基因工程原理練習(xí)題及其答案(完整資料)

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基因工程復(fù)習(xí)題基因工程原理練習(xí)題及其答案(完整資料）(可以直接使用，可編輯優(yōu)秀版資料，歡迎下載）題型：名詞解釋(10個(gè)）3０分；填空（每空１分）20分；選擇題(每題1分）１0分；簡(jiǎn)答題（4個(gè)）20分;論述題（2個(gè)）20分。第一章緒論1．名詞解釋：基因工程：按照預(yù)先設(shè)計(jì)好的藍(lán)圖,利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，特別是酶學(xué)技術(shù)，對(duì)遺傳物質(zhì)DNA直接進(jìn)行體外重組操作與改造，將一種生物(供體）的基因轉(zhuǎn)移到另外一種生物（受體)中去，從而實(shí)現(xiàn)受體生物的定向改造與改良。遺傳工程廣義：指以改變生物有機(jī)體性狀為目標(biāo)，采用類似工程技術(shù)手段而進(jìn)行的對(duì)遺傳物質(zhì)的操作,以改良品質(zhì)或創(chuàng)造新品種。包括細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程和基因工程等不同的技術(shù)層次。狹義:基因工程?？寺。簾o(wú)性（繁殖）系或純系。指由同個(gè)祖先經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖方式得到的一群由遺傳上同一的DＮA分子、細(xì)胞或個(gè)體組成的特殊生命群體。2．什么是基因克隆及基本要點(diǎn)?３。舉例說(shuō)明基因工程發(fā)展過(guò)程中的三個(gè)重大事件.A）限制性內(nèi)切酶和ＤＮA連接酶的發(fā)現(xiàn)（標(biāo)志著ＤNA重組時(shí)代的開(kāi)始)；B)載體的使用；C）１９70年,逆轉(zhuǎn)錄酶及抗性標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。4.基因工程研究的主要內(nèi)容是什么？基礎(chǔ)研究：基因工程克隆載體的研究基因工程受體系統(tǒng)的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技術(shù)的研究應(yīng)用研究:基因工程藥物研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的研究在食品、化學(xué)、能源和環(huán)境保護(hù)等方面的應(yīng)用研究第二章基因克隆的工具酶1.名詞解釋:限制性核酸內(nèi)切酶：一類能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開(kāi)的內(nèi)脫氧核糖核酸酶.回文結(jié)構(gòu)：雙鏈DＮＡ中的一段倒置重復(fù)序列，當(dāng)該序列的雙鏈被打開(kāi)后,可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。同尾酶:來(lái)源不同、識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同粘性末端的酶。同裂酶:不同來(lái)源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的識(shí)別序列黏性末端：DNA末端一條鏈突出的幾個(gè)核苷酸能與另一個(gè)具有突出單鏈的DNA末端通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)粘合，這樣的DNA末端，稱為粘性末端。平末端:DNA片段的末端是平齊的。限制性核酸內(nèi)切酶的酶活性單位（U）：在酶的最適反應(yīng)條件下，在50μｌ容積中,６0分鐘內(nèi)完全切割１mgｌＤNA所需的酶量為1個(gè)酶活性單位（ｕnｉt或Ｕ)限制性核酸內(nèi)切酶的星活性:指限制性內(nèi)切酶在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，對(duì)與識(shí)別序列相似的其它序列也進(jìn)行切割反應(yīng),導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的DNA片段的現(xiàn)象。連桿（linkeｒ）：化學(xué)合成的8~12個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸片段.以中線為軸兩邊對(duì)稱，其上有一種或幾種限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列,酶切后可產(chǎn)生一定的粘性末端，便于與具有相同粘性末端的另一DNA片段連接。銜接頭(aｄaｐtor）：化學(xué)合成的寡核苷酸，含有一種以上的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列。其一端或兩端具有一種或兩種內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的黏性末端。底物位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)效應(yīng):酶對(duì)同一個(gè)DＮＡ底物上的不同酶切位點(diǎn)的切割速率不同。激酶：對(duì)核酸末端羥基進(jìn)行磷酸化的酶.2．說(shuō)明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。用屬名第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成的３個(gè)字母斜體的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名以及菌株（型）的代號(hào)命名。該菌株（種）中發(fā)現(xiàn)的不同的酶按照順序以羅馬字母編號(hào)I,IＩ,IＩＩ等.如：Eschｅrｉchiacoli用Eco表示。第四個(gè)字母代表菌株或株型、變種名，若酶存在于質(zhì)粒上，則需大寫(xiě)字母表示非染色體遺傳因子。例：HindＩII從流感嗜血菌株(ＨaemophilｕsInflｕｅnzuｅ)d株中分離的第三個(gè)酶。EcoRI表示基因位于Eschericｈｉａcoli中的抗藥性R質(zhì)粒上。前三個(gè)字母用斜體,其他用正體表示.如果酶存在于一種特殊菌株中,三個(gè)字母后加上菌株名稱符號(hào)，名稱最后部分往往包含羅馬數(shù)字，表示在該特殊菌株中發(fā)現(xiàn)這種酶的先后次序。３。引起限制性核酸內(nèi)切酶星活性的可能因素有哪些？若使用buffer不當(dāng),會(huì)有sｔarａcｔｉvitｙ，而ｓtaｒａcｔiviｔｙ是指限制酶對(duì)所作用的DＮＡ及序列失去專一性，當(dāng)酶辨認(rèn)切割位置的能力降低，導(dǎo)致相似的序列或是錯(cuò)誤的辨認(rèn)序列長(zhǎng)度也會(huì)作用,而產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。所以當(dāng)DNＡ同時(shí)以兩種限制酶處理時(shí)，選擇可使兩種酶之活性反應(yīng)均可達(dá)75﹪以上的rｅstrictionbuffeｒ，若找不到適當(dāng)?shù)模猓鮢fer則先加低鹽的buffer使其中一酶作用后，在加入高鹽buｆfeｒ使另一酶作用，若無(wú)法以鹽的高低分別加入不同的bｕｆfer，則先加入一種bufｆer作用后,加3MNａOAc/95﹪aｌcoｈoｌ沉淀DＮA，再加另一種buffer作用。４．DNA片段之間的連接方式有哪些?具黏性末端的DNA片段之間的連接、具平末端ＤＮA片段之間的連接、DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接、DNA片段加連桿（linker）后的連接。