊妹染色單體的雙鏈相互作用；單鏈侵入雙鏈異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成。

以上每一步都需要酶的催化◎同源重組的酶學(xué)機(jī)制由斷裂分子產(chǎn)生的單鏈與非姊妹染色單體的12

Chi位點(diǎn)和RecBCD核酸酶(外切酶)

Chi位點(diǎn)：它由于單個(gè)堿基對(duì)的改變產(chǎn)生了刺激重組的位點(diǎn)。這一位點(diǎn)是由8個(gè)堿基組成的非對(duì)稱序列：5′GCTGGTGG3′3′CGACCACC5′●由斷裂分子產(chǎn)生的單鏈與非姊妹染色單體的雙鏈相互作用Chi序列天然存在于大腸桿菌的DNA中,每5-10kb長(zhǎng)的序列出現(xiàn)一次.

Chi位點(diǎn)是recBCD編碼的RecBCD核酸酶的靶序列Chi位點(diǎn)和RecBCD核酸酶(外切酶)5′GCTGGTG13RecBCD酶是一種強(qiáng)的核酸酶，可降解DNA，具有解旋酶活性，在SSB存在時(shí)它可以解開雙鏈；具有ATPase活性。在重組中的作用是提供帶有游離端的單鏈區(qū)。RecBCD酶14

當(dāng)RecBCD結(jié)合在DNAChi位點(diǎn)右側(cè)的短裂端時(shí)，它沿著DNA移動(dòng)，使DNA解旋。當(dāng)?shù)竭_(dá)Chi位點(diǎn)3′端4-6pb時(shí)它停頓下來，并切開單鏈DNA,產(chǎn)生具有3′端的游離單鏈.引發(fā)異源雙鏈的形成.Chi位點(diǎn)的識(shí)別導(dǎo)致RecBCD核酸酶失去的活性，但繼續(xù)發(fā)揮其解旋酶的作用。當(dāng)RecBCD結(jié)合在DNAChi位點(diǎn)右側(cè)的15RceA蛋白有兩個(gè)主要功能：誘發(fā)SOS反應(yīng)；促進(jìn)DNA單鏈的同化,即單鏈與同源雙鏈發(fā)生鏈的交換。

RecA能使單鏈DNA取代雙鏈分子中同源的鏈，一般要具備三個(gè)條件：①其中一個(gè)DNA分子必須要有一個(gè)單鏈區(qū)域；②其中一個(gè)DNA分子必須要有一個(gè)游離的3′末端；③此單鏈區(qū)域和3′末端必須和另一個(gè)DNA分子有互補(bǔ)區(qū)。●單鏈侵入雙鏈

RecA蛋白與Holliday中間體的形成RceA蛋白有兩個(gè)主要功能：RecA能使單16RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合；復(fù)合物與同源雙鏈DNA結(jié)合；入侵單鏈與雙鏈中互補(bǔ)鏈配對(duì)，同源鏈被轉(zhuǎn)換出來RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合；17

RuvA和RuvB蛋白可促進(jìn)異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成。RuvA可識(shí)別Holliday連接的結(jié)構(gòu),形成一個(gè)四面構(gòu)象,促進(jìn)分支點(diǎn)移動(dòng)；RuvB是一種解旋酶，它可發(fā)動(dòng)遷移反應(yīng)。RuvC將Holliday中間體切開,由DNA聚合酶和連接酶修復(fù)合成.●異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成Ruv蛋白和Holliday中間體的拆分RuvA和RuvB蛋白可促進(jìn)異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成18大腸桿菌中涉及產(chǎn)生重組DNA的重組基因基因功能RecBCD系統(tǒng)具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。在Chi位點(diǎn)產(chǎn)生單鏈3ˊ游離未端RecB,RecC,RecDRecBCD是ATP依賴的外切酶和解旋酶(外切酶V)，它與雙鏈斷口結(jié)合，解開DNA并導(dǎo)入裂口，其傾向性位點(diǎn)稱為chi(參見重組熱點(diǎn))。RecBCD酶產(chǎn)生RecA可以作用的底物RceA(1)具有蛋白酶活性;(2)在單鏈DNA和ATP存在的條件下RecA能啟動(dòng)DNA單鏈和與之互補(bǔ)的雙鏈分子進(jìn)行堿基配對(duì)。RceG具有解旋酶活性，可解離Hollidy連接RuvAB系統(tǒng)具有解離Hollidy連接的活性RuvA

