水中大腸桿菌的檢測(cè)方法

附件水中大腸桿菌群檢測(cè)方法-多管發(fā)酵法NIEAE201.54B一、方法概要本方法系用以檢測(cè)水中革蘭氏染色陰性，不產(chǎn)生內(nèi)生孢子之桿狀好氧或兼性厭氧菌，且能在35±1c、48士3小時(shí)發(fā)酵乳糖并產(chǎn)生酸及氣體之大腸桿菌群（ Coliformgroup）;在不同體積或不同稀釋度之水樣所產(chǎn)生之結(jié)果，以「 100mL水中最大可能數(shù)（乂「^100巾^」表示100mL水中存在之大腸桿菌群數(shù)目。二、適用范圍本方法適用地面水體、地下水體、廢水、污水及水源水質(zhì)水樣中大腸桿菌群之檢驗(yàn)。三、干擾（一）水樣中含有抑制或促進(jìn)大腸桿菌群細(xì)菌生長(zhǎng)之物質(zhì)。（二）檢測(cè)使用的玻璃器血及設(shè)備含有抑制或促進(jìn)大腸桿菌群細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)。四、設(shè)備（一）量筒：100至1000mL之量筒。吸管：有0.1刻度之10mL滅菌玻璃吸管或市售無(wú)菌塑料吸管，或無(wú)菌微量吸管（ micropipet）。試管：大小約150x15mm之試管或有蓋螺旋試管。（四）發(fā)酵管（fermentationtube）:大小約22x9mm之玻璃管。（五）稀釋瓶：容量約100mL可滅菌之硼硅玻璃制品。（六）錐形瓶：200至2000mL之可滅菌硼硅玻璃制品。（七）采樣容器：容量120mL以上無(wú)菌之硼硅玻璃瓶或無(wú)菌塑料有蓋容器，或市售無(wú)菌袋。（八）冰箱：溫度能保持在4士2C者。（九）天平：待測(cè)物重量大于2g時(shí)，須能精秤至0.01g;待測(cè)物重量不大于2g時(shí)，須能精秤至0.001g。（十）培養(yǎng)箱：溫度能保持在35±1C者（十二）高壓滅菌釜：溫度能維持在121C（壓力約15lb/in或1.122Kg/cm）滅菌15分鐘以上者（十二）高溫干熱烘箱：如用于玻璃器血等用具之滅菌，溫度須能保持在 160C達(dá)2小時(shí)或170C達(dá)1小時(shí)以上（十三）接種環(huán)：為白金或鎳鉻合金制，適用于細(xì)菌接種或移植，亦可使用無(wú)菌塑料制品（十四）pH計(jì)：精確度達(dá)0.1pH單位。（一）試劑水：蒸餾水或去離子水，導(dǎo)電度在 25C時(shí)小于2Pmho/cm（PS/cm）（二）培養(yǎng)基，應(yīng)使用市售商品化培養(yǎng)基。1、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培養(yǎng)基（ Laurylsulfatetryptosebroth ，簡(jiǎn)稱LST）1倍濃度LST培養(yǎng)基含有下列成份：胰化蛋白胨（Tryptose） 20.0g乳糖（Lactose） 5.0g氯化鈉（NaCl）5.0g磷酸氫二鉀（K2HpO4）2.75g磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.75g硫酸月桂酸鈉（Sodiumlaurylsulfate） 0.1g試劑水 1L配成2倍濃度（取71.2gLST培養(yǎng)基粉末溶于1L試劑水），完全溶解后，分取10mL注入裝

有倒置發(fā)酵管之試管內(nèi)， 經(jīng)121C滅菌15分鐘，冷卻后備用，滅菌后培養(yǎng)基之pH值應(yīng)在6.8±0.2滅菌后培養(yǎng)基若未當(dāng)日使用，應(yīng)保存在 4±2C,保存期限為14天?？筛鶕?jù)檢驗(yàn)需求量，依配方配制培養(yǎng)基。2、煌綠乳糖膽汁培養(yǎng)基（Brilliantgreenlactosebilebroth ，簡(jiǎn)稱BGLB）1公升的BGLB培養(yǎng)基中含有下列成份：蛋白胨（Peptone）乳糖（Lactose）10.0g牛膽粉（OxgallPowder）20.0g煌綠色10.0g試劑（BrilliantGreen）0.0133g試劑水1L取40gBGLB培養(yǎng)基粉末溶于1L試劑水，完全溶解后，分取5至10mL注入裝有倒置發(fā)酵管之試管內(nèi)，經(jīng)121C滅菌15分鐘，冷卻后備用，其pH值應(yīng)在7.2士0.2。