5。什么是Ｋlenoｗ酶？有哪些活性?在基因工程中有什么作用？KlenowDＮA聚合酶是E．cｏliDNＡｐolymｅraseⅠ經(jīng)蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解而從全酶中除去5’－－3’外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和３'--5’外切活性不受影響。也稱為Kｌｅnoｗ片段（Kｌｅnowｆragment）,或Ｅ．colｉDNA聚合酶Ⅰ大片段。5?￠３￠聚合酶3?￠５￠外切酶無(wú)小亞基活性6。DNA聚合酶、RＮA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、末端轉(zhuǎn)移酶、多核苷酸激酶和堿性磷酸酯酶有哪些主要特性?它們?cè)诨蚬こ讨械闹饕猛痉謩e是什么?第三章基因工程的載體１．名詞解釋：載體：指能夠運(yùn)載外源DＮＡ片段（目的基因）進(jìn)入受體細(xì)胞,具有自我復(fù)制能力，使外源ＤNA片段在受體細(xì)胞中得到擴(kuò)增和表達(dá),不被受體細(xì)胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類ＤNA分子.克隆載體:用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的載體.一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子。主要由細(xì)菌質(zhì)?；蚺c其它質(zhì)粒、噬菌體及真核生物病毒的DNA重組構(gòu)建。表達(dá)載體：使目的基因在宿主細(xì)胞中得以表達(dá)的載體.可將重組體DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞,使所載的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯.穿梭載體：稱雙功能載體（bｉfunctionaｌvectｏr）。能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制的載體.質(zhì)粒:指獨(dú)立存在于宿主細(xì)胞染色體外、能夠自我復(fù)制的DNA分子.松弛型質(zhì)粒：拷貝數(shù)多于１0個(gè)的質(zhì)粒。嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒；拷貝數(shù)為１至幾個(gè)的質(zhì)粒.接合質(zhì)粒；指質(zhì)粒所攜帶的基因的功能是使細(xì)胞彼此有效地接觸,以便將質(zhì)粒DNＡ從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞。如:質(zhì)粒上的tra基因使宿主細(xì)胞（大腸桿菌）產(chǎn)生菌毛,合成細(xì)胞表面物質(zhì)，促使宿主細(xì)胞與受體細(xì)胞接合.質(zhì)粒的不親和性;顯性質(zhì)粒;隱性質(zhì)粒；質(zhì)粒的遷移作用;多拷貝質(zhì)粒；整合質(zhì)粒;穿梭質(zhì)粒；表達(dá)質(zhì)粒；探針質(zhì)粒；pUCl8質(zhì)粒;pBR322質(zhì)粒;溶菌生長(zhǎng)；溶源生長(zhǎng)；原噬菌體；烈性噬菌體；溶原化;柯斯載體或粘粒（coｓｍｉｄ）;cｏs位點(diǎn)；人工染色體2。作為工程載體必備哪些基本條件？3。試述質(zhì)粒載體、噬菌體載體、柯斯載體、M１3單鏈絲狀噬菌體載體和酵母人工染色體載體各自的組成特點(diǎn)及其在基因工程中的應(yīng)用.4．簡(jiǎn)述質(zhì)粒的生物學(xué)特性有哪些？5.構(gòu)建人工質(zhì)粒的目的?６.理想質(zhì)粒載體應(yīng)具備的條件及構(gòu)建需遵循的原則是什么？7．λ-DNＡ作為載體的優(yōu)點(diǎn)是什么？8。為什么野生型的l噬菌體ＤＮA不宜作為基因工程載體？該如何改造？第四章目的基因的制備1.名詞解釋：目的基因；基因文庫(kù)ｃDNA文庫(kù)；2.常規(guī)分離目的基因的方法有哪些？其原理分別是什么？3.克隆目的基因的方法有哪些？4．什么是基因組文庫(kù)（genomiｃlibrarｙ)？構(gòu)建基因組文庫(kù)的原理,涉及哪些基本過(guò)程？它同遺傳學(xué)上的基因庫(kù)、cDNA文庫(kù)有什么不同？第五章目的基因的導(dǎo)入和重組子的篩選1.名詞解釋：受體細(xì)胞;感受態(tài)細(xì)胞;轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)導(dǎo);轉(zhuǎn)染；體外裝配;轉(zhuǎn)換子；重組子；轉(zhuǎn)化率；負(fù)篩選；正篩選;ａ-互補(bǔ)篩選２。試述幾種常用的轉(zhuǎn)化方法。3。試述根據(jù)載體的選擇標(biāo)記進(jìn)行重組子篩選的方法和原理。試述根據(jù)插入序列的表型特征進(jìn)行重組子篩選的方法和原理。5．DNA片斷之間的連接方式有哪些?各種連接方式的優(yōu)缺點(diǎn)及DNＡ重組中需要注意什么問(wèn)題?6.受體細(xì)胞選擇的原則？第六章外源基因的表達(dá)1．名詞解釋:融合蛋白；分泌蛋白；包涵體；外源基因表達(dá)體系2．大腸桿菌表達(dá)載體構(gòu)成的重要元件有哪些？3。試比較大腸桿菌、酵母、植物和動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)載體各自組成的特點(diǎn).4.真核基因在大腸桿菌中表達(dá)存在的問(wèn)題和高效表達(dá)的對(duì)策是什么?５.基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)方法有哪些?第七章基因操作的基本技術(shù)1．名詞解釋：分子雜交；探針；PCＲ;引物；隨機(jī)引物；切口位移；熱啟動(dòng);缺口翻譯;Ｎorthｅｒn印跡;Soｕｔｈern印跡2.DNA制備的基本步驟有哪些？３．堿裂解法和CTAＢ法的原理。４.凝膠電泳有哪幾類?影響瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)有哪些？5。PＣR的基本原理是什么？PCＲ反應(yīng)體系的組成成份是什么?6．試述PCR反應(yīng)的程序及參數(shù)。7．PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)需遵循的原則有哪些？8.試述核酸分子雜交的類型和基本步驟。9.探針標(biāo)記的方法有哪些？１0．說(shuō)明Sｏｕtｈｅｒn雜交的原理和方法。11。Nｏrtheｒn印跡與Sｏｕtherｎ印跡有什么不同?第八章植物基因工程及應(yīng)用1．植物遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有？2.基因槍轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)？3.天然的Ti質(zhì)粒能作為表達(dá)載體使用嗎?為什么？4．理想殺蟲(chóng)劑應(yīng)具備什么特性？第九章動(dòng)物基因工程及應(yīng)用1。名詞解釋：轉(zhuǎn)基因生物;共抑制效應(yīng)；多效性胚胎干細(xì)胞2．轉(zhuǎn)基因共機(jī)制效應(yīng)的特征？３。導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因失活的原因可能有哪些？4.試述動(dòng)物基因工程的載體有？5．如何篩選轉(zhuǎn)基因多效性干細(xì)胞?第十章醫(yī)學(xué)基因工程及應(yīng)用1.名詞解釋:胰島素；基因診斷；基因治療；２?；蜩b定的作用？3。如何進(jìn)行基因治療？