課題需要交東西

中 英 文獻(xiàn)綜 分析討 參考文 個(gè)人簡(jiǎn) 目的HepG2細(xì)胞的促凋亡壞死作用實(shí)方法為了用濃度梯度結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)藥物濃度自動(dòng)分配應(yīng)用于藥物篩選中，應(yīng)用Auto-CAD2015軟件設(shè)計(jì)、改良并采用軟光刻技術(shù)、模塑法及等離子鍵合等技術(shù)然后通過LIVE/DEAD試劑盒和熒光染色等方法和檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，來驗(yàn)HepG2細(xì)胞的凋亡作用并與傳統(tǒng)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：完成了微流控的制作與檢測(cè)。通過微流控系統(tǒng)中孵育的HepG2細(xì)7天(168h)的培養(yǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，其形態(tài)特征與常規(guī)培養(yǎng)方式培養(yǎng)得到的細(xì)胞并無明顯差別，經(jīng)LIVE/DEAD72h內(nèi)的細(xì)胞存活率，達(dá)到97%以上基于集成有濃度梯度結(jié)構(gòu)微流控技術(shù)的水紅花子抗肝癌作用HepG2細(xì)胞有一定的抑制作用，且這種抑制作用隨著給藥濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，呈現(xiàn)出一定的濃度-效應(yīng)及時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，同時(shí)基于微的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期完成的體外藥效結(jié)果基本一致，證明了的可行性。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)基于微流控技術(shù)證實(shí)了水紅花子有效組分對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有明顯的促凋亡作用。說明實(shí)驗(yàn)自主構(gòu)建的微流控系統(tǒng)具有良好的適用性，：微流控；水紅花子；抗肝癌作用；藥物篩選；HepG2細(xì)Thebackgroundofthisprojectisbasedonthemicrofluidictechnology.Designedandfabricatedthemicrofluidicchipsforanti-tumordrugscreening,anduseittocompletetheresearchoftheapoptoticeffectoftheeffectivecomponentsinPolygonumorientaleL.onhepatocellularcarcinomaHepG2cells.Wecomparedtheresultsgottotheformerpesticideeffectsgotfromtraditionalinvitroexperimentstotesttheaccuracyoftheexperimentsoperatedinchipsandtoverifytheapplicabilityforthechip-drugscreening.Throughtheresearchwe’dliketoprovideatheoreticalbasisfortheapplicationandpopularizationofmicrofluidictechnologyinthefieldofresearchinganddevelonewdrugsoftraditionalChinesemedicineinanti-tumor,toprovideanewideaandmethodfortherapidscreeningandresearchingofanti-tumordrugs,especiallythetraditionalChineseMedicineinourcountry,andplayapositiveroleinexploringtheoriginalinnovationandintegratedapplicationofthekeytechnologyresearchanddevelopmentofnewdrugsinChina.MaterialandUsingakindofmicrofluidicchipthatcontainedtheconcentrationgradientgeneratestructurewhichwe’dliketoapplyitsautomaticgeneratefunctiontodrugscreening.Manufacturedandoptimizedtheenvironmentcontrolsystemmatchingwiththechip.Testifiedthepropertyofthesystemandchipbythelong-timecellcultureanddetecteditsmerisisstatus.Using3times6timestheamountof60%ethanolextractionmethodfortheseparationofeffectivecomponentsPolygonumorientaleL.andusethechiptocompletetheapoptoticeffectofPolygonumorientaleL.effectivecomponensonhepatocellularcarcinomaHepG2cellsandcomparedtheresultswiththeformerdatagotfromthetraditionalexperimentsinvitro.Completedthechipsmentionedabove.TheHepG2cellsculturedinthechipsystemshowasatisfyinglivingstateafter7days’experiments,thepatternofwhichshownoobviousdifferenceswiththatculturedinthetraditionalways.Thelivabilityofthecellsin72hismorethan97%calculatedwiththeLIVE/DEADdyeingmethod.TheapoptosisandnecrosiseffectonHepG2cellsfromtheeffectivesubstancesgroupofPolygonumorientaleL.basedonmicrofluidicchipshowstheeffectivecomponentsinPolygonumorientaleL.havesomeinhibitoryeffectonHepG2cells,andthisinhibitionincreasedwiththeincreasingdrugconcentrationandstimulateduration,havethedose-effectandtime-effectrelationship.Andwecomparedtheresultswiththeformerdatagotfromthetraditionalexperimentsinvitro,theyarebasicallythesame,proveditsapplicability.ThecomponentsinPolygonumorientaleL.showanobviousapoptosisfunctiononHepG2cellsinthechip,proveditsauthenticityandtheresultsshowthatthemicrofluidicbasedsystemconstructedourselvesgaveagoodapplicability,whichprovideanewtrainofthoughtandmethodforanti-tumordrugscreening.Keyword：Microfluidicchip;PolygonumorientaleL.;drugscreening;Cells上世紀(jì)90年代初，nz等首次提出微流控技術(shù)（icrofluidic），又稱為（bonahipO近年來該技術(shù)發(fā)展極為迅速其在抗試劑消耗低分析速度快高通量輸出多指標(biāo)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)微流控能克服新的希望1]。微流控技術(shù)在細(xì)胞研究方面具有多種優(yōu)勢(shì)，比如具有微小的空間環(huán)境使得通有大的表面積/體積比，從而使界面用來進(jìn)行物質(zhì)等,]。。微流控作為的操作平臺(tái)是微流控分析系統(tǒng)的重要組成部分因此對(duì)承載有不同功能的進(jìn)行構(gòu)建顯得尤為重要的構(gòu)建實(shí)際上就是根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求對(duì)的材料結(jié)構(gòu)尺寸進(jìn)行界定使其具有特定的功能同時(shí)采用一定的技術(shù)方法將其制作出來并應(yīng)用于研究的設(shè)計(jì)和制作是構(gòu)建微流控分析系統(tǒng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)也是進(jìn)行細(xì)胞研究和藥物篩選的前提和基礎(chǔ)未來微流控的創(chuàng)新首先將是設(shè)計(jì)和制作方面的創(chuàng)新本章的研究?jī)?nèi)容即為對(duì)抗腫瘤藥物篩選微流控細(xì)胞進(jìn)行構(gòu)建，結(jié)合制圖軟件TO設(shè)計(jì)并優(yōu)化結(jié)構(gòu)同時(shí)采用價(jià)格低廉加工簡(jiǎn)便且具有良好生物兼容性更利于細(xì)胞培養(yǎng)的有機(jī)聚合物聚二甲基硅氧烷（PS）5為主要材料，借助于軟光刻技術(shù)及模塑法對(duì)實(shí)驗(yàn)所用微流控進(jìn)行鑄造。。本課題將全球疾病熱點(diǎn)問題（）與全球高新技術(shù)（微流控技術(shù)）微流控技術(shù)研究進(jìn)至關(guān)鍵作用。著21世紀(jì)科技發(fā)展中眾多，分析儀器和分析科學(xué)的、帶有性的重要轉(zhuǎn)折時(shí)期。在當(dāng)前發(fā)展較快的微分析系統(tǒng)中，以1990年由的Manz和Widmer首先“微全分析系統(tǒng)”(MicroTotalysisSystems，即μTAS)和目前較多的“生物”(Biochips)或稱“微陣列芯片”(Microarraychips)的發(fā)展勢(shì)頭最為猛烈。在μTAS中，微流控系統(tǒng)(Microfluidicchipsystems)也通俗地稱為“建在上的”(Lab-on-a-chip)或點(diǎn)，其中依據(jù)結(jié)構(gòu)及工作機(jī)理又可分為微陣列(生物)和μTAS中的微流微全分析系統(tǒng)的概念是1990年首次由Ciba-Geigy公司的Manz與Widmer提出[6]，當(dāng)時(shí)主要強(qiáng)調(diào)了分析系統(tǒng)的“微”與“全”及微管道網(wǎng)絡(luò)的MEMS加工方法，而并未明確其特征。