可識(shí)別Holliday連接的結(jié)構(gòu)RuvB

是一種ATPase，它可發(fā)動(dòng)遷移反應(yīng)RuvC具有內(nèi)切酶活性，可特異識(shí)別Hollidy分枝，它在體外可切這個(gè)連接體，解離重組中間體大腸桿菌中涉及產(chǎn)生重組DNA的重組基因基因功能RecBCD系192特異位點(diǎn)重組概念：指發(fā)生在一個(gè)特定的短DNA序列內(nèi)由特異的酶和輔助因子識(shí)別和作用的重組。2特異位點(diǎn)重組20

λ噬菌體DNA進(jìn)入大腸桿菌后存在溶源(CⅠ占優(yōu)勢(shì))和裂解(Cro占優(yōu)勢(shì))兩條途經(jīng)，二者都要求早期基因的表達(dá)。噬菌體的附著位點(diǎn):attP細(xì)菌的附著位點(diǎn)：attBλ噬菌體整合酶：Intλ噬菌體編碼蛋白：Xis細(xì)菌的宿主整合因子：IHF◎λ噬菌體DNA的整合與切除λ噬菌體DNA進(jìn)入大腸桿菌后存在溶源(CⅠ占優(yōu)勢(shì))21◎細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組

鼠傷寒沙門氏菌H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白抗原表達(dá)的互變，稱為鞭毛相轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變是由H片段倒位決定的，此倒位是由于特異重組位點(diǎn)hix發(fā)生重組后引起的。特異重組位點(diǎn)hix發(fā)生重組后，引起H片段倒位，使H2鞭毛蛋白不表達(dá)，H1表達(dá)。◎細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組鼠傷寒沙門氏菌H1鞭22◎基本概念

轉(zhuǎn)座子（transposon):是在基因組中可移動(dòng)的一段ＤＮＡ序列。轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座子由基因組的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置的過程叫轉(zhuǎn)座。

轉(zhuǎn)座過程有5大特點(diǎn)：轉(zhuǎn)移、不獨(dú)立、與轉(zhuǎn)座基因共存、隨機(jī)、引起基因產(chǎn)物改變。3轉(zhuǎn)座子重組(異常重組)◎轉(zhuǎn)座子的分類插入序列IS復(fù)合轉(zhuǎn)座子1同源重組2特異位點(diǎn)重組3異常重組◎基本概念轉(zhuǎn)座過程有5大特點(diǎn)：23插入序列(IS)

IS是基因組中可移動(dòng)遺傳因子家族中的成員之一，它可以整合到宿主非同源位點(diǎn)上，若IS插入到某基因內(nèi)，通常這個(gè)基因就會(huì)失活。圖23-18

質(zhì)粒上有IS，那么經(jīng)變性和復(fù)性后，在電鏡下可以觀察到莖環(huán)結(jié)構(gòu)的存在(引自Griffithsetal1999)IS因子特點(diǎn)

只含有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的酶基因，不含抗藥性及其它基因，兩端有15-25bp反向重復(fù)序列(IR)。插入序列(IS)圖23-18質(zhì)粒上有IS，那么經(jīng)變性24類插入序列（IS-likeelements）

是指IS10R，IR50R和IS903，它們的結(jié)構(gòu)和IS相似，但不獨(dú)立存在。而是作為復(fù)合轉(zhuǎn)座子兩臂的組件。表IS的結(jié)構(gòu)和功能

DR(bp)IR(bp)中心區(qū)域(bp)靶的選擇拷貝數(shù)插入序列:

IS1923768隨機(jī)5～8IS25411327熱點(diǎn)5(在F因子上為一)IS411~13181428AAN20TTT1或2IS54161195熱點(diǎn)？類插入序列:

IS10R9221329NGCTNAGCN

IS50R991531熱點(diǎn)

IS9039181057隨機(jī)

類插入序列（IS-likeelements）25ATGCATACGT987654321123456789987654321123456789987654321123456789987654321123456789ATGCATACGTATGCATACGT反向重復(fù)區(qū)靶序列順式重復(fù)區(qū)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子在靶位置插入前后的結(jié)構(gòu)ATGCA9876543211234567899876526復(fù)合型轉(zhuǎn)座子(Tn)

這類轉(zhuǎn)座子中除了轉(zhuǎn)座酶基因外，還有藥物抗性基因，結(jié)構(gòu)較大而復(fù)雜，故稱為復(fù)合轉(zhuǎn)座子。有Ⅰ和Ⅱ兩種類型。Ⅰ型：兩末端有相同的IS序列，或正向，或反向。Ⅱ型：末端有38bp的反向重復(fù)序列。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子(Tn)Ⅰ型：兩末端有相同的IS序列，或正向，或27