基因工程原理練習(xí)題及其答案一、填空題1?；蚬こ淌莀___＿＿_(dá)__年代發(fā)展起來(lái)的遺傳學(xué)的一個(gè)分支學(xué)科.２.基因工程的兩個(gè)基本特點(diǎn)是:（1)_____＿_(dá)_＿＿＿_(dá),（2)__＿_(dá)_____＿_(dá)。3．基因克隆中三個(gè)基本要點(diǎn)是：_____＿_(dá)____；＿_(dá)____＿＿_(dá)和___＿_(dá)__＿_(dá)_。４．通過(guò)比較用不同組合的限制性內(nèi)切核酸酶處理某一特定基因區(qū)域所得到的不同大小的片段,可以構(gòu)建顯示該區(qū)域各限制性內(nèi)切核酸酶切點(diǎn)相互位置的_＿＿_(dá)_＿_(dá)____。5．限制性內(nèi)切核酸酶是按屬名和種名相結(jié)合的原則命名的,第一個(gè)大寫(xiě)字母取自＿＿_(dá)____，第二、三兩個(gè)字母取自_______＿＿，第四個(gè)字母則用____＿＿_(dá)____表示。6．部分酶切可采取的措施有：（1)__＿＿_(dá)_＿＿＿＿_(dá)＿(2）____＿_(dá)_＿_(dá)__（3）_______＿_(dá)_＿等.7．第一個(gè)分離的限制性內(nèi)切核酸酶是__＿_(dá)_____＿_(dá)；而第一個(gè)用于構(gòu)建重組體的限制性內(nèi)切核酸酶是＿_(dá)＿_(dá)___＿_(dá)__＿＿。８．限制性內(nèi)切核酸酶BsuRI和HａeⅢ的來(lái)源不同,但識(shí)別的序列都是_＿_(dá)__＿_(dá)__,它們屬于___＿_(dá)________。9．DNA聚合酶I的Kｌeｎoｗ大片段是用__＿_(dá)____＿_(dá)＿_(dá)_切割DＮA聚合酶I得到的分子量為76kDa的大片段,具有兩種酶活性：（1）____＿＿_(dá)_____；(2）_＿_(dá)_____＿_(dá)___＿_(dá)_的活性.10．為了防止DNA的自身環(huán)化,可用_＿_(dá)___＿＿_(dá)__＿_(dá)去雙鏈DNA＿_(dá)__＿_(dá)_＿＿_(dá)＿＿_(dá)_____。1１．EGTＡ是_____＿_(dá)__＿_(dá)_離子螯合劑。12．測(cè)序酶是修飾了的Ｔ7DＮA聚合酶，它只有_＿_(dá)___＿_(dá)_____酶的活性，而沒(méi)有_______酶的活性。13．切口移位（nｉcktranslation)法標(biāo)記DNA的基本原理在于利用__＿_(dá)＿_(dá)___的______＿和＿_(dá)＿＿_(dá)_的作用。1４．欲將某一具有突出單鏈末端的雙鏈ＤNＡ分子轉(zhuǎn)變成平末端的雙鏈形式,通?？刹捎胈___＿_(dá)___或____＿_(dá)＿_(dá)_＿＿_(dá)＿_(dá)_.15．反轉(zhuǎn)錄酶除了催化ＤNＡ的合成外，還具有＿＿_(dá)＿_(dá)＿_(dá)___＿_(dá)的作用，可以將ＤＮA—ＲNA雜種雙鏈中的___＿＿_(dá)_____水解掉。1６．基因工程中依據(jù)應(yīng)用對(duì)象分有3種主要類型的載體：________＿_(dá)＿＿_(dá)_＿、_＿_(dá)___＿_(dá)_＿_(dá)＿_(dá)、__＿_(dá)_______＿＿_(dá)。17.就克隆一個(gè)基因（ＤNA片段）來(lái)說(shuō)，最簡(jiǎn)單的質(zhì)粒載體也必需包括三個(gè)部分:＿_(dá)________＿_(dá)___、_＿_(dá)_____＿_(dá)_＿_(dá)、_＿_(dá)＿_(dá)_＿_(dá)_＿_(dá)＿_(dá)_。另外,一個(gè)理想的質(zhì)粒載體必須具有低分子量。18。一個(gè)帶有質(zhì)粒的細(xì)菌在有EB的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間后，一部分細(xì)胞中已測(cè)不出質(zhì)粒，這種現(xiàn)象叫.１9。ｐB(yǎng)R3２2是一種改造型的質(zhì)粒,它的復(fù)制子來(lái)源于，它的四環(huán)素抗性基因來(lái)自于，它的氨芐青霉素抗性基因來(lái)自于。2０.ＹAC的最大容載能力是,BAC載體的最大容載能力是。21。ｐSＣl01是一種復(fù)制的質(zhì)粒.22．pUCl8質(zhì)粒是目前使用較為廣泛的載體。ｐUＣ系列的載體是通過(guò)和兩種質(zhì)粒改造而來(lái)。它的復(fù)制子來(lái)自，Amp抗性基因則是來(lái)自。2３．噬菌體之所以被選為基因工程載體，主要有兩方面的原因：一是；二是。24.野生型的M１3不適合用作基因工程載體，主要原因是和.2５．黏粒(cｏｓｍiｄ)是質(zhì)?！删w雜合載體，它的復(fù)制子來(lái)自、COS位點(diǎn)序列來(lái)自，最大的克隆片段達(dá)到kb。2６。野生型的l噬菌體DNA不宜作為基因工程載體，原因是:(1）(2）（3)。2７。噬菌粒是由質(zhì)粒和噬菌體DＮＡ共同構(gòu)成的，其中來(lái)自質(zhì)粒的主要結(jié)構(gòu)是，而來(lái)自噬菌體的主要結(jié)構(gòu)是。2８.l噬菌體載體由于受到包裝的限制，插入外源DＮA片段后，總的長(zhǎng)度應(yīng)在噬菌體基因組的的范圍內(nèi)。29。在分離DNA時(shí)要使用金屬離子螯合劑,如EDＴA和檸檬酸鈉等，其目的是.3０.用乙醇沉淀DＮA時(shí)，通常要在DNＡ溶液中加人單價(jià)的陽(yáng)離子，如ＮaCl和NaＡc,其目的是.31．引物在基因工程中至少有4個(gè)方面的用途：（1）（2）（３）（4）。32．Clａｒk發(fā)現(xiàn)用ＴaqDNA聚合酶得到的ＰＣR反應(yīng)產(chǎn)物不是平末端，而是有一個(gè)突出堿基末端的雙鏈DNA分子。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)了克?。蠧Ｒ產(chǎn)物的.33．在cDNＡ的合成中要用到Ｓ1核酸酶,其作用是切除在。34．乙醇沉淀ＤNA的原理是。3５．假定克隆一個(gè)編碼某種蛋白質(zhì)的基因，必須考慮其表達(dá)的三個(gè)基本條件:(1)_＿＿＿＿_(dá)___＿_(dá)＿＿_(dá)_＿＿_(dá)____＿_(dá)______＿＿(２）___＿_(dá)_＿_(dá)_＿_(dá)____＿＿＿_(dá)______＿_(dá)＿_(dá)(３）__＿_(dá)__________＿_(dá)＿_(dá)＿_(dá)___＿＿_(dá)_______.３6.受體細(xì)胞的感受態(tài)是__＿_(dá)____＿＿_(dá)_________＿_(dá)__＿＿_(dá)＿_(dá)＿_(dá)____。3７．DNＡ重組連接的方法大致分為四種：（1)__＿_(dá)_______＿_(dá)(2）＿＿_(dá)__＿＿_(dá)＿＿_(dá)__＿＿(３)＿＿_(dá)_＿_(dá)_＿_(dá)_＿_(dá)_＿_(dá)____＿＿_(dá)_____(4）_________＿_(dá)______＿＿_(dá)__＿_(dá)___。３8.將含有外源基因組一個(gè)酶切片段的質(zhì)粒稱之為含有一個(gè)__＿＿_(dá)＿_(dá)_＿_(dá)_，各種此類質(zhì)粒的集合體稱之為構(gòu)建了一個(gè)＿_(dá)＿_(dá)___________＿_(dá)。３9．將含有一個(gè)mRNA的DＮA拷貝的克隆稱作一個(gè)_＿_(dá)____＿＿_(dá)__，源于同一批ＲＮA制備物的克隆群則構(gòu)建了一個(gè)____＿_(dá)___________。40．只要知道基因組中某一特定區(qū)域的部分核苷酸組成,用________＿＿_(dá)可以將這段DＮA進(jìn)行百萬(wàn)倍的擴(kuò)增。41．人工感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞在溫度為_(kāi)__＿＿＿＿_(dá)___時(shí)吸附DNA，__＿_(dá)______＿時(shí)攝人DNA。