次年Manz等在平板微上實(shí)現(xiàn)了毛細(xì)管電泳1cm，面積為幾平方厘米至幾十平方厘米的平板[7]。但在1994年之前，這一新領(lǐng)域的發(fā)展前景并不十分。1994年開始，橡樹嶺國(guó)家的Ramsey等人在Manz的工作基礎(chǔ)上了一系列，改進(jìn)了毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方法，提高了其性能與實(shí)用性，引起了更廣泛的關(guān)注[8-10]。在此形勢(shì)下，該年首屆μTAS會(huì)議以的形式在荷蘭Enchede舉行，起到了推廣微全分析系統(tǒng)的作用。1995年加州大學(xué)Berkeley分校的Mathies等研究[9]在微流控上實(shí)現(xiàn)了DNA高速，微流控的商業(yè)開發(fā)價(jià)值開始顯現(xiàn)，而此時(shí)微陣列型的生物已進(jìn)入實(shí)質(zhì)性的商品開發(fā)階段1996年Mathies等[10]又將分析中有泳DNA從而為微流控在分析中的實(shí)際應(yīng)用提供了重要基礎(chǔ)2000年5月第4屆μTAS會(huì)議的召開是對(duì)微全分析系統(tǒng)發(fā)展的一次全面它預(yù)示著微全分析系統(tǒng)的一個(gè)更大的發(fā)展即將到來，這一在21世紀(jì)初即得到體可控的微小平臺(tái)上靈活組合、規(guī)模集成。Grover等[11]研制的微型毛細(xì)管電泳系統(tǒng)是由4層厚度僅為4mm的組成的，且儀器整體體積小，Mitc不需要任何樣品以及處理過程。Hisamoto等[13]成功研制了將多種化學(xué)功（混合反應(yīng)化學(xué)修飾等都集中到一個(gè)微上進(jìn)行的毛細(xì)管電泳體系unte等[14]研制出的微流控可實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣、衍生分離依次有序進(jìn)行。Fru課題組[15]介紹了一種手掌大小的便攜式電泳置，內(nèi)置兩套獨(dú)立的電泳分離單林金明[16-19]等課題組都進(jìn)行了小型化儀器的研究微流控分析的制作工酯PC）以及水凝膠等。微流控分析的構(gòu)造一般為兩片平板玻璃或高分子在任意一片上還有通道的。面積一般為數(shù)平方厘米，通道尺度約為20~100μm寬，10~30μm深，液體的總體積多在nL(10-9L)水平，最常用的控制液樣的計(jì)量混合反應(yīng)加溫分離與轉(zhuǎn)移等幾乎分析中的所有常規(guī)操作橫的短通道為試樣通道，豎的長(zhǎng)通道為分離通道。試樣通道左側(cè)液池中裝有試樣，其他3個(gè)液池中均裝有分離緩沖液。液池中電極后，先在試樣通道兩端配備較低標(biāo)準(zhǔn)的潔凈室（100010000級(jí)），在潔凈室內(nèi)安裝一個(gè)超凈工作臺(tái)使其臺(tái)面達(dá)到100級(jí)別的工作區(qū)借以完成制作的一些關(guān)鍵工序?，F(xiàn)已有人采用家用微波爐實(shí)現(xiàn)了PDMS的封接，該方法操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)適。微流控分析化學(xué)單元技。 。，使這些操作置于樣品引入之后樣品預(yù)處理單元同時(shí)要與外部樣品源和后續(xù)樣品處理單元偶聯(lián)因此樣品預(yù)處理具有技術(shù)含量高操作難度大等特點(diǎn)，其中固相萃取的富集倍數(shù)有時(shí)可達(dá)到103級(jí)別，并且較易在上實(shí)現(xiàn)，是，片反應(yīng)器傳質(zhì)傳熱較快，反應(yīng)條件（如溫度、PH值等）更加容易控制。早期的微流控在某種意義上是一種微分離器件微分離已經(jīng)成為微流，控的發(fā)展。電泳是微分離中采用的最為常用的式電，微流控在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)離子分析在環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)以及食品工業(yè)等許多領(lǐng)域中都有重要的用微流控技術(shù)在離子分析領(lǐng)域取得了很多研究成果金屬離子雖然、、2等調(diào)控著重要的離子通道，F(xiàn)2、Zn2等是金屬酶的重要配體。等速電泳(IT)是rt等[20]在硅膠上利用ITP技術(shù)，通過電導(dǎo)檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了對(duì)、+的分離分析熒光檢測(cè)是微流控中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)金屬離子通常不含有熒光基團(tuán)，需要經(jīng)過衍生后才能進(jìn)行熒光檢測(cè)分析。ng等[21]根據(jù)三磷酸腺苷(TP)與鈣吸收反應(yīng)的關(guān)(TP調(diào)控2通道的開關(guān))在微流控上TP濃度改變時(shí)2Fluro3對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，F(xiàn)luro3在胞內(nèi)酶的作用下與a2結(jié)合，激光掃描被標(biāo)記的細(xì)胞即可獲得Fluro32TP溶液流過貼壁細(xì)hler等[22]在微流控上進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)的2離子流量實(shí)驗(yàn)，將衍生然后進(jìn)行激光誘導(dǎo)熒光()(O濃度的對(duì)具有重要意義O很容易被氧化成23對(duì)含量的檢測(cè)多通過檢測(cè)2、3來獲得。