滅菌后培養(yǎng)基若未當(dāng)日使用，應(yīng)保存在4士2C,保存期限為14天?？筛鶕?jù)檢驗(yàn)需求量，依配方配制培養(yǎng)基。（三）無(wú)菌稀釋液磷酸二氫鉀儲(chǔ)備溶液取3.4g磷酸二氫鉀（KHPQ）溶于50mL的試劑水中，俟完全溶解后，以1.0NNaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值為7.2士0.1,然后加試劑水至100mL，滅菌（過濾滅菌或121C高溫高壓滅菌15分鐘）后儲(chǔ)存于冰箱中備用。4士2C下保存期限為3個(gè)月。氯化鎂儲(chǔ)備溶液取8.1g氯化鎂（MgCb?6fQ）,先溶于少量試劑水，俟完全溶解后，再加試劑水至全量為100mL，滅菌（過濾滅菌或121C高溫高壓滅菌15分鐘）后，儲(chǔ)存于冰箱中備用。4士2C下保存期限為3個(gè)月。無(wú)菌稀釋液分別取10mL氯化鎂儲(chǔ)備溶液和2.5mL磷酸二氫鉀儲(chǔ)備溶液再加入試劑水至2,000mL，混搖均勻后，分裝于稀釋瓶中，經(jīng) 121C滅菌15分鐘，作為無(wú)菌稀釋液備用。如欲用于水樣稀釋，分裝之無(wú)菌稀釋液滅菌后體積須為90士2.0mL。4士2C下保存期限為3個(gè)月。六、采樣與保存（一）盛裝水樣檢驗(yàn)微生物之容器，應(yīng)使用清潔并經(jīng)滅菌之玻璃瓶或無(wú)菌塑料容器或市售無(wú)菌采樣袋，且于采樣時(shí)應(yīng)避免受到污染。水樣若含有余氯時(shí)，無(wú)菌容器中應(yīng)加入適量之無(wú)菌硫代硫酸鈉（采取加氯之廢水時(shí)，每100mL水樣中加入0.1mL、10%硫代硫酸鈉可還原15mg/L/L。）。（二）采樣前應(yīng)清潔手部，再行采水樣，所采水樣應(yīng)具有代表性。4±2Co（三）運(yùn)送時(shí)水樣溫度應(yīng)維持在小于4±2Co（一）4、），并置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（四（一）4、），并置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（五）水樣量須以能做完所需檢驗(yàn)為度，但不得少于 120mLo七、步驟試驗(yàn)分兩階段進(jìn)行。首先進(jìn)行推定試驗(yàn)，若推定試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性反應(yīng)，則繼續(xù)進(jìn)行第二階段之確定試驗(yàn)，如結(jié)果仍是陽(yáng)性反應(yīng)則顯示有大腸桿菌群存在。各試驗(yàn)步驟如下述：（一）推定試驗(yàn)1、慎選發(fā)酵管中沒有氣泡且未污染之 10mL、2倍濃度LST試管。水樣在進(jìn)行檢測(cè)或稀釋之前必須劇烈搖晃 25次以上，以使樣品充分混搖均勻。視水樣中微生物可能濃度范圍進(jìn)行水樣稀釋步驟，使用無(wú)菌吸管吸取 10mL水樣至90mL無(wú)菌稀釋液中，形成10倍稀釋度水樣，混合均勻，而后自10倍稀釋度水樣以相同操作方式進(jìn)行一系列適當(dāng)之100、1000、10000倍等稀釋水樣，進(jìn)行稀釋步驟時(shí)，均需更換無(wú)菌稀釋吸管，水樣稀釋步驟如圖一所示（注1）o以無(wú)菌吸管分別取各稀釋度 10mL水樣至內(nèi)含10mL2倍濃度的LST試管中，每一稀釋度各作 5支，小心混合均勻，混合后發(fā)酵管內(nèi)不可產(chǎn)生氣泡。5、在35±1C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48士3小時(shí)，觀察并記錄發(fā)酵情形，若有氣體產(chǎn)生則推定試驗(yàn)為陽(yáng)性反應(yīng)，若無(wú)氣體產(chǎn)生則推定試驗(yàn)為陰性反應(yīng)，但若培養(yǎng)液呈混濁狀態(tài)，雖無(wú)產(chǎn)氣，亦應(yīng)進(jìn)行確定試驗(yàn)。