42.目前，在重組體的篩選中，已經(jīng)發(fā)展了許多構(gòu)思巧妙、具有極高準(zhǔn)確性的篩選方法。大致可以分為:（1）________＿_(dá)___＿_(dá)（2)__________＿_(dá)___（3）____＿＿＿_(dá)_＿_(dá)___＿_(dá)___(4)____＿_(dá)_______________＿_(dá)_＿_(dá)__等.43。PCR擴(kuò)增篩選重組體是比較簡(jiǎn)便的篩選方法,它適合于＿_(dá)___＿_(dá)____＿_(dá)__＿_(dá)___＿_(dá)____＿。４4。核酸雜交探針可分為兩大類:ＤNＡ探針和RNA探針。其中DＮＡ探針又分為_(kāi)__＿＿_(dá)____探針和___＿＿_(dá)______＿＿_(dá)＿_(dá)_探針。４5.如果用限制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈ＤNA產(chǎn)生5'突出的黏性末端，則可以用＿_(dá)__＿_(dá)__＿＿進(jìn)行3’末端標(biāo)記.如果用限制性內(nèi)切核酸酶切割DNA產(chǎn)生的是3’突出的黏性末端，可以用______＿＿_(dá)__＿＿＿_(dá)___進(jìn)行3'末端標(biāo)記。46．單鏈DＮA探針的標(biāo)記可以采用下列方法：（1)_＿_(dá)______＿＿＿_(dá)_＿_(dá)_＿_(dá)＿_(dá)＿_(dá)_____＿_(dá)＿_(dá)_＿_(dá)_（2）＿_(dá)_＿_(dá)＿_(dá)____＿_(dá)_＿_(dá)__________（３)_______＿_(dá)＿＿＿_(dá)___＿_(dá)______＿_(dá)__＿_(dá)_______。４７。根據(jù)Nｏｒｔｈeｒn雜交的結(jié)果可以說(shuō)明：_____＿_(dá)__＿＿_(dá)______＿_(dá)_______________＿_(dá)＿_(dá)___。48.差示雜交(diffeｒenｔialhybｒidizａｔion）技術(shù)需要__＿＿＿_(dá)___＿_(dá)______＿_(dá)____＿_(dá)＿_(dá)____＿_(dá)。４9.RＮA分子經(jīng)凝膠電泳后按大小不同分開(kāi),然后被轉(zhuǎn)移到一張硝酸纖維素膜（尼龍膜）上，同一放射ＤNA探針雜交的技術(shù)稱__＿_(dá)__＿_(dá)__＿_(dá)__＿_(dá)_＿_(dá)_＿_(dá)＿。50。在_______＿_(dá)＿_(dá)____＿技術(shù)中,DNA限制性片段經(jīng)凝膠電泳分離后，被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（或尼龍膜)上，然后與放射性的DNＡ探針雜交。51?？捎肨４DＮA聚合酶進(jìn)行平末端的ＤNＡ標(biāo)記，因?yàn)檫@種酶具有_________＿＿_(dá)和＿_(dá)＿＿_(dá)＿_(dá)的活性。５2。根據(jù)外源片段提供的遺傳表型篩選重組體，必需考慮三種因素：(1）_____________＿_(dá)（2)＿_(dá)___＿＿_(dá)_＿＿_(dá)＿_(dá)_＿_(dá)___＿_(dá)__（３）____＿_(dá)_____＿＿_(dá)______＿＿.５３．Northerｎ印跡和Ｓouｔｈerｎ印跡有兩點(diǎn)根本的區(qū)別：（1）＿＿_(dá)______＿_(dá)________＿_(dá)______________＿_(dá)____＿_(dá)_＿_(dá)＿_(dá)______＿_(dá)__＿_(dá)＿_(dá)____＿_(dá)___（２）__________＿_(dá)＿_(dá)＿_(dá)＿＿_(dá)__＿_(dá)____________＿＿_(dá)＿_(dá)______＿_(dá)＿＿_(dá)＿_(dá)___＿_(dá)___＿_(dá)____＿＿＿_(dá).５4.放射免疫篩選的原理基于以下三點(diǎn)：(1）_____＿_(dá)____＿＿＿_(dá)＿_(dá)_____＿_(dá)＿_(dá)_＿_(dá)_____(２）＿_(dá)＿_(dá)_＿_(dá)___＿_(dá)＿_(dá)____＿_(dá)__＿_(dá)＿_(dá)_（3）_＿_(dá)＿＿＿＿＿_(dá)__＿_(dá)_＿_(dá)＿_(dá)____＿_(dá)__＿_(dá)__＿_(dá)＿＿。

答案１。702．(1）分子水平上的操作;(２）細(xì)胞水平上的表達(dá)3.克隆基因的類型；受體的選擇;載體的選擇4．限制性酶切圖譜５．屬名的第一個(gè)字母;種名的前兩個(gè)字母；株名6。(1）減少酶量；（2）縮短反應(yīng)時(shí)間;(3）增大反應(yīng)體積７．EｃoK；EcｏＲl８．GGCＣ;異源同工酶9．枯草桿菌蛋白酶;(1）5'—3’合成酶的活性;（2）３’－5＇外切核酸酶10。堿性磷酸酶；５’端的磷酸基團(tuán)１１.Cａ2+1２.5＇—3’合成;3’-5’外切１3.DNA聚合酶I:５’一3’外切核酸酶；5'一3’合成酶14．S1核酸酶切割;DNＡ聚合酶補(bǔ)平１5．核酸水解酶H；RNA16．質(zhì)粒DNA；病毒DNＡ;質(zhì)粒和病毒ＤＮＡ雜合體1７。復(fù)制區(qū)：含有復(fù)制起點(diǎn)；選擇標(biāo)記:主要是抗性基因；克隆位點(diǎn):便于外源DNA的插入１8.質(zhì)粒消除（或治愈)19，pMBl；pＳCl０1；pSＦ2124(Ｒ質(zhì)粒)2０.1000kｂ；300kb21。嚴(yán)緊22．ｐB(yǎng)Ｒ322和M１3；pMＢl;轉(zhuǎn)座子2３．它在細(xì)菌中能夠大量繁殖，這樣有利于外源DNＡ的擴(kuò)增;對(duì)某些噬菌體(如l噬菌）的遺傳結(jié)構(gòu)和功能研究得比較清楚,其大腸桿菌宿主系統(tǒng)的遺傳也研究得比較詳盡24.沒(méi)有合適的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)；選擇標(biāo)記25．質(zhì)粒;l噬菌體；４5２6.(1）分子量大,(2)酶的多切點(diǎn)，（3)無(wú)選擇標(biāo)記27．復(fù)制區(qū)；IＧ區(qū)28．7５％～105%29．螯合Mｇ2+離子,抑制核酸酶的活性30．中和DNA分子的負(fù)電荷，增加DＮＡ分子間的凝聚力31.（1)合成探針;(2)合成cＤNA；(3）用于PCＲ反應(yīng)；（4)進(jìn)行序列分析３2.T—載體３3．第二鏈合成時(shí)形成的發(fā)夾環(huán)?３4。乙醇使DNA分子脫水35.（1)保持正確的可讀框（2）能夠使其轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(3）具有翻譯的起始和終止信號(hào)36.接受外源DNA的生理狀態(tài)3７。（1）黏性末端連接；（２）平末端連接;（3)同聚物接尾連接；（4）接頭連接法38.基因組DＮA克隆；基因組DＮA文庫(kù)３９.cDNA克??；cDNA文庫(kù)40．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)４1.0°Ｃ；42°C42．（１)遺傳學(xué)方法；(２)物理篩選法；（３)核酸雜交法；(4）表達(dá)產(chǎn)物分析法43．插入外源片段的種類較多,大小又極為相似的重組體的篩選４4.基因組DNA；cDNA45．Klenｏw酶填補(bǔ)的方法；T4DNA聚合酶4６．（1）用Ｍ13噬菌體載體合成單鏈ＤNA探針；(2）從mRＮA反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDＮA探針;（3)用不對(duì)稱PCR合成單鏈ＤNA探針4７．外源基因是否進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄４８.兩種不同的細(xì)胞群體能夠表達(dá)不同的基因，即在一個(gè)群體中能夠表達(dá)一些基因，而在另一個(gè)細(xì)胞群體中不能表達(dá)這些基因４９．Ｎoｒthｅrｎ印跡50．Southern印跡51．5’?３’合成酶;3’?５’外切核酸酶52．（１）克隆的是完整的基因；（2)使用的是表達(dá)載體；（３）不含內(nèi)含子53．（1)印跡的對(duì)象不同：Norｔhern是ＲNA,Ｓｏuthern是DNA；(2）電泳條件不同,前者是變性條件，后者是非變性條件５４.（１)抗體能夠被吸附到固體支持物上;（2)同一個(gè)抗原可以同幾種抗體結(jié)合；(３)抗體能夠被標(biāo)記

