實驗十三流式細(xì)胞技術(shù)檢測腫瘤治療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋

實驗十三流式細(xì)胞技術(shù)檢測腫瘤治療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡指導(dǎo)教師：唐穎1.實驗?zāi)康牧私饧?xì)胞凋亡、及流式細(xì)胞技術(shù)原理等基本知識。學(xué)習(xí)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測的方法。學(xué)習(xí)流式細(xì)胞技術(shù)標(biāo)本的制作方法，了解流式細(xì)胞儀的使用。2.實驗原理2.1細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)知識2.2流式細(xì)胞技術(shù)的一般原理及應(yīng)用2.3用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的原理2.1細(xì)胞凋亡的基本知識：定義：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定程序控制下的自主死亡過程。細(xì)胞凋亡同細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化一樣是機(jī)體生存和發(fā)育離不開的最基本的生物現(xiàn)象，通過凋亡可以平衡機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目，清除衰老、過剩、有害的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡異常會引起免疫性疾病或腫瘤等。

（一）、細(xì)胞壞死是細(xì)胞受到急性強(qiáng)力傷害時立即出現(xiàn)的反應(yīng)。早期表現(xiàn)為細(xì)胞膜破壞，線粒體腫脹。繼而溶酶體破裂,細(xì)胞內(nèi)容物流出,引起炎癥。細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別（二）細(xì)胞凋亡cellapoptosis

Kerr（1972）最先提出，與細(xì)胞壞死的區(qū)別是：①細(xì)胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體；②凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器；③不引起炎癥；④線粒體無變化，溶酶體活性不增加；⑤內(nèi)切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖譜呈梯狀；⑥凋亡通常是生理性變化，而細(xì)胞壞死是病理性變化。細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別胸腺細(xì)胞正常凋亡形態(tài)學(xué)檢測流式細(xì)胞法檢測DNALadder檢測熒光法檢測凋亡鑒定方法2.2流式細(xì)胞技術(shù)的一般原理及應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry)是以流式細(xì)胞儀(flowcytometer，F(xiàn)CM)為工具，在液流系統(tǒng)中對懸液中的單個細(xì)胞、細(xì)胞器或生物粒子的生物、物理和化學(xué)特性進(jìn)行快速測量并自動分析，并根據(jù)這些特性將所需要的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類收集的高技術(shù)。它的主要特點是，可以在單細(xì)胞水平上對大量細(xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、多參數(shù)的定量分析及分選，借此判斷細(xì)胞的體積、DNA含量、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細(xì)胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)，并可在無菌狀態(tài)下，對活細(xì)胞進(jìn)行分類收集，收集的純度可達(dá)99％。

流式細(xì)胞儀儀工作原理理流式細(xì)胞儀儀（FlowCytometer））集激光技技術(shù)、電子子物理技術(shù)術(shù)、光電測測量技術(shù)、、電子計算算機(jī)技術(shù)、、細(xì)胞熒光光化學(xué)技術(shù)術(shù)、單克隆隆抗體技術(shù)術(shù)為一體的的一種新型型高科技儀儀器。散射光信號號FALS