圖兩種不同的轉(zhuǎn)座子含有不同的IR區(qū)域和不同的抗性基因。(a)Tn9含有一個(gè)短的IR區(qū)。因兩個(gè)IS1元件以相同的方向排列，每個(gè)元件都有一個(gè)IR序列(b)Tn10含有一個(gè)長(zhǎng)的IR區(qū)。兩個(gè)IS成分方向相反(引自Griffithsetal1999)圖兩種不同的轉(zhuǎn)座子含有不同的IR區(qū)域和不同的抗性基因。28轉(zhuǎn)座因子

長(zhǎng)度(bp)遺傳標(biāo)記

末端組件方向Tn9033100KanRIS903反向Tn92500CamRIS1正向Tn109300TetRIS10R

IS10L反向Tn55700KanRIS50R

IS50L反向表復(fù)合轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)

轉(zhuǎn)座因子

長(zhǎng)度(bp)遺傳標(biāo)記末端組件方向Tn90329◎轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制自學(xué)轉(zhuǎn)座子插入到DNA上新的位點(diǎn)，首先交錯(cuò)切開靶DNA，再將轉(zhuǎn)座子連接到靶的凸出單鏈上，最后填補(bǔ)空缺完成轉(zhuǎn)座。按在轉(zhuǎn)座過程中是否發(fā)生復(fù)制，可以分為：復(fù)制型轉(zhuǎn)座非復(fù)制型轉(zhuǎn)座◎轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制自學(xué)復(fù)制型轉(zhuǎn)座301979年Shapiro提出了轉(zhuǎn)座模型

這個(gè)過程開始是形成單鏈轉(zhuǎn)移復(fù)合體[有時(shí)也稱為交換復(fù)合體]，供體和靶的單鏈連接，這樣轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)末端分別與靶及供體單鏈相連接。連接轉(zhuǎn)移復(fù)合體產(chǎn)生了一個(gè)交換形成的結(jié)構(gòu)在雙鏈轉(zhuǎn)座子處結(jié)合在一起，這個(gè)交換結(jié)構(gòu)（即共同中間體）決定了轉(zhuǎn)座方式的命運(yùn)。交換結(jié)構(gòu)的每個(gè)交錯(cuò)末端含有一個(gè)單鏈區(qū)。這個(gè)區(qū)域是個(gè)假的復(fù)制叉。它提供了DNA合成的模板。若復(fù)制繼續(xù)，那么它的延伸將經(jīng)過轉(zhuǎn)座子，將它的鏈分開，在其末端終止復(fù)制，然后由連接酶封閉缺口。這個(gè)結(jié)構(gòu)變成了共合體。在轉(zhuǎn)座子與復(fù)制子之間的連接處有DR。復(fù)制可能由宿主編碼的酶來完成。這個(gè)模型解釋了：復(fù)制性轉(zhuǎn)座在原來的位置上保留原有的Tn；在新位置上轉(zhuǎn)座子的兩端出現(xiàn)正向重復(fù)靶序列；轉(zhuǎn)座過程中出現(xiàn)共合體。1979年Shapiro提出了轉(zhuǎn)座模型這個(gè)模型解釋了：31復(fù)制型轉(zhuǎn)座

在復(fù)制型轉(zhuǎn)座中，整個(gè)轉(zhuǎn)座子被復(fù)制了，一個(gè)拷貝保留在供體的原來部位不變，另一個(gè)拷貝即原轉(zhuǎn)座子的拷貝則插入到受體的位點(diǎn)上，供體和受體都有一個(gè)轉(zhuǎn)座子的拷貝，所以，通過轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)得到了擴(kuò)增。轉(zhuǎn)座酶和解離酶在轉(zhuǎn)座過程中分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子。復(fù)制型轉(zhuǎn)座32非復(fù)制型轉(zhuǎn)座在非復(fù)制型轉(zhuǎn)座中，轉(zhuǎn)座子可以直接地從供體的一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到受體的新位點(diǎn)處，此類轉(zhuǎn)座子的特點(diǎn)是兩端具有20bp左右的反向重復(fù)序列，特異的轉(zhuǎn)座酶附著于此而使轉(zhuǎn)座子切離下來，整合到另一個(gè)位點(diǎn)上。供體在切離后留下的缺口被銜接起來，但往往在銜接處的序列發(fā)生改變而產(chǎn)生突變。

非復(fù)制型轉(zhuǎn)座33◎轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征☆

轉(zhuǎn)座不依賴靶序列的同源性☆轉(zhuǎn)座后靶序列重復(fù)☆轉(zhuǎn)座子的插入具有專一性☆轉(zhuǎn)座具有排他性☆轉(zhuǎn)座具有極性效應(yīng)☆活化臨近的沉默基因☆區(qū)域性優(yōu)化◎轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征34◎DNA轉(zhuǎn)座引起的遺傳學(xué)效應(yīng)☆可導(dǎo)致突變；☆出現(xiàn)新基因；☆影響插入部位鄰近基因的表達(dá)，改變宿主表型；☆引起染色體畸變。◎DNA轉(zhuǎn)座引起的遺傳學(xué)效應(yīng)35