二、選擇題(單選或多選）1。因研究重組DNA技術(shù)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)的科學(xué)家是（）（a）Ａ。Koｒnｂerg（ｂ)W。Gilｂert（c)P。Berg（d）B.McCｌｉntｏcｋ２。第一個(gè)作為重組ＤNA載體的質(zhì)粒是（）(a）pBR322（ｂ)ColＥl(c）pSCl01(d)pUCl83．關(guān)于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì)，下列描述中只有（）不太恰當(dāng)。（a）由作用于同一DNＡ序列的兩種酶構(gòu)成（b）這一系統(tǒng)中的核酸酶都是Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶（ｃ)這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過(guò)甲基化作用對(duì)DNA進(jìn)行修飾(ｄ）不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制-修飾系統(tǒng)4.Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶：(）（a)有內(nèi)切核酸酶和甲基化酶活性且經(jīng)常識(shí)別回文序列（ｂ)僅有內(nèi)切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供（c)限制性識(shí)別非甲基化的核苷酸序列(ｄ）有外切核酸酶和甲基化酶活性(e）僅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供5．下面有關(guān)限制酶的敘述哪些是正確的？（）（a）限制酶是外切酶而不是內(nèi)切酶（b)限制酶在特異序列（識(shí)別位點(diǎn)）對(duì)ＤＮA進(jìn)行切割(c）同一種限制酶切割DNA時(shí)留下的末端序列總是相同的（ｄ）一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)稍有不同的點(diǎn)切割雙鏈DNＡ，產(chǎn)生黏末端（e)一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)相同的位置切割雙鏈DNA,產(chǎn)生平末端6.第一個(gè)被分離的Ⅱ類酶是：（）(a)EｃｏK（b）HｉndⅢ（c）ＨindⅡ(d）EｃoＢ7．在下列進(jìn)行DＮＡ部分酶切的條件中，控制那一項(xiàng)最好？(）（a）反應(yīng)時(shí)間（b）酶量（c）反應(yīng)體積(d)酶反應(yīng)的溫度8．在下列試劑中,那一種可以螯合Ｃa2＋離子?(）(a）EＤTA(ｂ)檸檬酸鈉(c)SDS（ｄ）EGＴA9．在下列工具酶中，那一種可以被EGTＡ抑制活性?（）(a）S1單鏈核酸酶（b)末端轉(zhuǎn)移酶(c）堿性磷酸酶(d)Bal31核酸酶１０．限制性內(nèi)切核酸酶可以特異性地識(shí)別：()（a）雙鏈ＤNＡ的特定堿基對(duì)(b)雙鏈DＮＡ的特定堿基序列（ｃ）特定的三聯(lián)密碼（d)以上都正確１1.下列關(guān)于限制性內(nèi)切核酸酶的表示方法中，正確一項(xiàng)的是(）。(a)Saｕ3AI（b)E。coＲI(c）hindIII(ｄ)Sau3Ａ1１2．限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性是指：()（a)在非常規(guī)條件下,識(shí)別和切割序列發(fā)生變化的活性。(b）活性大大提高(c)切割速度大大加快(d)識(shí)別序列與原來(lái)的完全不同13．下面哪一種不是產(chǎn)生星號(hào)活性的主要原因？（）(a)甘油含量過(guò)高(b）反應(yīng)體系中含有有機(jī)溶劑(c）含有非Mｇ2＋的二價(jià)陽(yáng)離子（d)酶切反應(yīng)時(shí)酶濃度過(guò)低14．關(guān)于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì)，下列描述中只有（）不太恰當(dāng)（ａ)由作用于同一DNＡ序列的兩種酶構(gòu)成(ｂ)這一系統(tǒng)中的核酸酶都是Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶(c）這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過(guò)甲基化作用對(duì)ＤNＡ進(jìn)行修飾（d）不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制-修飾系統(tǒng)15．在長(zhǎng)模板鏈的指導(dǎo)下引物延伸合成長(zhǎng)的DNA互補(bǔ)鏈時(shí)應(yīng)選用（）（a）T4DＮA聚合酶（b)Klenow酶。（c）大腸桿菌ＤＮA聚合酶I(d)T7DNA聚合酶16．末端轉(zhuǎn)移酶是合成酶類，（)（a)作用時(shí)不需要模板（ｂ）在Ca2＋的存在下，可以在突出的3，末端延長(zhǎng)ＤNＡ鏈(c)在Ca2+的存在下，可以在隱蔽的3，末端延長(zhǎng)DＮA鏈（ｄ）上述說(shuō)法有兩種是正確的17．在基因工程中，可用堿性磷酸酶（）(a)防止ＤNＡ的自身環(huán)化（b)同多核苷酸激酶一起進(jìn)行ＤNＡ的5，末端標(biāo)記（c）制備突出的3，末端（ｄ)上述說(shuō)法都正確1８．下列酶中，除（)外都具有磷酸酶的活性（a)λ核酸外切酶（ｂ）外切酶Ⅲ（c）單核苷酸激酶(ｄ）堿性磷酸酶19。下列哪一種酶作用時(shí)需要引物？()(a）限制酶（b）末端轉(zhuǎn)移酶(c)反轉(zhuǎn)錄酶（d）DNA連接酶20．S1核酸酶的功能是（)（a）切割雙鏈的DNＡ（b）切割單鏈的RNA（c）切割發(fā)夾環(huán)(d）以上有兩項(xiàng)是正確的21。Klｅnoｗ酶與DＮA聚合酶相比,前者喪失了(）的活性.（a）5,——３，合成酶，(b)3，-—5，外切酶(c）5，-－-3,外切酶(d)轉(zhuǎn)移酶22．下面關(guān)于松弛型質(zhì)粒(relaxedｐlasmiｄ）性質(zhì)的描述中，()是不正確的(a)質(zhì)粒的復(fù)制只受本身的遺傳結(jié)構(gòu)的控制,而不受染色體復(fù)制機(jī)制的制約,因而有較多的拷貝數(shù)(b）可以在氯霉素作用下進(jìn)行擴(kuò)增(c)通常帶有抗藥性標(biāo)記(ｄ）同嚴(yán)緊型質(zhì)粒融合后，雜合質(zhì)粒優(yōu)先使用松弛型質(zhì)粒的復(fù)制子23。基因工程中所用的質(zhì)粒載體大多是改造過(guò)的，真正的天然質(zhì)粒載體很少,在下列載體中只有（）被視為用作基因工程載體的天然質(zhì)粒載體(a）pBR３２２(b)pSＣl０1（c)pＵBｌｌ0（d）ｐUCl824。下列哪種克隆載體對(duì)外源DNA的容載量最大?（)（a）質(zhì)粒（b）黏粒（c)酵母人工染色體(YAC）(d）l噬菌體(e）cＤNA表達(dá)載體２5。