iyado等[23]在微流控電泳上檢測(cè)了和唾液中的NO2-、NO3-，并在8s內(nèi)完成了兩種離子的分離代謝是生命的基本特征從有生命的單細(xì)胞到復(fù)雜的都與周圍環(huán)境不能夠幫助人們更好的理解病變過程以及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑微流控技術(shù)為靈活快捷地分析代謝物提供了新的方法，一些代謝物的分離、檢測(cè)已經(jīng)在微流控上得到實(shí)現(xiàn)體液中葡萄糖濃度與多種疾病相關(guān)是代謝物檢測(cè)的重要()氧氣→H202葡萄糖酸這一過程可以方便地在微流控上得到實(shí)現(xiàn)。m等[24]在PS微流控的通道中制作了一個(gè)馬蹄形微柵，微柵上涂有葡萄糖氧化酶)。樣品流經(jīng)通道時(shí)X2CSrinivn等[25]采用離散進(jìn)樣的方式測(cè)定了、血漿、尿液、唾液等液體中的20Hz(urcid，uA)是嘌呤代謝的最終產(chǎn)液中uAv等[26]通過化學(xué)發(fā)光法在微流控上實(shí)現(xiàn)了對(duì)中尿素含量的檢測(cè)。其做法是將魯米諾和尿酸酶采用溶膠一凝膠的方法分別固定在通道內(nèi)把含有尿酸的人樣品注入，經(jīng)過尿酸酶轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的過氧化氫在P的催化下1100mg/0.1mg/微流控中的多通道技術(shù)可以很好地滿足這一需求ng等[27]構(gòu)建了一種同時(shí)檢測(cè)葡萄糖尿素和抗壞血酸的微流控實(shí)驗(yàn)時(shí)首先讓DNA微流控可用于迅速分離DNA限制性片段PCR產(chǎn)物比常規(guī)的毛細(xì)管電泳分離要快得多。把PCR擴(kuò)增反應(yīng)縮微集成到硅上，β珠蛋白目的進(jìn)15min2min就可完成PCR產(chǎn)物的分離，整個(gè)分析過程不到20min。沙門菌組DNA的PCR產(chǎn)物可在45min內(nèi)分離，不需人工轉(zhuǎn)移其產(chǎn)物，而且可實(shí)時(shí)控制PCR的擴(kuò)增。簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增人組DNA，產(chǎn)物小于25bp時(shí)可引入用于進(jìn)一步雜交點(diǎn)突變多組分的PCR分析Larry等[28]設(shè)計(jì)混合樣品多PCR產(chǎn)物電泳分離，可同時(shí)分析10個(gè)以上PCR反應(yīng)DNA的重復(fù)三聯(lián)體序列，分離速度是常規(guī)毛細(xì)管電泳的十幾倍。[29]以及對(duì)單細(xì)胞不同部位的環(huán)境刺激。Takayama等[31]利用微管道層流技術(shù)實(shí)現(xiàn)了均一性。Skelley等[32]設(shè)計(jì)了一種單細(xì)胞捕獲與融合陣列，能夠連續(xù)進(jìn)行單個(gè)不同種類細(xì)胞的高通量捕獲(6000個(gè)單細(xì)胞捕獲)、配對(duì)和融70%50%，比常規(guī)的細(xì)胞電融4倍。Ye等[33]構(gòu)建了一種用于高通量藥物誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡研究的集成微流控系統(tǒng)。在上設(shè)計(jì)了一組濃度梯度發(fā)生器，可實(shí)現(xiàn)單個(gè)內(nèi)藥物濃度的系列化，該可完成不同濃度藥物對(duì)微腔陣列內(nèi)腫瘤細(xì)胞的作用研究微流控的種動(dòng)物細(xì)胞上述的基本細(xì)胞培養(yǎng)以外研究者還開展了大量基于微流控的正常細(xì)胞和腫的微流控應(yīng)用不斷涌現(xiàn)[36,37]，極大地提高了細(xì)胞分析效率。例如，Sugiura等[38]了一種平行陣列式微腔細(xì)胞可同時(shí)開展7種抗腫瘤藥物對(duì)人宮頸Hela細(xì)胞的抗癌作用研究。沿著仿生模擬的研究方向和思路，使得微流控芯到了充分的展示。Ho等[39]設(shè)計(jì)了一種細(xì)胞捕獲，可以通過底層同能性。Liu等[40]采用集成微流控技術(shù)構(gòu)建了一種用于細(xì)胞與微環(huán)境相互作用動(dòng)態(tài)研究的系統(tǒng)該采用多層軟光刻技術(shù)通動(dòng)微閥控制液流、了在內(nèi)表面處理、細(xì)胞定位裝載以及異型細(xì)胞共培養(yǎng)等連續(xù)化實(shí)驗(yàn)操作，并開展了針對(duì)腫瘤細(xì)胞(HepG2肝癌細(xì)胞)與基質(zhì)細(xì)胞(3T3成纖維細(xì)胞)相互作用的植物細(xì)胞植物界的種類形形、千差萬別。與動(dòng)物相類似，高等植物亦是由大協(xié)作，共同維持整個(gè)有機(jī)體的正常生命活動(dòng)。植物原生，即去除細(xì)胞壁的植究。然而，微流控技術(shù)在植物界的應(yīng)用極少，目前的僅限于少數(shù)種類植物的細(xì)胞原生培養(yǎng)和部分操作研究而且是最近幾年才有所進(jìn)展如2006年Ko等[41]在微管道內(nèi)開展的煙草原生的培養(yǎng)以及細(xì)胞團(tuán)形成實(shí)驗(yàn)。