40年代，BarbaraMcClintock，研究發(fā)現(xiàn)：玉米籽粒有色（紅、紫），但有一些籽粒出現(xiàn)花斑及條紋，花斑有大有小。早期有顏色者，花斑大，后期有色者，花斑很小.控制元件，可以在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)移，并能改變基因的活性引起功能的改變.◎真核生物的轉(zhuǎn)座子

玉米的控制因子

果蠅的轉(zhuǎn)座元件自學(xué)40年代，BarbaraMcClintock，36◆玉米的控制原件

Ac-Ds控制系統(tǒng)Ac(autonomouselement)，即自主控制因子:

含有2個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因、3個(gè)非編碼區(qū)，兩端有11bpIR。Ac可自主轉(zhuǎn)座，能使Ds因子活化，通過Ds控制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。Ds(noautonomouselement),又稱解離因子:

Ac能活化Ds，使其在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座或插入結(jié)構(gòu)基因之內(nèi)。玉米Ds存在能抑制鄰近基因的表達(dá)。◆玉米的控制原件Ac-Ds控制系統(tǒng)37CDsCDsAcCDsAcDs顯色基因不顯色顯色AsAcAc-Ds系統(tǒng)對(duì)玉米顏色的的控制有色基因C（顯性）可使籽粒有色，C旁Ds抑制了基因C的作用，使籽粒無(wú)色；當(dāng)Ds從C上移走后，C作用恢復(fù)，出現(xiàn)顏色；Ds從C上移走的早，花斑就大，反之就?。灰虼嘶ò叩拇笮∈荄s從C上移走的早晚引起的。Ds的移動(dòng)還受另一個(gè)因子（Ac）的控制，當(dāng)Ac存在時(shí)，Ds可移動(dòng)，Ac丟失，則Ds不能移動(dòng)。CDsCDsAcCDsAcDs顯色基因不顯色顯色AsAcAc38作業(yè)1DNA的重組概念﹑類型及意義2簡(jiǎn)述Holliday重組模型作業(yè)1DNA的重組概念﹑類型及意義39◆果蠅中的P因子“雜種不育”（hybriddysgenesis）。P型（父本貢獻(xiàn)的，paternalcontributing）M型（母本貢獻(xiàn)的，maternalcontributing）M（♂）×P（♀）后代不育P（♂）×M（♀）后代可育◆果蠅中的P因子40DNA的重組與轉(zhuǎn)座培訓(xùn)課程課件4187kD轉(zhuǎn)座酶P因子誘發(fā)果蠅雜種不育P品系雄性×M品系雌性→子代生殖細(xì)胞發(fā)育不全。87kD轉(zhuǎn)座酶P因子誘發(fā)果蠅雜種不育42表

一些有代表性的真核轉(zhuǎn)座子的屬性物種II類轉(zhuǎn)座因子家族ITRTSDs果蠅PhoboMarinerFB311228大8829線蟲Tc1542玉米Ac/DsSpm/dsomMu/Mn10/1113?200839金魚草Tam1Tam313/141238/5一些真核生物TU/Puppy大8

表一些有代表性的真核轉(zhuǎn)座子的屬性物種II類轉(zhuǎn)ITRTS43第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（自學(xué)）第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（自學(xué)）441，名詞解釋：Holliday連接體，位點(diǎn)特異性重組，轉(zhuǎn)座,轉(zhuǎn)座子2，簡(jiǎn)述原核同源重組涉及的主要酶系及各自在重組中的功能3，簡(jiǎn)述原核生物轉(zhuǎn)座子的分類及各自的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。4，簡(jiǎn)述玉米粒色斑現(xiàn)象的產(chǎn)生機(jī)制

作業(yè)1，名詞解釋：Holliday連接體，位點(diǎn)特異性重組，轉(zhuǎn)座45演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！46一節(jié)DNA重組

同源重組特異位點(diǎn)重組二節(jié)DNA轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子的概念轉(zhuǎn)座子的分類轉(zhuǎn)座過程發(fā)生和機(jī)制轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征真核生物的轉(zhuǎn)座因子第六章DNA的重組與轉(zhuǎn)座一節(jié)DNA重組第六章DNA的重組與轉(zhuǎn)座47