松弛型質(zhì)粒：（)（ａ）在寄主細(xì)胞中拷貝數(shù)較多（b）可用氯霉素?cái)U(kuò)增(c）一般沒(méi)有選擇標(biāo)記（d)上述(a）、(b)兩項(xiàng)正確2６．CｏｌEｌ是惟一用作基因工程載體的自然質(zhì)粒,這種質(zhì)粒:（)（a）是松弛復(fù)制型（b)具有,四環(huán)素抗性(c）能被氯霉素?cái)U(kuò)增（d)能產(chǎn)生腸桿菌素27。同一種質(zhì)粒ＤNA，以三種不同的形式存在，電泳時(shí)，它們的遷移速率是：（）(a）OCDNA>ＳCＤNA>ＬＤＮA（b)SCDNA〉ＬDNＡ〉OCＤNA(c）LDＮA〉ＯＣＤNA>SCDNA(d)SＣDNA>ＯCDNＡ＞LDＮA28．ｐＢＲ322是一種改造型的質(zhì)粒,含有兩個(gè)抗性基因,其中四環(huán)素抗性基因來(lái)自：()(a）CoｌEl（b）Rｉ質(zhì)粒（c)pSCl01(d)pＵＣl82９．關(guān)于穿梭質(zhì)粒載體，下面哪一種說(shuō)法最正確？(）（ａ）在不同的宿主中具有不同的復(fù)制機(jī)制(b）在不同的宿主細(xì)胞中使用不同的復(fù)制起點(diǎn)（c)在不同的宿主細(xì)胞中使用不同的復(fù)制酶(d)在不同的宿主細(xì)胞中具有不同的復(fù)制速率30．能夠用來(lái)克隆3２ｋb以下大小的外源片段的質(zhì)粒載體是(）（ａ)charomｉd(ｂ）pｌａsmid（C）cｏsｍid(d)phagｅｍid31。第一個(gè)作為重組DNA載體的質(zhì)粒是()（a)pBR3２2(b)ColEl(c）ｐSＣl０1(d)pUCl8３2．Ti質(zhì)粒:()（a)可從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)到植物細(xì)胞中（b)作為雙鏈ＤNA被轉(zhuǎn)移(c）在植物中導(dǎo)致腫瘤(ｄ)介導(dǎo)冠癭堿的合成，作為細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物和植物的生長(zhǎng)激素（e）需要細(xì)菌的ｖiｒ基因幫助轉(zhuǎn)移（f)在植物細(xì)胞中作為染色體外質(zhì)粒33．黏粒(cosmｉｄ)是一種人工建造的載體，(）（ａ)它具有COS位點(diǎn)，因而可進(jìn)行體外包裝（ｂ)它具有質(zhì)粒DNA的復(fù)制特性(c）進(jìn)入受體細(xì)胞后,可引起裂解反應(yīng)（d）進(jìn)入受體細(xì)胞后,可引起溶源化反應(yīng)34．有兩種確定核酸中核苷酸序列的方法：化學(xué)序列分析法(Maxam-Gｌｂerｔ）和酶學(xué)序列分析法(Sanｇer）.酶學(xué)測(cè)序法的基本原理/優(yōu)點(diǎn)是：（）（a）堿基與特殊染料間不同的相互作用（b）一個(gè)合成引物的延伸和ＤＮA修復(fù)合成的可靠終止（c）限制性位點(diǎn)與ＤNA末端標(biāo)記的相關(guān)性（ｄ）可同時(shí)對(duì)DＮA雙螺旋的兩條鏈進(jìn)行測(cè)序（ｅ)反應(yīng)是DNA特異的,ＲNＡ不會(huì)帶來(lái)干擾。這樣既減少純化步驟，也節(jié)約了開(kāi)支。35．關(guān)于cDNA的最正確的說(shuō)法是：(）（a)同mRNA互補(bǔ)的單鏈DNA（ｂ）同mRＮA互補(bǔ)的雙鏈ＤNA（c）以mRＮA為模板合成的雙鏈DＮA(d）以上都正確3６．用堿法分離質(zhì)粒DNＡ?xí)r，染色體DNA之所以可以被除去，是因?yàn)?（）(ａ）染色體DNA斷成了碎片(b）染色體DNA分子量大,而不能釋放(c）染色體變性后來(lái)不及復(fù)性（d)染色體未同蛋白質(zhì)分開(kāi)而沉淀37.關(guān)于堿解法分離質(zhì)粒ＤＮA，下面哪一種說(shuō)法不正確？()(a）溶液I的作用是懸浮菌體(ｂ）溶液Ⅱ的作用是使DNA變性(c)溶液Ⅲ的作用是使DNA復(fù)性(d）質(zhì)粒DＮA分子小，所以沒(méi)有變性，染色體變性后不能復(fù)性3８。Clark做了一個(gè)有趣的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ＴaｑDNA聚合酶可以不需要模板,在雙鏈DNA的末端加一個(gè)堿基,主要是加(）。（ａ)dＧTP(ｂ）dATP（c）ｄCTP（d）dTＴP３９．根據(jù)構(gòu)建方法的不同,基因文庫(kù)分為基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)等。在下列文庫(kù)中,()屬cDNＡ文庫(kù)（a）ＹAC文庫(kù)（b)MＡC文庫(kù)(c）扣減文庫(kù)（d）BAC文庫(kù)4０.下面關(guān)于多克隆位點(diǎn)（multipｌecｌoｎesite，MCS)的描述，不正確的—句是()（a)僅位于質(zhì)粒載體中（b)具有多種酶的識(shí)別序列(c)不同酶的識(shí)別序列可以有重疊(d）一般是人工合成后添加到載體中4１．在cDＮA技術(shù)中，所形成的發(fā)夾環(huán)可用（)(a）限制性內(nèi)切核酸酶切除(b)用31外切核酸酶切除(c)用S1核酸酶切除（ｄ）用51外切核酸酶切除42．在DNＡ的酶切反應(yīng)系統(tǒng)中，通常：()(a)用SＳＣ緩沖液(b)加入Mｇ２+作輔助因子(c）加入BSA等保護(hù)劑(d）上述說(shuō)法中，有兩項(xiàng)是正確的43。黏性末端連接法，不僅操作方便，而且（）（a)產(chǎn)生新切點(diǎn)（b)易于回收外源片段（c）載體不易環(huán)化（d）影響外源基因的表達(dá)４4．在下列表型中，()是基因工程上理想的受體菌表型（a）ｒ+m＋rec*(b）r—ｍ-rｅｃ－(C）r—m—reｃ＋(d)ｒ＋ｍ+rec-45．關(guān)于DNA接頭在基因工程中的作用,下列說(shuō)法中哪一項(xiàng)不正確?(）（a）給外源ＤNA添加適當(dāng)?shù)那悬c(diǎn)（b）人工構(gòu)建載體（c）調(diào)整外源基因的可讀框（d)增加調(diào)控元件４6.cＤNA文庫(kù)包括該種生物的（）(a）某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因(b)所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因（ｃ)所有結(jié)構(gòu)基因（d）內(nèi)含子和調(diào)控區(qū)47.下列關(guān)于建立cＤNＡ文庫(kù)的敘述中，哪一項(xiàng)是錯(cuò)誤的？（)（a）從特定組織或細(xì)胞中提?。腘A或ＲNA（b）用反轉(zhuǎn)錄酶合成ｍRＮA的對(duì)應(yīng)單鏈ＤNA(c）以新合成的單鏈ＤNA為模板合成雙鏈DＮA（d)新合成的雙鏈ＤNA甲基化４８．下列對(duì)黏性末端連接法的評(píng)價(jià)中，哪一項(xiàng)是不正確的？()(a）操作方便(b)易于回收片段(c)易于定向重組（ｄ）載體易于自身環(huán)化，降低重組率４９．關(guān)于感受態(tài)細(xì)胞性質(zhì)的描述,下面哪一種說(shuō)法不正確?（）（功具有可誘導(dǎo)性(b)具有可轉(zhuǎn)移性(c)細(xì)菌生長(zhǎng)的任何時(shí)期都可以出現(xiàn)（d）不同細(xì)菌出現(xiàn)感受態(tài)的比例是不同的5０．下面關(guān)于用T4多核苷酸激酶標(biāo)記5＇端制備探針的描述中(）是不正確的。（a)既能標(biāo)記DＮＡ,又能標(biāo)記ＲＮA（b）既能標(biāo)記雙鏈DNA又能標(biāo)記單鏈DNA（c)只能標(biāo)記突出的5＇端不能標(biāo)記其他類型末端(d)DNA或RNA必須有5'—OH的存在５1．Sｏｕｔheｍ印跡的DＮＡ探針（）雜交.（a)只與完全相同的片段（b）可與任何含有相同序列的DＮＡ片段(c）可與任何含有互補(bǔ)序列的DNA片段’.（d)可與用某些限制性內(nèi)切核酸酶切成的DNA片段(e)以上都是5２．