熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)原理及數(shù)據(jù)分析完美版資料

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)原理及數(shù)據(jù)分析MarketingDep.IcyWu內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法熒光定量實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)生工熒光定量產(chǎn)品選擇指南2熒光定量PCR原理－－定義實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)3熒光定量PCR原理－－常用名詞概念擴(kuò)增曲線熒光閾值Ct值44熒光定量PCR原理－－擴(kuò)增曲線5Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase平臺(tái)期熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件5熒光定量PCR原理－－熒光閾值6Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase平臺(tái)期前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline）熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置:大于熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過閾值Threshold6熒光定量PCR原理－－Ct值7Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Ctvalue7熒光定量PCR原理－－Ct值的重現(xiàn)性8橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性8熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理9理想的PCR反應(yīng)Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0

：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)9熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理10非理想的PCR反應(yīng)Xn＝X0

（1＋En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0

：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率10熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理11在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時(shí)XCt＝X0*（1＋En）Ct＝M

（1）整理方程式（2）：方程式（1）兩邊同取對(duì)數(shù)得：XCt：熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個(gè)常數(shù)，定為MLog2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct

（2）Log2X0

=Log

2M

-CtLog2（1＋En）11熒光定量PCR原理－－Ct值與起始模板量的關(guān)系12CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。12熒光定量PCR原理－－熒光定量反應(yīng)性的確認(rèn)13線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)相關(guān)系數(shù)（R2）：大于標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率：-3－PCR擴(kuò)增效率（E）：檢測(cè)靈敏度確認(rèn)35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用SYBR檢測(cè)方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增Notemplatecontrol確認(rèn)35Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生13內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法熒光定量實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)生工熒光定量產(chǎn)品選擇指南1414常用熒光定量標(biāo)記方法15非特異性熒光標(biāo)記SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記TaqManProbe15SYBRGreenI染料法－－原理16SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。SYBRGreenI16SYBRGreenI染料法－－作用機(jī)理17熱變性引物退火延伸反應(yīng)17SYBRGreenI染料法－－問題點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)18問題點(diǎn)：SYBRGreenI

與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將同時(shí)被檢測(cè)，從而可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。關(guān)鍵點(diǎn)：設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增！18平滑曲線，重復(fù)性好，靈敏度高一組標(biāo)準(zhǔn)樣本（有些分析方法不需要）Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量熒光定量PCR的標(biāo)記方法生工熒光定量產(chǎn)品選擇指南待測(cè)樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量×6×1014熒光定量PCR原理－－熒光定量反應(yīng)性的確認(rèn)相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為106、105、104、103；Lg－linerphase探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度實(shí)際目的基因表達(dá)量分析實(shí)際目的基因表達(dá)量分析SYBRGreenI染料法－－融解曲線19將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜對(duì)數(shù)圖譜19SYBRGreenI染料法－－融解曲線20融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光：定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光：定量不準(zhǔn)確20SYBRGreenI染料法－－優(yōu)缺點(diǎn)21使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)優(yōu)點(diǎn)無模板特異性對(duì)引物特異性要求較高不能進(jìn)行多重定量靈敏度相對(duì)較低缺點(diǎn)21Taqman探針法－－原理225′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針22Taqman探針法－－工作機(jī)理23熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探針DNA聚合酶引物RRRR23Taqman探針法－－PCR體系的建立引物、探針的設(shè)計(jì)：探針Tm為68-70℃,<30bp,5’不能有G,G可能會(huì)淬滅熒光素引物盡量靠近探針,擴(kuò)增片段<400bp,引物Tm為59-60℃反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號(hào)/背景比值引物濃度：100-900nM探針濃度：50-300nM其他與常規(guī)PCR相同2424Taqman探針法－－優(yōu)缺點(diǎn)25高度特異性重復(fù)性好靈敏度高可進(jìn)行多重定量?jī)?yōu)點(diǎn)只適合一個(gè)特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高不易找到本底低的探針缺點(diǎn)25實(shí)時(shí)熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)26標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑26實(shí)時(shí)熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)27FRET27實(shí)時(shí)熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)28高特異性：對(duì)目標(biāo)序列檢測(cè)SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點(diǎn)只能用于一個(gè)特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格比較高缺點(diǎn)28幾種熒光定量PCR方法的應(yīng)用比較29方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍SYBRGreenI適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶適合科研中對(duì)各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研究TaqMan特異性高重復(fù)性好價(jià)格高只適合特定目標(biāo)病原體檢測(cè)，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷分子信標(biāo)高特異性熒光背景低只適合特定目標(biāo)設(shè)計(jì)困難價(jià)格高特定基因分析SNP分析29熒光定量PCR技術(shù)的主要應(yīng)用定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等絕對(duì)定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，GMO定量檢測(cè)等相對(duì)定量研究：mRNA表達(dá)量分析，siRNA效果確認(rèn)，差異顯示結(jié)果驗(yàn)證等3030內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法熒光定量實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)生工熒光定量產(chǎn)品選擇指南3131熒光定量PCR的解析方法絕對(duì)定量解析方法相對(duì)定量解析方法3232絕對(duì)定量的定義33Sample25Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量33絕對(duì)定量分析幾要素34一個(gè)目的基因

——即需要確定其量值的核酸序列。一組標(biāo)準(zhǔn)樣本

——用來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢允呛心康幕虻馁|(zhì)粒、PCR產(chǎn)物、基因組DNA等。重復(fù)反應(yīng)孔–——建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計(jì)顯著性。標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreenI法或Taqman探針法均可。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線；融解曲線(探針法不需要)。34絕對(duì)定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備35PCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒目的基因基因組DNA質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用35質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計(jì)算36倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v拷貝數(shù)的計(jì)算：待測(cè)樣本濃度（ng/ul）=OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測(cè)樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量×6×101436絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例－－乙肝病人血液中HBV的絕對(duì)定量37方法：從血液中提取病毒DNA，以TaqMan探針法進(jìn)行熒光定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為106、105

、104

、103；2個(gè)重復(fù)；設(shè)陰性空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)步驟：提取HBVDNA；

設(shè)計(jì)特異引物；設(shè)計(jì)TaqMan探針并標(biāo)記探針；熒光定量擴(kuò)增；結(jié)果分析：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)。37絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例－－乙肝病人血液中HBV的絕對(duì)定量38Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD標(biāo)準(zhǔn)品5×10328.1828.6428.410.16標(biāo)準(zhǔn)品5×10425.2525.1425.190.04標(biāo)準(zhǔn)品5×10522.1122.4622.280.12標(biāo)準(zhǔn)品5×10618.6318.9218.770.10未知樣品?20.5620.4520.50.05空白對(duì)照NoneNone38絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例－－乙肝病人血液中HBV的絕對(duì)定量39擴(kuò)增效率（E）計(jì)算

E=10-1/斜率

-1=10-1/-3.29-1

-1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.29x+40.33R2

相關(guān)系數(shù)（R2）：大于，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。39絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例－－乙肝病人血液中HBV的絕對(duì)定量40未知樣品拷貝數(shù)的計(jì)算將Ct值帶入線性方程：QuantityUnknown=10

=1,071,519copiesX=20.5-40.33-3.29=6.0340熒光定量PCR的解析方法絕對(duì)定量解析方法相對(duì)定量解析方法4141相對(duì)定量的必要性42SampleBSampleA目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同實(shí)際目的基因表達(dá)量分析42相對(duì)定量分析方法43比較兩個(gè)或兩個(gè)以上樣本中某個(gè)基因表達(dá)量的變化！關(guān)注點(diǎn)：基因的相對(duì)表達(dá)量，而不是基因的絕對(duì)量！43相對(duì)定量分析幾要素44一個(gè)參照樣本一個(gè)或一個(gè)以上的未知樣本一個(gè)目的基因管家基因——用來校對(duì)不同樣本之間目的基因的實(shí)際表達(dá)量重復(fù)反應(yīng)孔——建議每個(gè)樣本使用三個(gè)或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計(jì)顯著性標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線（有些分析方法不需要）；融解曲線（探針法不需要）一組標(biāo)準(zhǔn)樣本（有些分析方法不需要）44相對(duì)定量分析－－管家基因篩選45管家基因維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因，如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法根據(jù)文獻(xiàn)提供通過具體實(shí)驗(yàn)篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O45相對(duì)定量分析－－兩種常用的分析方法46雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-△△Ct法461v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－－1＝－絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例－－乙肝病人血液中HBV的絕對(duì)定量手動(dòng)設(shè)置:大于熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值；SYBRGreenI染料法－－融解曲線熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)Taq:100～7kp模板DNA量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Xn＝X0（1＋En）n線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)熒光定量PCR的標(biāo)記方法如果采用SYBR檢測(cè)方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增MarketingDep.Lg－linerphase純度高、完整性好的RNA利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析相對(duì)定量分析－－雙標(biāo)曲線法47通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)對(duì)照樣品、待測(cè)樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計(jì)算公式求得相對(duì)值即為相對(duì)表達(dá)量。公式：相對(duì)值=校正值=目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測(cè)樣品的校正值對(duì)照樣品的校正值47相對(duì)定量分析－－雙標(biāo)曲線法48優(yōu)點(diǎn)：分析簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化相對(duì)簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：對(duì)每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對(duì)定量方法之一檢測(cè)樣品管家基因H目的基因X定量結(jié)果定量結(jié)果校正值相對(duì)量對(duì)照樣品6391.5343.40.05371.000待測(cè)樣品18589.717.30.00200.037待測(cè)樣品27432.91946.10.26184.874實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)48相對(duì)定量分析－－2－△△Ct法49假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增效率相同：或最后用任一樣本q的XN