重組和突變是產(chǎn)生遺傳變異的兩大主要因素，但二者的分子機(jī)制截然不同：重組是已經(jīng)存在的遺傳信息發(fā)生重排，而突變是改變基因組中的堿基。但二者在分子機(jī)制上又是相互影響的。

一概念

DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合稱為DNA的重組(遺傳重組或基因重排)。

第一節(jié)DNA的重組重組和突變是產(chǎn)生遺傳變異的兩大主要因素，但二者48

二DNA重組的意義對(duì)生物進(jìn)化起著關(guān)鍵作用。能迅速增加群體的遺傳多樣性(diversity)，使有利突變與不利突變分開，通過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息；提供修復(fù)機(jī)制；調(diào)節(jié)基因表達(dá)等。二DNA重組的意義49

三重組主要類型

1同源重組2特異位點(diǎn)重組3異常重組

其共同點(diǎn)是雙股DNA間的物質(zhì)交換，但發(fā)生的情況不同。三重組主要類型其共同點(diǎn)是雙股DNA間的物501同源重組

◎發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。1同源重組51

◎Holliday重組模型

RobinHolliday于1964年提出了重組的雜合DNA模型，又稱Holliday模型。該模型對(duì)重組過程的解釋如下：同源的非姐妹染色單體聯(lián)會(huì)；同源非姐妹染色單體DNA中兩個(gè)方向相同的單鏈，在DNA內(nèi)切酶的作用下，在相同位置同時(shí)切開；切開的單鏈交換重接;形成交聯(lián)橋結(jié)構(gòu)；交聯(lián)橋沿配對(duì)DNA分子“移動(dòng)”。兩個(gè)親本DNA分子間造成一大段異源雙鏈DNA（Holliday結(jié)構(gòu)）繞交聯(lián)橋旋轉(zhuǎn)180度；形成Holliday異構(gòu)體；通過兩種方式之一切斷DNA單鏈，若左右切，則形成非重組體，若上下切則形成重組體。

◎Holliday重組模型52片段重組體拼接重組體

無(wú)論Holliday結(jié)構(gòu)斷裂是否導(dǎo)致旁側(cè)遺傳標(biāo)記的重組，他們都含有一個(gè)異源雙鏈DNA區(qū)。片段重組體拼接重組體無(wú)論Holliday結(jié)構(gòu)斷裂是53◎異源雙鏈與基因轉(zhuǎn)變

異源雙鏈DNA：由不同親本雙鏈分子中的互補(bǔ)單鏈產(chǎn)生堿基配對(duì)的雙鏈DNA，在遺傳重組中產(chǎn)生。基因轉(zhuǎn)變：一個(gè)基因轉(zhuǎn)變?yōu)樗牡任换虻倪z傳學(xué)現(xiàn)象。◎異源雙鏈與基因轉(zhuǎn)變54

基因轉(zhuǎn)變的實(shí)質(zhì)：重組過程中留下的局部異源雙鏈區(qū)，在細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別下不同的酶切/不酶切產(chǎn)生的結(jié)果。不同的切除會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果?！粱蜣D(zhuǎn)變的實(shí)質(zhì)：重組過程中留下的局部異源雙鏈區(qū)，55◎細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組機(jī)制

細(xì)菌接合：指通過細(xì)菌細(xì)胞的直接接觸，遺傳信息從供體單向轉(zhuǎn)移到受體的過程。致育因子：能夠促使染色體基因轉(zhuǎn)移的接合質(zhì)粒稱為致育因子。簡(jiǎn)稱性因子或F因子。

轉(zhuǎn)化(transformation)：指細(xì)菌品系吸收了外源DNA(轉(zhuǎn)化因子)而發(fā)生遺傳性狀改變的現(xiàn)象。具有攝取環(huán)境中游離DNA分子能力的細(xì)菌稱為感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)。有些細(xì)菌在自然條件下就可成為感受態(tài)；在實(shí)驗(yàn)室也可用高濃度Ca2+誘導(dǎo)細(xì)菌成為感受態(tài)?！痢蚣?xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組機(jī)制致育因子：能夠促使染56

轉(zhuǎn)導(dǎo)作用:當(dāng)病毒從被感染的供體細(xì)胞釋放出來﹑再次感染另一細(xì)胞時(shí),發(fā)生在供體細(xì)胞和受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組.整合

細(xì)菌的融合(transduction)：細(xì)菌細(xì)胞膜融合導(dǎo)致的基因轉(zhuǎn)移和重組叫細(xì)胞融合。×轉(zhuǎn)導(dǎo)作用:當(dāng)病毒從被感染的供體細(xì)胞釋放出來﹑再57