（二）確定試驗(yàn)若推定試驗(yàn)之發(fā)酵管中有氣體或混濁產(chǎn)生時(shí)，則使用 BGLB進(jìn)行確定試驗(yàn)：1、慎選發(fā)酵管中沒有氣泡且未污染之 BGLB試管。2、利用無(wú)菌接種環(huán)自產(chǎn)生氣體以及混濁之 LST培養(yǎng)基試管中，接種一圈培養(yǎng)液至 BGLB培養(yǎng)基試管中。4、在48士3小時(shí)內(nèi)，BGLB培養(yǎng)基試管如有氣體產(chǎn)生，則確定試驗(yàn)為陽(yáng)性反應(yīng)。八、結(jié)果處理（一）經(jīng)確定試驗(yàn)確認(rèn)BGLB試管為陽(yáng)性反應(yīng)后，應(yīng)以「 100mL水中最大可能數(shù)（乂「^100mL）」計(jì)算及記錄。5支發(fā)酵管連續(xù)三種稀釋度之 MPN可查表一。（二）表一所示接種之水樣量為10mL、1.0mL及0.1mL，若所用之稀釋度有三種以上時(shí)，采用最具意義之三種稀釋度，查表后再計(jì)算 100mL水中大腸桿菌群最大可能數(shù)。稀釋度之選取方式如下：TOC\o"1-5"\h\z1、先選取5管均呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度（此時(shí)稀釋度較低之各組試管必須全部呈陽(yáng)性反應(yīng)），再選取下兩個(gè)稀釋度（如表二水樣別 a）。2、如果稀釋度最低的一組并非5管均呈陽(yáng)性反應(yīng)，則選取稀釋度最低的一組，再選取下兩個(gè)稀釋度（如表二水樣別b、c）。3、如果依據(jù)上述原則（1、及2、）選取 3個(gè)稀釋度后，下一稀釋度試管組仍有陽(yáng)性反應(yīng)試管，則舍棄原先3組中稀釋度最低的一組，納入下一稀釋度的數(shù)據(jù)（如表二水樣別 d）o4、如果依據(jù)上述原則（1、至3、）選取 3個(gè)稀釋度后，更高稀釋度之試管組仍有陽(yáng)性反應(yīng)試管，則把更高稀釋度之陽(yáng)性反應(yīng)試管數(shù)加至原先 3組中稀釋度最高的一組（如表二水樣別 e）o（三）100mL水中大腸桿菌群最大可能數(shù)（MPN/100mL）之計(jì)算公式如下:查表所得之^PN值燈［I大腸樣因腳取大可目建攵 m=最具意羲三槿稀釋度之最大水檬器（S結(jié)果小于100時(shí)，以整數(shù)表示（小數(shù)字?jǐn)?shù)四舍五入），菌落數(shù)大于100以上時(shí)，只取兩位有效數(shù)字：例如110以1.1X102表示，16,000以1.6X104表示。（四）檢測(cè)紀(jì)錄須注明采樣時(shí)間、培養(yǎng)起始及終了時(shí)間、培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)溫度及各稀釋度的數(shù)據(jù)等相關(guān)數(shù)據(jù)。九、質(zhì)量管理（一）微生物采樣人員及檢測(cè)人員應(yīng)具備微生物基本訓(xùn)練及知識(shí)。（二）每批次采樣時(shí)應(yīng)進(jìn)行運(yùn)送空白。（三）每批次或每10個(gè)水樣需進(jìn)行試劑空白實(shí)驗(yàn)。（四）新購(gòu)入之培養(yǎng)基，每批號(hào)均須以大腸桿菌群陽(yáng)性控制菌株（如E.coli、Enterobacteraerogenes、Citrobacterfreundii）進(jìn)行測(cè)試，以確保數(shù)據(jù)質(zhì)量。（五）若一季期間水樣均未檢出大腸桿菌群，則須以大腸桿菌群菌株進(jìn)行培養(yǎng)基測(cè)試，以確保數(shù)據(jù)質(zhì)量。（六）本方法培養(yǎng)所得之細(xì)菌可能具有感染性，檢測(cè)后之培養(yǎng)基及器血應(yīng)經(jīng)高溫高壓滅菌處理。