用下列方法進(jìn)行重組體的篩選,只有()說(shuō)明外源基因進(jìn)行了表達(dá).(a)Soutｈem印跡雜交（ｂ）Ｎortｈem印跡雜交（c)Weｓtern印跡（ｄ)原位菌落雜交53．下列哪一個(gè)不是Souｔheｒn印跡法的步驟？()（ａ）用限制酶消化ＤNA(a)DＮA與載體的連接（c)用凝膠電泳分離ＤNＡ片段（ｄ)ＤNA片段轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(ｅ）用一個(gè)標(biāo)記的探針與膜雜交54。報(bào)告基因（）(a)以其易于分析的編碼序列代替感興趣基因的編碼序列（b）以其易于分析的啟動(dòng)子區(qū)代替感興趣基因的啟動(dòng)子區(qū)(c）能用于檢測(cè)啟動(dòng)子的活性（d）能用于確定啟動(dòng)子何時(shí)何處有活性55．在利用ｌacZ失活的顯色反應(yīng)篩選法中,IＰTＧ的作用是（）（a）誘導(dǎo)宿主的α肽的合成（b)誘導(dǎo)宿主的ω肽的合成（c）作為酶的作用底物(d)作為顯色反應(yīng)的指示劑56.切口移位是指在()作用下，使（)帶上放射性標(biāo)記。（ａ）DNA聚合酶I,RNA(b）DNA聚合酶I,DNＡ(c)DＮA聚合酶Ⅲ，ＲNA（d）ＤNA聚合酶Ⅲ,DＮA57．用于核酸分子雜交的探針可以是放射性標(biāo)記的（）（a）DNA(ｂ）RNＡ（c)抗體(d）抗原58．Sｏｕtｈｅrｎ印跡是用DNA探針檢測(cè)DNA片段，而Northern印跡則是:（）（a)用ＲＮA探針檢測(cè)DNA片段（b）用ＲNA探針檢測(cè)RNA片段(ｃ）用DＮＡ探針檢測(cè)RNA片段（d)用DNA探針檢測(cè)蛋白質(zhì)片段59.用免疫化學(xué)法篩選重組體的原理是()（a)根據(jù)外源基因的表達(dá)(ｂ)根據(jù)載體基因的表達(dá)（c)根據(jù)mRＮＡ同DNＡ的雜交(d）根據(jù)DNA同DNA的雜交6０。隨機(jī)引物標(biāo)記探針,下列各項(xiàng)中哪一項(xiàng)是不正確的?()(a）雙鏈ＤNA、單鏈DNＡ、RＮA都是可以標(biāo)記的（b)不需要用DnａsｅＩ預(yù)處理(c)反應(yīng)時(shí)可用Klｅnow酶（d)反應(yīng)時(shí)可用DNA聚合酶161.在切口移位標(biāo)記DNA探針時(shí)只能使用（）（a）Kｌｅnow酶（b)DNA聚合酶I(c）DＮA聚合酶Ⅱ(ｄ）ＤNA聚合酶Ⅲ6２.要對(duì)一雙鏈的DNA分子進(jìn)行31末端標(biāo)記,可用（)（a)Klｅnow酶（b）DNA聚合酶I（ｃ）T４DNＡ聚合酶（d)T7DNA聚合酶

答案１.c；2.c；３．b;４．ｂ５．b,C，d，e；6．ｃ；7．b;8。d;9．ｄ；10．B；１1。d;１2。a；13。d；14.ｂ１5．d;1６.c；１7．ａ,b；１８。a;19.c;２０.d;21。c;２２。C;23．ｂ；24.C；25．d；2６．a(chǎn)，C,d；27．b；28.c;2９。b；３０．a(chǎn)；３1．c;32。a，c，ｄ,ｅ,３3．a(chǎn),b,c；34.b；3５。c；36．ｃ；37．d；38.b;39.c；40。a；41。ｃ;42.ａ，ｂ，c；43。b；44．ｂ；４５．d；46。a；47.a；48.c；４９．c；50。b；51．c;５２。ｃ;53.b；５4.ａ，ｃ,d；５５．a(chǎn)；56．b；５７。a,b；58．ｃ；59。ａ；60。d;61.b；62.c;

三、簡(jiǎn)答題1.說(shuō)明ＳaｎｇerDＮA測(cè)序法的原理。2。某學(xué)生在用ＥcoRＩ切割外源DＮＡ片段時(shí)，出現(xiàn)了星號(hào)活性,請(qǐng)分析可能的原因?3.在序列5'—ＣGＡACATＡTGＧAＧT-3'中含有一個(gè)6bp的Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列,該位點(diǎn)的序列可能是什么？４．下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個(gè)(哪些)最有可能是Ⅱ類酶的識(shí)別序列:GAAＴCG，AＡATTT，GATAＴC，AＣＧGCA？為什么？５．當(dāng)兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時(shí),若要進(jìn)行雙酶切,應(yīng)采取什么措施？為什么？6.為什么反轉(zhuǎn)錄酶在聚合反應(yīng)中會(huì)出錯(cuò)?7．什么是測(cè)序酶（sｅqｕｅnａseTM）？8。什么是S1核酸酶作圖（Ｓ1nｕcｌeaｓemａppiｎg）？９ＹAC載體具有什么樣的功能性DNA序列?為什么在克隆大片段時(shí)，ＹＡC具有優(yōu)越性?１0。列舉質(zhì)粒載體必須具備的4個(gè)基本特性。11．什么叫穿梭載體？1２.如何將野生型的ｌ噬菌體改造成為一個(gè)理想的載體？1３．ＰＣＲ的基本原理是什么?用PCＲ擴(kuò)增某一基因,必須預(yù)先得到什么樣的信息？14。cDNA克隆與基因組克隆有何不同？1５.怎樣將一個(gè)平末端DＮA片段插入到EｃｏＲI限制位點(diǎn)中去?1６.簡(jiǎn)述以黏粒為載體構(gòu)建基因文庫(kù)的原理。17。酵母人工染色體要在酵母細(xì)胞中穩(wěn)定存在，必須有哪些基本的結(jié)構(gòu)?18。何謂YAC？主要特性是什么？1９。Mｕllｅr的ＰCＲ反應(yīng)同大腸桿菌體內(nèi)的DNA復(fù)制有哪些不同?你認(rèn)為根本的差別在哪里？20。欲將一真核生物的結(jié)構(gòu)基因克隆后轉(zhuǎn)移到原核生物（如Ｅ.coli)中進(jìn)行表達(dá)，克隆時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？21。假定你分離到一個(gè)E。ｃolｉ的Thｙ—突變體,并推測(cè)有可能是ThyA基因突變。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)方案用PCR從染色體DNA擴(kuò)增突變的ThyA基因,測(cè)定突變的序列。（注：E.coｌi野生型的ThyA基因的序列是已知的）22．你在做Ｓouthern印跡分析，并且剛完成了凝膠電泳這一步。根據(jù)方案,下面一步驟是用NaOH溶液浸泡凝膠，使ＤNA變性為單鏈.為了節(jié)省時(shí)間，你略過(guò)了這一步，直接將DNＡ從凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。然后用標(biāo)記探針雜交,最后發(fā)現(xiàn)放射自顯影片是空白。錯(cuò)在哪里？2３.切口移位（niｃktranｓlａt(yī)ｉon)標(biāo)記探針的主要步驟有哪些?24.用EcｏRＩ和HｉｎdⅢ分別切割同一來(lái)源的染色體DＮＡ，并進(jìn)行克隆,在前者的克隆中篩選到Ａ基因，但在后者的克隆中未篩選到A基因，請(qǐng)說(shuō)明原因。25。什么是Wｅsｔerｎ印跡?它與Southｅｒｎ印跡有什么不同?26。用一限制性內(nèi)切核酸酶切割Lac＋Teｔ＋的質(zhì)粒載體，已知該酶識(shí)別的是4個(gè)堿基序列，并產(chǎn)生有兩個(gè)堿基突出的單鏈末端，該酶在lac基因內(nèi)有切割位點(diǎn)，并在第二個(gè)氨基酸密碼子內(nèi)，該位點(diǎn)可以被任何氨基酸所取代而不影響酶活性。用該酶切割后，用DＮA聚合酶將單鏈末端補(bǔ)齊為雙鏈的平末端,然后重新連接成環(huán),轉(zhuǎn)化Lac-Teｔs受體菌,篩選Tｅｔr轉(zhuǎn)化子，問(wèn)：Lac的基因型是什么？并說(shuō)明原因。2７．在基因工程中,為了在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)真核生物的基因產(chǎn)物,為什么通常要用cDNA而不用基因組DNA?為什么要在ｃDNA前加上細(xì)菌的啟動(dòng)子?