◎同源重組的酶學(xué)機(jī)制DNA分子之間的交換僅涉及DNA分子重組機(jī)制和限制區(qū)域的這一部分，而不是整個(gè)染色體。有三種情況:由斷裂分子產(chǎn)生的單鏈與非姊妹染色單體的雙鏈相互作用；單鏈侵入雙鏈異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成。

以上每一步都需要酶的催化◎同源重組的酶學(xué)機(jī)制由斷裂分子產(chǎn)生的單鏈與非姊妹染色單體的58

Chi位點(diǎn)和RecBCD核酸酶(外切酶)

Chi位點(diǎn)：它由于單個(gè)堿基對(duì)的改變產(chǎn)生了刺激重組的位點(diǎn)。這一位點(diǎn)是由8個(gè)堿基組成的非對(duì)稱序列：5′GCTGGTGG3′3′CGACCACC5′●由斷裂分子產(chǎn)生的單鏈與非姊妹染色單體的雙鏈相互作用Chi序列天然存在于大腸桿菌的DNA中,每5-10kb長(zhǎng)的序列出現(xiàn)一次.

Chi位點(diǎn)是recBCD編碼的RecBCD核酸酶的靶序列Chi位點(diǎn)和RecBCD核酸酶(外切酶)5′GCTGGTG59RecBCD酶是一種強(qiáng)的核酸酶，可降解DNA，具有解旋酶活性，在SSB存在時(shí)它可以解開雙鏈；具有ATPase活性。在重組中的作用是提供帶有游離端的單鏈區(qū)。RecBCD酶60

當(dāng)RecBCD結(jié)合在DNAChi位點(diǎn)右側(cè)的短裂端時(shí)，它沿著DNA移動(dòng)，使DNA解旋。當(dāng)?shù)竭_(dá)Chi位點(diǎn)3′端4-6pb時(shí)它停頓下來，并切開單鏈DNA,產(chǎn)生具有3′端的游離單鏈.引發(fā)異源雙鏈的形成.Chi位點(diǎn)的識(shí)別導(dǎo)致RecBCD核酸酶失去的活性，但繼續(xù)發(fā)揮其解旋酶的作用。當(dāng)RecBCD結(jié)合在DNAChi位點(diǎn)右側(cè)的61RceA蛋白有兩個(gè)主要功能：誘發(fā)SOS反應(yīng)；促進(jìn)DNA單鏈的同化,即單鏈與同源雙鏈發(fā)生鏈的交換。

RecA能使單鏈DNA取代雙鏈分子中同源的鏈，一般要具備三個(gè)條件：①其中一個(gè)DNA分子必須要有一個(gè)單鏈區(qū)域；②其中一個(gè)DNA分子必須要有一個(gè)游離的3′末端；③此單鏈區(qū)域和3′末端必須和另一個(gè)DNA分子有互補(bǔ)區(qū)?！駟捂溓秩腚p鏈

RecA蛋白與Holliday中間體的形成RceA蛋白有兩個(gè)主要功能：RecA能使單62RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合；復(fù)合物與同源雙鏈DNA結(jié)合；入侵單鏈與雙鏈中互補(bǔ)鏈配對(duì)，同源鏈被轉(zhuǎn)換出來RecA蛋白與單鏈DNA結(jié)合；63

RuvA和RuvB蛋白可促進(jìn)異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成。RuvA可識(shí)別Holliday連接的結(jié)構(gòu),形成一個(gè)四面構(gòu)象,促進(jìn)分支點(diǎn)移動(dòng)；RuvB是一種解旋酶，它可發(fā)動(dòng)遷移反應(yīng)。RuvC將Holliday中間體切開,由DNA聚合酶和連接酶修復(fù)合成.●異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成Ruv蛋白和Holliday中間體的拆分RuvA和RuvB蛋白可促進(jìn)異源雙鏈結(jié)構(gòu)的形成64大腸桿菌中涉及產(chǎn)生重組DNA的重組基因基因功能RecBCD系統(tǒng)具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。在Chi位點(diǎn)產(chǎn)生單鏈3ˊ游離未端RecB,RecC,RecDRecBCD是ATP依賴的外切酶和解旋酶(外切酶V)，它與雙鏈斷口結(jié)合，解開DNA并導(dǎo)入裂口，其傾向性位點(diǎn)稱為chi(參見重組熱點(diǎn))。RecBCD酶產(chǎn)生RecA可以作用的底物RceA(1)具有蛋白酶活性;(2)在單鏈DNA和ATP存在的條件下RecA能啟動(dòng)DNA單鏈和與之互補(bǔ)的雙鏈分子進(jìn)行堿基配對(duì)。RceG具有解旋酶活性，可解離Hollidy連接RuvAB系統(tǒng)具有解離Hollidy連接的活性RuvA