除以參照因子（calibrator，cb）的XN

得到：

對(duì)于一個(gè)少于150bp的擴(kuò)增片斷而言，如果Mg2+濃度、引物都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，擴(kuò)增效率接近于1。因此目標(biāo)序列的量通過內(nèi)均一化處理之后相對(duì)于參照因子而言就是：XT是目標(biāo)分子達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù)RT是內(nèi)參分子達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)的分子數(shù)49相對(duì)定量分析－－2－△△Ct法50公式：F=2－優(yōu)點(diǎn)：無需作標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點(diǎn)：假定擴(kuò)增效率為100%；假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致；實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化較為復(fù)雜。應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對(duì)定量方法之一

待測(cè)組目的基因平均Ct值待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct值對(duì)照組目的基因平均Ct值對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值－－－50相對(duì)定量分析－－2－△△Ct法51實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：2-△△Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100%△Ct（處理前）＝18－17＝1△Ct（處理后）＝16－17.4=－△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－－1＝－比率（處理后/處理前）＝2－△△Ct＝2－（－）＝所以Jun基因在處理后表達(dá)水平是處理前的倍修正方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有相同的擴(kuò)增效率，但擴(kuò)增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴(kuò)增效率為，那么計(jì)算公式可修正為－△△CtSampleJun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E處理前18171.95處理后1617.41.9551內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法熒光定量實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)生工熒光定量產(chǎn)品選擇指南5252熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)53樣品制備定量體系配備引物設(shè)計(jì)反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇分析方法53熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)54樣品制備環(huán)境要求定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具純度高、完整性好的RNA分光光度計(jì)檢測(cè)電泳檢測(cè)54熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)55樣品制備試劑選擇定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化AMVM-MLV高效，全長(zhǎng)的cDNA下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積引物的選擇55熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)56樣品制備誤差控制定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定引物設(shè)計(jì)環(huán)境要求使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（≥3次）設(shè)置空白和陰性對(duì)照均一的反應(yīng)液和模板混合物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間GC％：50－60％Tm：50－65℃單個(gè)堿基重復(fù)＜4個(gè)無二級(jí)結(jié)構(gòu)擴(kuò)增長(zhǎng)度：100－200bp核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)56熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)57樣品制備定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)樣本陽性對(duì)照陰性對(duì)照退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時(shí)間：產(chǎn)物長(zhǎng)度決定反應(yīng)體積＞5ul，推薦20－50ul引物濃度優(yōu)化，模板量?jī)?yōu)化Mg2＋調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)擴(kuò)增效率：90％－110％重復(fù)性：std＜0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：R＞0.99或R2＞0.9857熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)58樣品制備定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)自配購買即用型RCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseries分裝控制內(nèi)參控制機(jī)器校正控制可靠，準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)技能要求誤差控制儀器介紹試劑選擇58熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)59樣品制備定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)儀器介紹分析方法平滑曲線，重復(fù)性好，靈敏度高相對(duì)定量：2－△△Ct法絕對(duì)定量：標(biāo)準(zhǔn)曲線法59熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)60ABI7500ABIStepOneRocheLightcycler480

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CorbettRotor-gene600060熒光定量(SYBRGreen)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)61Bio-radMiniOpticon杭州博日LINE-GENEFQD-66A

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