同年，Ju等[42]開展了原材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)對(duì)原生生長(zhǎng)的影響研究。結(jié)果顯示，與常規(guī)玻璃和塑料容器相比，PDMS的透氣性有利于提高原生質(zhì)體的。盡管如此，其實(shí)現(xiàn)的原生率仍處于較低水平?；诖?，開展微流控內(nèi)原生的培養(yǎng)優(yōu)化研究，有利于加快解決難題。Wu等[43]設(shè)計(jì)制備了一種用于開展植物細(xì)胞培養(yǎng)操作的PDMS。該由5條實(shí)驗(yàn)平行微米級(jí)管道構(gòu)成，具有共同的進(jìn)樣口;微管道內(nèi)設(shè)置的微柱陣列能夠有效植物細(xì)胞。該研究實(shí)現(xiàn)了不同培養(yǎng)基條件下的煙草原生優(yōu)化培養(yǎng)，使其在8d內(nèi)成功生長(zhǎng)至細(xì)胞團(tuán)，并進(jìn)一步完成了內(nèi)煙草原生的融合操作。此外，該培養(yǎng)研究實(shí)現(xiàn)的原生一次率在5d內(nèi)達(dá)到了85.6%。微生物 括兩類:一類是對(duì)微生物本身特性、行為學(xué)和組分分析等研究，如Kim等使用一種濃度梯度開展了基于細(xì)菌生物膜的多種不同抗生素藥物敏感性實(shí)驗(yàn)微管道開展的關(guān)于大腸桿菌運(yùn)動(dòng)行為研究[44]，Leadbetter課題組在陣列微流控芯片內(nèi)進(jìn)行的單個(gè)細(xì)菌多種高通量分析研究[45]，以及Stocker等[46]采用層流技術(shù)對(duì)一種源自海洋的假交替單胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)進(jìn)行的快基于細(xì)胞水平的微流控技術(shù)在藥物篩選方面的應(yīng)胞水平高內(nèi)涵藥物篩選微流控平臺(tái)，將細(xì)胞培養(yǎng)、藥物濃度梯度生成、細(xì)胞受激和響應(yīng)等過程完全集成在一塊只有幾平方厘米大小的上完成采用大規(guī)模陣列化集成細(xì)胞技術(shù)實(shí)現(xiàn)的快速、高通量藥物毒性分析與篩選，有望解決紅花子有效組分誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡為模型，在上進(jìn)行了結(jié)果準(zhǔn)確而且有較高效率的實(shí)驗(yàn)。利用該同時(shí)分析藥物作用后細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)、細(xì)胞亡呈現(xiàn)不同的劑量效應(yīng)該充分體現(xiàn)了微流控將多種單元技術(shù)靈活組合著的降低了細(xì)胞和試劑消耗量，具有重大的應(yīng)用前景。但是，微流控技術(shù)作為一種新興產(chǎn)業(yè)還存在很多不足的地方比如目前對(duì)中藥物干預(yù)后的細(xì)胞信息依然需要借助熒光顯微鏡后期拍照分析，其基于微流控技術(shù)的細(xì)胞分析促進(jìn)了該技術(shù)在生命科學(xué)及其相關(guān)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其在活細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)生命活動(dòng)分析，及人類生活實(shí)踐密切境污染物監(jiān)測(cè)和臨床診斷的問世為進(jìn)一步改善和提高人類自身健康及不斷刺激微流控技術(shù)的改良與發(fā)展。從目前基于細(xì)胞水平的微流控發(fā)展趨勢(shì)來看，無論從二維或是三維角展角度而言，微流控的生物多元化應(yīng)用已成為其可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)必然趨命科學(xué)研究中表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。微流控技術(shù)是一門新興的交叉技術(shù)， 水紅花子為蓼科植物紅蓼(PolygonumorientaleL.)的干燥成熟果實(shí)，具有散及肌瘤的治療均有較好效果[48]。為研究和驗(yàn)證水紅花子藥材對(duì)肝腫瘤的影HepG2實(shí)驗(yàn)材儀器和材TG2U型光刻機(jī)（科技）；SC-1B型勻膠機(jī)（創(chuàng)世威納科技）；BP-2B型烘膠臺(tái)（創(chuàng)世威納科技）；XMTD-808P程序溫控儀（余姚江溫度儀表廠）；HC5002型電子天平（溪市衡器實(shí)業(yè)）；SZX9型體式顯微鏡（Olympus公司）；HPDC-32G-2型等離子機(jī)（HarrickPlasma公司）；真空干燥箱（一恒科學(xué)儀器）；Milli-Q超純水處理裝置（Millipore公司）。拋（Micro-Chem公司）；Sylgard184型聚二甲基硅氧烷PDMS和劑（美國(guó)DowCorning公司）。自行設(shè)計(jì)制作的藥物篩選微流控；細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒（Hoechst33342和PI，碧云天生物技術(shù))；LSP04-1A精密注射泵（保定蘭格公司）；HSS型電子恒溫水浴鍋（實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠）；NUAIRETMUSAUTOFLOWCO2培養(yǎng)箱（NUAIRE公司AE31SORVALLfresco高速離心機(jī)（科峻儀器公司）?？