可識(shí)別Holliday連接的結(jié)構(gòu)RuvB

是一種ATPase，它可發(fā)動(dòng)遷移反應(yīng)RuvC具有內(nèi)切酶活性，可特異識(shí)別Hollidy分枝，它在體外可切這個(gè)連接體，解離重組中間體大腸桿菌中涉及產(chǎn)生重組DNA的重組基因基因功能RecBCD系652特異位點(diǎn)重組概念：指發(fā)生在一個(gè)特定的短DNA序列內(nèi)由特異的酶和輔助因子識(shí)別和作用的重組。2特異位點(diǎn)重組66

λ噬菌體DNA進(jìn)入大腸桿菌后存在溶源(CⅠ占優(yōu)勢(shì))和裂解(Cro占優(yōu)勢(shì))兩條途經(jīng)，二者都要求早期基因的表達(dá)。噬菌體的附著位點(diǎn):attP細(xì)菌的附著位點(diǎn)：attBλ噬菌體整合酶：Intλ噬菌體編碼蛋白：Xis細(xì)菌的宿主整合因子：IHF◎λ噬菌體DNA的整合與切除λ噬菌體DNA進(jìn)入大腸桿菌后存在溶源(CⅠ占優(yōu)勢(shì))67◎細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組

鼠傷寒沙門氏菌H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白抗原表達(dá)的互變，稱為鞭毛相轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變是由H片段倒位決定的，此倒位是由于特異重組位點(diǎn)hix發(fā)生重組后引起的。特異重組位點(diǎn)hix發(fā)生重組后，引起H片段倒位，使H2鞭毛蛋白不表達(dá)，H1表達(dá)。◎細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組鼠傷寒沙門氏菌H1鞭68◎基本概念

轉(zhuǎn)座子（transposon):是在基因組中可移動(dòng)的一段ＤＮＡ序列。轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座子由基因組的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置的過程叫轉(zhuǎn)座。

轉(zhuǎn)座過程有5大特點(diǎn)：轉(zhuǎn)移、不獨(dú)立、與轉(zhuǎn)座基因共存、隨機(jī)、引起基因產(chǎn)物改變。3轉(zhuǎn)座子重組(異常重組)◎轉(zhuǎn)座子的分類插入序列IS復(fù)合轉(zhuǎn)座子1同源重組2特異位點(diǎn)重組3異常重組◎基本概念轉(zhuǎn)座過程有5大特點(diǎn)：69插入序列(IS)

IS是基因組中可移動(dòng)遺傳因子家族中的成員之一，它可以整合到宿主非同源位點(diǎn)上，若IS插入到某基因內(nèi)，通常這個(gè)基因就會(huì)失活。圖23-18

質(zhì)粒上有IS，那么經(jīng)變性和復(fù)性后，在電鏡下可以觀察到莖環(huán)結(jié)構(gòu)的存在(引自Griffithsetal1999)IS因子特點(diǎn)

只含有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的酶基因，不含抗藥性及其它基因，兩端有15-25bp反向重復(fù)序列(IR)。插入序列(IS)圖23-18質(zhì)粒上有IS，那么經(jīng)變性70類插入序列（IS-likeelements）

是指IS10R，IR50R和IS903，它們的結(jié)構(gòu)和IS相似，但不獨(dú)立存在。而是作為復(fù)合轉(zhuǎn)座子兩臂的組件。表IS的結(jié)構(gòu)和功能

DR(bp)IR(bp)中心區(qū)域(bp)靶的選擇拷貝數(shù)插入序列:

IS1923768隨機(jī)5～8IS25411327熱點(diǎn)5(在F因子上為一)IS411~13181428AAN20TTT1或2IS54161195熱點(diǎn)？類插入序列:

IS10R9221329NGCTNAGCN

IS50R991531熱點(diǎn)

IS9039181057隨機(jī)

類插入序列（IS-likeelements）71ATGCATACGT987654321123456789987654321123456789987654321123456789987654321123456789ATGCATACGTATGCATACGT反向重復(fù)區(qū)靶序列順式重復(fù)區(qū)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子在靶位置插入前后的結(jié)構(gòu)ATGCA9876543211234567899876572復(fù)合型轉(zhuǎn)座子(Tn)

這類轉(zhuǎn)座子中除了轉(zhuǎn)座酶基因外，還有藥物抗性基因，結(jié)構(gòu)較大而復(fù)雜，故稱為復(fù)合轉(zhuǎn)座子。有Ⅰ和Ⅱ兩種類型。Ⅰ型：兩末端有相同的IS序列，或正向，或反向。Ⅱ型：末端有38bp的反向重復(fù)序列。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子(Tn)Ⅰ型：兩末端有相同的IS序列，或正向，或73