十、精密度及準(zhǔn)確度略十一、參考數(shù)據(jù)（一）APHA.2005.StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater,21stEdition,Section9221.AmericanPublicHealthAssociation,Washington,D.C.（二）Difco&BBLManual:ManualofMicrobiologicalCultureMedia.2003.BDDiagnosticSystems.注1：水樣如須稀釋，建議于稀釋后30分鐘內(nèi)完成檢測(cè)步驟，以免造成細(xì)菌死亡或增生，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果lOmL1OmL10信憫水才票lOmL1CC倍稀釋水lOniL協(xié)囿倍稀釋水榛lOmL1OmL10信憫水才票lOmL1CC倍稀釋水lOniL協(xié)囿倍稀釋水榛io倍100?1000稀釋水梯1U0叩倍分別取IQmL10倍稀釋水棣至5支2涪減度L^T培餐基之^管▼分月瞰10mL100倍棉釋水棣圭5支2倍浸度LST培董基之^管▼分另咽'只10mL1000衙酈水梯至5支2倍浸度LST培董阜之^管分另瞰10mL10QOQ倍稀釋水棣至、支2倍浸度LST培董基MPN旨數(shù)及MPN旨數(shù)及95%言賴區(qū)間三連續(xù)稀釋度（10mL、1mL、0.1mL）五試管重復(fù)測(cè)試時(shí)，陽(yáng)性結(jié)果組合之陽(yáng)性反應(yīng)組合MPN/100mL95%信賴區(qū)間陽(yáng)性反應(yīng)組合MPN/100mL95%言賴區(qū)間下限上限下限上限0-0-0<1.86.84-0-3259.8700-0-11.80.0906.84-1-0176.0400-1-01.80.0906.94-1-1216.8420-1-13.60.70104-1-2269.8700-2-03.70.70104-1-33110700-2-15.51.8154-2-0226.8500-3-05.61.8154-2-1269.8701-0-02.00.10104-2-23210701-0-14.00.70104-2-338141001-0-26.01.8154-3-0279.970

1-1-04.00.71124-3-13310701-1-16.11.8154-3-239141001-1-28.13.4224-4-034141001-2-06.11.8154-4-140141001-2-18.23.4224-4-247151201-3-08.33.4224-5-041141001-3-1103.5224-5-148151201-4-0103.5225-0-0236.8702-0-04.50.79155-0-13110702-0-16.81.8155-0-243141002-0-29.13.4225-0-358221502-1-06.81.8175-1-033101002-1-19.23.4225-1-146141202-1-2124.1265-1-263221502-2-09.33.4225-1-384342202-2-1124.1265-2-049151502-2-2145.9365-2-170221702-3-0124.1265-2-294342302-3-1145.9365-2-3120362502-4-0155.9365-2-4150584003-0-07.82.1225-3-079222203-0-1113.5235-3-1110342503-0-2135.6355-3-2140524003-1-0113.5265-3-3170704003-1-1145.6365-3-4210704003-1-2176.0365-4-0130364003-2-0145.7365-4-1170584003-2-1176.8405-4-2220704403-2-2206.8405-4-32801007103-3-0176.8405-4-43501007103-3-1216.8405-4-543015011003-3-2249.8705-5-0240707103-4-0216.8405-5-135010011003-4-1249.870