刂破鳎≒LC）、微型電磁閥、Arduino控制板、PID溫度控制器、微型位置伺DMEM高糖培養(yǎng)基粉末（GIBCO公司）；胰蛋白酶-0.02%EDTA，胎牛FBS(杭州四季青生物工程材料)，二甲基亞砜DMSO（索聚L-賴氨酸（Poly-L-Lysine,PLL）（Sigma公司）；臺(tái)盼藍(lán)（SigmaLIVE/DEAD人肝癌HepG2細(xì)胞（復(fù)蒙生物）；無水乙醇、碳酸氫鈉，氯化鈉常用試劑配制方Hoechst33342和PI5μLHoechst33342的PI1mLDMEMDMEM粉末（10g）入100mL的胎牛FBS，再加入鏈霉素和青霉素,使兩者的終濃度均為100μg/mL，最后蒸水定容至刻度。使用0.22μm的正壓濾器過濾除菌，無菌500mL4℃37℃培養(yǎng)箱磷酸鹽緩沖液（1×PBS）：8.0g氯化鈉，0.20g氯化鉀，3.492g含12個(gè)結(jié)晶水的磷酸氫鈉和0.20g磷酸氫二鉀置于1000mL容量瓶用現(xiàn)蒸的雙蒸水溶液定容至刻度，使用0.22μm的正壓濾器過濾除菌，無菌分裝至500mL的4℃37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。1×PBS100mL0.22μm正壓濾器過濾除菌，過濾0.25%胰酶-EDTA溶液放置在4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。雙抗（青霉素和鏈霉素）：4mL20萬/mL，0.5mL分裝于EP管，放置在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?，臨用現(xiàn)化；鏈霉素用5mL20萬/mL0.5mL分裝于EP管，放置在-20℃冰多聚賴氨酸：取10×多聚賴氨酸1mL蒸水稀釋至10mL，在超凈臺(tái)中0.22μm針孔注射器過濾除菌，分裝到EP4℃細(xì)胞凍存液：用移液槍吸取4.5mL胎牛，0.5mL的DMSO，混合均勻，0.22μm針孔注射器過濾除菌，分裝入滅菌后的EP4℃冰箱中保存LIVE/DEAD5μL的鈣黃綠素-AM10μL的EthD-1mL的無菌PBS實(shí)驗(yàn)水紅花子藥材購自大連市開發(fā)區(qū)大藥房此藥材均經(jīng)遼寧中大學(xué)鑒 實(shí)驗(yàn)方集成有濃度梯度結(jié)構(gòu)微流控的設(shè)計(jì)與制濃度梯度作為微流控的一種經(jīng)典結(jié)構(gòu)，自問世以來一直受到廣泛的推崇現(xiàn)已成為藥物篩選中應(yīng)用最普遍的結(jié)構(gòu)之一這“圣誕樹形狀的結(jié)構(gòu)有很多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)首先依賴不同的濃度并列使液體以層流的方式流動(dòng),流經(jīng)不同的網(wǎng)絡(luò)最終溶液“圣誕樹底部形成復(fù)雜而精確的濃度梯度其次網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)具有很大的靈活性通過改變通道的長(zhǎng)度及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)型可以有不同的形態(tài)和空間構(gòu)型。控，旨在把該結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)應(yīng)用于藥物篩選中。本實(shí)驗(yàn)采用AUTOCAD軟件繪制微流控的整體結(jié)構(gòu)，如圖1如下圖1集成有濃度梯度結(jié)構(gòu)的微流控結(jié)構(gòu)原理。8接且對(duì)稱的結(jié)構(gòu)并在銜接處設(shè)置若干出液口和彎曲結(jié)構(gòu)的流道整體分300μm流道寬度為200m；過渡區(qū)彎曲通道寬為20μm；細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)培養(yǎng)腔尺寸為。1×1.2mm300μmSU-8負(fù)性光刻膠和PDMS為SU-8piranha（濃H2SO4：H2O2=3：1）中浸泡過夜，取出，分別用、無水乙醇和去離子水后，放在加熱板上150℃烘干20min使硅片脫水完全。之后將硅片置于勻2800rpmSU-840s10min，然后置于烘9530min進(jìn)行前烘。緩慢降至室溫后，將涂覆有光刻膠的硅片移至光刻機(jī)，與結(jié)構(gòu)圖形打印成的光刻掩膜接觸后以10-250mJ/cm2紫外輻射劑量對(duì)其2min，后的硅片95℃加熱約15min對(duì)（中烘SU-88min，90μm115℃環(huán)境下30min以完成堅(jiān)膜。PDMS微通道層制作將PDMS預(yù)聚物與劑按重量比10:1均勻混攪拌均勻后置于真空干燥箱中脫氣25min，然后澆鑄到SU-8陽模板上，90℃的PDMS層。的鍵合：將待鍵合的玻璃基片與PDMS流體通道層依次用、無水乙醇和去離子水超聲10min后，將玻璃基片置于加熱板上150℃烘干20min使其脫水完全，PDMS放入90℃烘箱中脫水烘干30min，之后將玻璃基片和PDMS層的待鍵合面放入等離子機(jī)中進(jìn)行氧等離子處理，處理參數(shù)為：3min100W1.8pa200sccm，以完成鍵合[50]。2.2藥物濃度梯度的表實(shí)驗(yàn)采用熒光素(M：376.27)對(duì)“圣誕樹”結(jié)構(gòu)進(jìn)行濃度梯度的表征實(shí)驗(yàn)熒光素100mg·L-1）和無菌水分別通過上部?jī)蓚€(gè)以0.6μL·min-1的流速注入中待液流穩(wěn)定后用熒光顯微鏡拍攝8個(gè)細(xì)胞緩沖區(qū)通道的熒,通過專業(yè)圖像Image-ProPlus6.0分析每個(gè)通道的光密度平均（Densitymean）。