SensorLaser散射光信號號RightAngleLightDetectorCellComplexitySSCForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSCIncidentLightSource前向角散射射光（FSC,ForwardScatter）細(xì)胞相對大大小及其表表面積側(cè)向角散射射光（SSC,SideScatter））細(xì)胞顆粒度度及細(xì)胞內(nèi)內(nèi)細(xì)胞器的的相對復(fù)雜雜性外周全血細(xì)細(xì)胞散射光光雙參數(shù)點點圖（紅細(xì)細(xì)胞溶解后后）流式細(xì)胞儀儀的檢測信信號熒光信號使用熒光標(biāo)標(biāo)記的單克克隆抗體染染色，做多多色分析熒光信號的的強(qiáng)弱，反反映了細(xì)胞胞抗原的表表達(dá)含量熒光信號雙色直接染染色數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)存儲:LISTMODE數(shù)據(jù)顯示:直方圖(Histogram)二維點圖(DotPlot)等高線圖(ContourPlot)密度圖(Density)三維圖（3DPlot）等等數(shù)據(jù)分析直方圖分析析數(shù)據(jù)分析點圖分析數(shù)據(jù)分析等高圖和密密度圖分析析2.3用用流式細(xì)胞胞術(shù)檢測細(xì)細(xì)胞凋亡的的原理利用流式細(xì)細(xì)胞儀測定定細(xì)胞光散散射可對凋凋亡細(xì)胞進(jìn)進(jìn)行分析。。凋亡早期期細(xì)胞因體體積減小，，胞漿及染染色質(zhì)固縮縮，F(xiàn)SC變小，SSC增大大，凋亡晚晚期細(xì)胞FSC、SSC均變變小，壞死死細(xì)胞則因因細(xì)胞膜通通透性改變變，細(xì)胞腫腫脹，F(xiàn)SC、SSC變大，，胞膜破裂裂，胞內(nèi)含含物釋出后后FSC、、SSC均均變小。用流式細(xì)胞胞儀也可以以根據(jù)DNA含量不不同，從細(xì)細(xì)胞群體中中鑒別凋亡亡細(xì)胞。凋凋亡細(xì)胞在在G1峰前前出現(xiàn)亞二二倍體峰，，即凋亡峰峰（Ap峰峰）。通過過此峰下的的面積值可可得出凋亡亡細(xì)胞在所所測細(xì)胞群群中所占的的比率（用用凋亡軟件件定量）。。另外外，，細(xì)細(xì)胞胞凋凋亡亡受受基基因因調(diào)調(diào)控控，，有有賴賴于于某某些些蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)的的合合成成，，用用流流式式細(xì)細(xì)胞胞儀儀可可同同時時測測定定凋凋亡亡細(xì)細(xì)胞胞的的FSC/SSC及及DNA/蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)，，進(jìn)進(jìn)行行多多參參數(shù)數(shù)分分析析以以研研究究不不同同的的凋凋亡亡誘誘導(dǎo)導(dǎo)作作用用機(jī)機(jī)制制。。3.實實驗驗材材料料、、用用品品實驗驗材材料料：：培培養(yǎng)養(yǎng)的的Hela細(xì)細(xì)胞胞實驗驗用用品品：：①儀儀器器與與用用具具C02培培養(yǎng)養(yǎng)箱箱，，超超凈凈工工作作臺臺，，倒倒置置顯顯微微鏡鏡和和離離心心機(jī)機(jī)等等。。微量量加加樣樣器器(1μμl-1ml)，，0.5ml和和1.5ml的的Eppendorf管管，，20μμl、、200μμl和和1ml吸吸頭頭，，10ml培培養(yǎng)養(yǎng)瓶瓶，，載載玻玻片片，，蓋蓋玻玻片片等等。。②試試劑劑放射射線線菌菌素素D（（誘誘導(dǎo)導(dǎo)細(xì)細(xì)胞胞凋凋亡亡的的腫腫瘤瘤治治療療藥藥物物，，如如喜喜樹樹堿堿、、紫紫杉杉醇醇、、中中藥藥砒砒霜霜等等））；；熒熒光光探探針針：：用用PBS(pH7.4)將將PI配配成成500μμg/ml的的貯貯液液，，在在-20℃℃凍凍存存。。FACSCalibur,BDBioscience4.實實驗驗步步驟驟Hela細(xì)細(xì)胞胞的的傳傳代代培培養(yǎng)養(yǎng)誘導(dǎo)導(dǎo)細(xì)細(xì)胞胞凋凋亡亡：：向向?qū)?shù)數(shù)生生長長期期細(xì)細(xì)胞胞中中加加入入放放射射線線菌菌素素D（（可可結(jié)結(jié)合合科科研研采采用用其其他他誘誘導(dǎo)導(dǎo)細(xì)細(xì)胞胞凋凋亡亡的的腫腫瘤瘤治治療療藥藥物物））分分別別為為0.25、、0.5、、1、、2、、4mg/L,作作用用6小小時時。。用胰胰酶酶消消化化以以上上五五個個樣樣本本以以及及對對照照的的細(xì)細(xì)胞胞，，吹吹打打收收集集于于離離心心管管中中，，1000r/min下下離離心心8分分鐘鐘，，倒倒去去上上清清。。加約約1mlPBS重重懸懸細(xì)細(xì)胞胞，，用用注注射射器器迅迅速速注注入入到到4ml4℃℃的的70%的的酒酒精精中中，，固固定定8小小時時以以上上。。去上上清清，，用用PBS4ml重重懸懸細(xì)細(xì)胞胞，，再再1000r/min下下離離心心8分分鐘鐘，，去去上上清清控控干干液液體體后后加加0.3mlPBS，，加加入入RNA酶酶A至至終終濃濃度度為為50ug/ml，，37℃℃孵孵育育30分分鐘鐘。。將樣樣品品插插到到冰冰浴浴中中，，停停止止酶酶的的作作用用。。待待冷冷卻卻后后加加入入50ug/ml的的PI1.5ml,放放于于冰冰上上在在冰冰箱箱中中染染色色至至少少30分分鐘鐘。。3個個小小時時之之內(nèi)內(nèi)在在流流式式細(xì)細(xì)胞胞儀儀上上檢檢測測樣樣品品。。5.實實驗驗結(jié)結(jié)果果正常常凋亡亡化療療前前后后胃胃癌癌活活檢檢標(biāo)標(biāo)本本中中Caspase-3+細(xì)細(xì)胞胞化療療前前(3.49%)化療療后后(94.86%)26KeylabofMedicineSchoolofSuZhouUniversity細(xì)胞胞凋凋亡亡————PI分分析析PI-Fluorescence#Events凋亡亡細(xì)細(xì)胞胞正常常G0/G1期期細(xì)細(xì)胞胞6.注注意意事事項項細(xì)胞胞數(shù)數(shù)目目要要充充分分；；為為防防止止細(xì)細(xì)胞胞成成團(tuán)團(tuán)，，可可在在用用流流式式檢檢測測前前用用篩篩網(wǎng)網(wǎng)過過濾濾。。可結(jié)結(jié)合合科科研研，，將將課課題題組組項項目目中中研研究究的的一一些些凋凋亡亡誘誘導(dǎo)導(dǎo)劑劑作作為為研研究究對對象象進(jìn)進(jìn)行行分分析析。。并并在在此此綜綜合合實實驗驗中中掌掌握握動動物物細(xì)細(xì)胞胞的的傳傳代代技技術(shù)術(shù)，，細(xì)細(xì)胞胞凋凋亡亡的的形形態(tài)態(tài)學(xué)學(xué)分分析析及及流流式式細(xì)細(xì)胞胞技技術(shù)術(shù)。。7.思思考考題題制備備流流式式樣