圖兩種不同的轉(zhuǎn)座子含有不同的IR區(qū)域和不同的抗性基因。(a)Tn9含有一個(gè)短的IR區(qū)。因兩個(gè)IS1元件以相同的方向排列，每個(gè)元件都有一個(gè)IR序列(b)Tn10含有一個(gè)長(zhǎng)的IR區(qū)。兩個(gè)IS成分方向相反(引自Griffithsetal1999)圖兩種不同的轉(zhuǎn)座子含有不同的IR區(qū)域和不同的抗性基因。74轉(zhuǎn)座因子

長(zhǎng)度(bp)遺傳標(biāo)記

末端組件方向Tn9033100KanRIS903反向Tn92500CamRIS1正向Tn109300TetRIS10R

IS10L反向Tn55700KanRIS50R

IS50L反向表復(fù)合轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)

轉(zhuǎn)座因子

長(zhǎng)度(bp)遺傳標(biāo)記末端組件方向Tn90375◎轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制自學(xué)轉(zhuǎn)座子插入到DNA上新的位點(diǎn)，首先交錯(cuò)切開靶DNA，再將轉(zhuǎn)座子連接到靶的凸出單鏈上，最后填補(bǔ)空缺完成轉(zhuǎn)座。按在轉(zhuǎn)座過程中是否發(fā)生復(fù)制，可以分為：復(fù)制型轉(zhuǎn)座非復(fù)制型轉(zhuǎn)座◎轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制自學(xué)復(fù)制型轉(zhuǎn)座761979年Shapiro提出了轉(zhuǎn)座模型

這個(gè)過程開始是形成單鏈轉(zhuǎn)移復(fù)合體[有時(shí)也稱為交換復(fù)合體]，供體和靶的單鏈連接，這樣轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)末端分別與靶及供體單鏈相連接。連接轉(zhuǎn)移復(fù)合體產(chǎn)生了一個(gè)交換形成的結(jié)構(gòu)在雙鏈轉(zhuǎn)座子處結(jié)合在一起，這個(gè)交換結(jié)構(gòu)（即共同中間體）決定了轉(zhuǎn)座方式的命運(yùn)。交換結(jié)構(gòu)的每個(gè)交錯(cuò)末端含有一個(gè)單鏈區(qū)。這個(gè)區(qū)域是個(gè)假的復(fù)制叉。它提供了DNA合成的模板。若復(fù)制繼續(xù)，那么它的延伸將經(jīng)過轉(zhuǎn)座子，將它的鏈分開，在其末端終止復(fù)制，然后由連接酶封閉缺口。這個(gè)結(jié)構(gòu)變成了共合體。在轉(zhuǎn)座子與復(fù)制子之間的連接處有DR。復(fù)制可能由宿主編碼的酶來完成。這個(gè)模型解釋了：復(fù)制性轉(zhuǎn)座在原來的位置上保留原有的Tn；在新位置上轉(zhuǎn)座子的兩端出現(xiàn)正向重復(fù)靶序列；轉(zhuǎn)座過程中出現(xiàn)共合體。1979年Shapiro提出了轉(zhuǎn)座模型這個(gè)模型解釋了：77復(fù)制型轉(zhuǎn)座

在復(fù)制型轉(zhuǎn)座中，整個(gè)轉(zhuǎn)座子被復(fù)制了，一個(gè)拷貝保留在供體的原來部位不變，另一個(gè)拷貝即原轉(zhuǎn)座子的拷貝則插入到受體的位點(diǎn)上，供體和受體都有一個(gè)轉(zhuǎn)座子的拷貝，所以，通過轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)得到了擴(kuò)增。轉(zhuǎn)座酶和解離酶在轉(zhuǎn)座過程中分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子。復(fù)制型轉(zhuǎn)座78非復(fù)制型轉(zhuǎn)座在非復(fù)制型轉(zhuǎn)座中，轉(zhuǎn)座子可以直接地從供體的一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到受體的新位點(diǎn)處，此類轉(zhuǎn)座子的特點(diǎn)是兩端具有20bp左右的反向重復(fù)序列，特異的轉(zhuǎn)座酶附著于此而使轉(zhuǎn)座子切離下來，整合到另一個(gè)位點(diǎn)上。供體在切離后留下的缺口被銜接起來，但往往在銜接處的序列發(fā)生改變而產(chǎn)生突變。

非復(fù)制型轉(zhuǎn)座79◎轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的特征☆

轉(zhuǎn)座不依賴靶序列