如圖1-2所示，通過光密度測(cè)試后得出線性回歸系數(shù)達(dá)到r=0.9982，說明實(shí)際產(chǎn)生的濃度值與理論值相近，即在兩注的藥物濃度分別為0和最大濃度c，則濃度梯度生成區(qū)的八個(gè)通道濃度關(guān)系為2濃度梯度表征結(jié)果（n=5）肝癌HepG2細(xì)胞常規(guī)培放入37℃水浴鍋中，順時(shí)針搖動(dòng)，使凍存管中的液體迅速解凍并融化?？焖儆?5%的乙醇將管表面的液體擦拭干凈后放入高速離心機(jī)中，2000rpm/min離心3min2mL培養(yǎng)液吹打底部細(xì)胞直25mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，3mLDMEM高糖培養(yǎng)基，吹打均勻，將瓶蓋擰松一些后平置入細(xì)并匯合至80%-90%即可進(jìn)行傳代，吸取2mLPBS溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行，重復(fù)31.5mL0.25%胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)1:334mL培養(yǎng)基混合細(xì)胞凍存:取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，棄去上層培養(yǎng)液，使用無菌PBS細(xì)胞3次，胰酶消化2min后，加入新鮮培養(yǎng)液停止消化，吹打均勻后移入凍存管放入離心機(jī)中2000rpm/min離心3min，棄去上層液體加入1mL凍存（現(xiàn)預(yù)處理與中的細(xì)胞培將待用先用無菌水潤(rùn)洗，之后通入75%乙醇3遍，每遍5min，然后用無菌水沖洗數(shù)遍，烘干，紫外照射20min滅菌，之后通入0.1mg·mL-1的多聚L-賴氨酸(PLL)，于37℃下孵育1h，以對(duì)的細(xì)胞培養(yǎng)腔進(jìn)行包被處理，促進(jìn)細(xì)胞快速貼壁[51]，最后用無菌水將剩余PLL沖掉，烘干備用。荷發(fā)生吸附作用，使細(xì)胞貼壁加快。經(jīng)PLL處理的，細(xì)胞在3~3.5h內(nèi)即可貼壁完全，并且多聚賴氨酸沒性，不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)[52]。HepG20.25%2mL2000rpm/min3min，用培養(yǎng)液將細(xì)胞密度稀釋至5×105個(gè)/cm2，利用微量注射器將細(xì)胞注入中之后將芯片放入微流控細(xì)胞孵育平臺(tái)的孵育腔里，打開平臺(tái)裝置，調(diào)整好氣體濃度、環(huán)境溫度等參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，中的細(xì)胞用精密注射泵以0.2μL?min-124h拍照一次，IPP軟件對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，根據(jù)所得結(jié)果繪制人肝癌HepG2細(xì)胞在內(nèi)的生長(zhǎng)曲線以觀察和研究細(xì)胞生長(zhǎng)基本規(guī)律水紅花子有效組分供試品溶按照本前期篩選出的最佳方法，取水紅花子藥材，，精密稱50g500mL660%乙醇（300mL），3次，每次2h，合并濾液，揮干（水浴揮至無醇味），絹布過濾，濃縮成生藥0.4g/mLNaHCO4-HCl調(diào)節(jié)pH3-4HPD-300（樹95%60℃水浴揮干，放入干燥烘箱中，備用。水紅花子有效組分對(duì)HepG2細(xì)胞的影將供試品溶液用含10%滅活小牛的E培養(yǎng)液配制成濃度1mg/m，配制過程中加入0.5%助溶。將緩沖區(qū)各出液口用軟膠帶封死，之后將待測(cè)藥液及培養(yǎng)液分別從濃度梯度結(jié)構(gòu)的兩個(gè)注入用精密注射泵以0.2μ·min-1pG細(xì)胞24h、48h和72h后打開緩沖區(qū)的軟膠帶吸取一定量的PS緩慢勻速的注入到細(xì)胞培養(yǎng)腔，對(duì)細(xì)胞3遍后，向中通入凋亡壞死試劑盒中現(xiàn)配的ht33342和PI染液（1:1）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙染，4避光孵育12min，然后用PS剩余的，最后使用ympu熒光顯微鏡llSn成像軟件對(duì)進(jìn)行拍照。ht33342凋亡細(xì)胞PI染液不能著染具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)壞死細(xì)胞著染為強(qiáng)藍(lán)色熒光加上強(qiáng)紅色熒光將所得到的熒光經(jīng)由圖像處理軟件IPP分析，并計(jì)算出待測(cè)藥物對(duì)2細(xì)胞的凋亡壞死率，細(xì)胞凋亡壞死率按以下公式計(jì)算：細(xì)胞凋亡壞死率%=（凋亡細(xì)胞數(shù)壞死細(xì)胞數(shù)）/全部細(xì)胞數(shù)100%。最后將結(jié)果與前期已完成的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，微流控藥物篩選的準(zhǔn)確性和適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)微流控設(shè)計(jì)制作結(jié)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了抗腫瘤藥物篩選微流控的構(gòu)建工作選取了有機(jī)聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS）為制作的材料，相比于其它材料，該材料具有良好本實(shí)驗(yàn)使用模塑法制作PDMS層，具體包括PDMS與劑的混合、層PDMS的制作。在制作單層時(shí)一般將PDMS預(yù)聚物和劑按10:130minPDMS澆注在硅陽膜上，95℃35min，冷卻后取下切割打孔即可。在制作雙層PDMS的時(shí)候，我們采用了熱鍵合的方式來鍵合兩層PDMS2種不同粘度的PDMS，分別對(duì)應(yīng)流體層和閥控層兩層PDMS的組成分別為預(yù)聚物劑=8:1及15:1。為了增強(qiáng)鍵合的牢固性，2種PDMS9015minPDMS層，相互之間的粘附力更大。分別切割打孔后，將兩層對(duì)齊壓合，再繼續(xù)以90℃加熱1h以最終完P(guān)DMS的對(duì)準(zhǔn)十分重將制作完成的PDMS層與玻璃片經(jīng)過氧等離子體的處理，PDMS的表面會(huì)產(chǎn)應(yīng)，使表面層的部分-CH3/-CH2等基團(tuán)，并嵌入了一些-OH、-COOH等極性基團(tuán)，這些極性基團(tuán)的存在增加了PDMS表面的親水性能。經(jīng)氧等離子體處理的PDMS，能夠與玻璃發(fā)生鍵合，該鍵合步驟也是微流控制作過程中的最后一步，實(shí)驗(yàn)將玻璃基片和制作好的PDMS層進(jìn)行氧等離子處理，經(jīng)后對(duì)其他幾種微流控進(jìn)行制作，經(jīng)過對(duì)各工藝步驟的優(yōu)化及各參數(shù)的校對(duì)分微流控細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)人肝癌HepG2細(xì)胞取材于肝癌組織，圖3所示為細(xì)胞分別在常規(guī)培養(yǎng)瓶和在中的生長(zhǎng)狀態(tài)圖通過可以觀察到細(xì)胞粘附在基底并能完全伸展圖 HepG2細(xì)胞分別在（A）和常規(guī)培養(yǎng)（B）中的生長(zhǎng)狀態(tài)水紅花子有效組分對(duì)HepG2細(xì)胞的影肝癌的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞增殖與凋亡的失衡有密切關(guān)系細(xì)胞凋亡是由調(diào)控的細(xì)胞程序性，凋亡時(shí)細(xì)胞膜會(huì)內(nèi)陷，細(xì)胞變圓、表面產(chǎn)生突起，與周圍紅花子有效組分對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡壞死影響實(shí)驗(yàn)中所用的微流控集成有Hoechst33342和碘化丙啶（PI）雙染法觀察中不同濃度待測(cè)藥物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡壞死的影響。由于實(shí)驗(yàn)樣本量較大，導(dǎo)致到的熒光圖數(shù)量也比較多，圖4水紅花子Hoechst33342/PI雙染熒光檢測(cè)結(jié)果胞。我們通過IPPHepG21所示。1HepG2細(xì)胞凋亡壞死率的影響（/%）（x時(shí)L- 與空白對(duì)照組比較HepG2均有一定的促凋亡作用，且隨著分析討本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了集成有濃度梯度結(jié)構(gòu)的微流控，該具有很多優(yōu)勢(shì)，首先濃度梯度結(jié)構(gòu)的自動(dòng)分配功能使得實(shí)驗(yàn)只需1次加藥就可以自動(dòng)生成8種不8列細(xì)胞培養(yǎng)腔道在下游處通過流體3.本實(shí)驗(yàn)基于微流 技術(shù)，進(jìn)行了水紅花子有效組分對(duì)肝癌HepG2胞的促凋亡作用研究并將其最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果 前期已經(jīng)完成的常規(guī)體外3.本實(shí)驗(yàn)基于微流 技術(shù)，進(jìn)行了水紅花子有效組分對(duì)肝癌HepG2胞的促凋亡作用研究并將其最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果 前期已經(jīng)完成的常規(guī)體外 技術(shù)可本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)制作了集成有濃度梯度結(jié)構(gòu)的PDMS-玻璃復(fù)合，并將其用HepG2的凋亡壞死影響研究。首先進(jìn)行了中細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果顯示細(xì)胞在中生長(zhǎng)狀態(tài)良好，與常規(guī)培養(yǎng)相比細(xì)胞形細(xì)胞HepG2凋亡壞死影響的研究，實(shí)驗(yàn)將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于中，施加藥物刺激，并采用Hoechst33342和碘化丙啶（PI）雙染法對(duì)藥效進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合圖像IPP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各濃度水紅花子有效組分對(duì)HepG2細(xì)胞均有抑制作 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