答案1．答:SangerＤＮA測(cè)序法是建立在兩個(gè)基本原理之上:(1)核酸是依賴于模板在聚合酶的作用下由５’端向３'端聚合（DＮA聚合酶參與了細(xì)菌修復(fù)DNＡ合成過(guò)程）；(2)可延伸的引物必須能提供游離的3'羥基末端，雙脫氧核苷酸由于缺少游離的３’羥基末端，因此會(huì)終止聚合反應(yīng)的進(jìn)行.如果分別用4種雙脫氧核苷酸終止反應(yīng)，則會(huì)獲得４組長(zhǎng)度不同的DNA片段.通過(guò)比較所有ＤNA片段的長(zhǎng)度可以得知核苷酸的序列。2．答：鹽離子濃度不對(duì)，溫度不對(duì),甘油濃度過(guò)高。3.答：回文序列是:5'—CATAＴG-３,4．答：GATAＴＣ;AAATTT,因?yàn)樗鼈兪腔匚男蛄?5.答：注意星活性,先低鹽,后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一種酶失活,再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星活性。或使用通用緩沖液。6．答：由于反轉(zhuǎn)錄酶缺少在E．cｏliＤNA聚合酶中起校正作用的3’-5’外切核酸酶活性,所以聚合反應(yīng)往往會(huì)出錯(cuò),在高濃度的ｄＮＴP和Mg2＋下，每５00個(gè)堿基中可能有一個(gè)錯(cuò)配。７.答:所謂測(cè)序酶即是修飾了的Ｔ7ＤNA聚合酶,是采用缺失的方法,從外切核酸酶結(jié)構(gòu)域中除去28個(gè)氨基酸,這樣使T7DＮA聚合酶完全失去了3'－5’的外切核酸酶活性,只有５'－-—3'聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3～９倍，測(cè)序時(shí)常用此酶。８.答:Ｓ1核酸酶作圖是一種對(duì)RＮA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的末端和剪接位點(diǎn)進(jìn)行作圖的方法.9.答:YAC帶有天然染色體所有的功能元件,包括一個(gè)著絲粒,一個(gè)DＮA復(fù)制起點(diǎn)，兩個(gè)端粒。YAＣ能夠容納長(zhǎng)達(dá)幾百kｂ的外源DNＡ,這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時(shí)能夠減少完整基因組文庫(kù)所需的克隆數(shù)目。1０．答：（1）獨(dú)立復(fù)制；（２）有選擇標(biāo)記;（3)有獨(dú)特的酶切位點(diǎn);（4）能轉(zhuǎn)化但不擴(kuò)散.11．答：含有細(xì)菌質(zhì)粒和克隆的真核生物DNＡ片段的雜種質(zhì)粒,有兩個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和既能在細(xì)菌又能在真核細(xì)胞中進(jìn)行選擇的選擇標(biāo)記，所以,很容易從一宿主轉(zhuǎn)到另一個(gè)宿主(來(lái)回穿梭）。12．答：（1）削減分子量（除去非必需區(qū)和整合區(qū)）；(2)削減酶切位點(diǎn)；(3）添加選擇標(biāo)記；(４）引入終止突變1３．答：（1）DＮA半保留復(fù)制的原理，在體外進(jìn)行ＤNA的變性、復(fù)性和引物延伸。(２)至少要預(yù)先知道足夠合成一對(duì)引物的靶ＤNA序列。１4。答：基因組克隆包含所有不在cDＮＡ中出現(xiàn)的內(nèi)含子。1５．答：化學(xué)合成一些長(zhǎng)為10bp含有EcｏRＩ識(shí)別位點(diǎn)的短的DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來(lái),如果用EcｏＲＩ切割這種連接片段,就會(huì)產(chǎn)生ＥcoＲI的單鏈末端.這種片段就可以插入到任何EcoRI的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)中。16。答：（1）CＯＳ位點(diǎn)可以自身環(huán)化；(2）可以利用ＣOS位點(diǎn)包裝l噬菌體顆粒；(3）可以感染寄主細(xì)胞；（4）利用質(zhì)粒復(fù)制子復(fù)制，不整合、不裂解。17．答:（1)著絲粒;（２）端粒；(3)ＡRS序列。1８。答:（1）含有來(lái)自其他生物DNＡ的酵母人工染色體，叫ＹAC；(2）主要特性是可以克隆較大的外源片段。19.答：PCR用雙引物，體內(nèi)復(fù)制用單引物。20。答：應(yīng)注意的問(wèn)題有：?jiǎn)?dòng)子、密碼子、剪接、分泌。21。答：為了擴(kuò)增突變體的thyA基因,先設(shè)計(jì)一對(duì)引物,其中一個(gè)引物的序列與thｙＡ基因的5’端相同,另一個(gè)引物同該基因的3'端互補(bǔ)。在引物的5’端加上合適Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，以便于后來(lái)的克隆。將染色體DNA同引物混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化擴(kuò)增片段，可以直接測(cè)序或克隆到合適的載體再測(cè)序.22．答：如果你的雜交探針是雙鏈的，可能因?yàn)樵诩尤穗s交混合物之前忘記將探針變性而得到空白的放射自顯影結(jié)果。23．答:(１）DNaｓｅＩ造成切口；（2)DＮA聚合酶IIＩ的5’?３’外切核酸酶進(jìn)行切割；(３）DＮＡ聚合酶Ⅲ的5’?3’合成酶進(jìn)行修補(bǔ)；（4）在修補(bǔ)過(guò)程中,隨著切口（ｎick）的移動(dòng)，將放射性的底物摻人到雙鏈ＤＮＡ中。２4.答：原因是：ＨindⅢ的切點(diǎn)在A基因內(nèi)。2５.答：Ｗestern印跡是將蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后用特異性的抗體進(jìn)行檢測(cè)。它與Southern的不同在于探針的性質(zhì)不同，在Wｅｓtern印跡中使用的探針是抗體(蛋白質(zhì)）.26。答：基因型是lac-．原因是在該密碼子中插入了兩個(gè)堿基，造成了移碼突變,所以Lａc的基因是缺陷的。27．答:這是因?yàn)榧?xì)菌沒(méi)有內(nèi)含子剪接系統(tǒng),并且不能識(shí)別真核生物的啟動(dòng)子之故.

四、問(wèn)答題：1．說(shuō)明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。2．什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性？受哪些因素影向？3.影響DNA連接酶催化連接反應(yīng)的因素有哪些？４。什么是Ｋlenｏｗ酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?5.細(xì)菌堿性磷酸酯酶和小牛腸堿性磷酸酯酶有什么不同？在基因工程中有什么用途?６.λ外切核酸酶(1amｂｄａｅxｏｎuｃlease）基本活性是什么？在基因工程中有什么應(yīng)用?7.Mn２+、Mg２+對(duì)DnaseI(deoxyribonucleaｓe？)的活性有什么影響？ＤnａseI在基因工程中有什么作用?８。質(zhì)粒如何維持在細(xì)胞中的穩(wěn)定?9．由于基因工程是人為改變遺傳信息的操作，因此必須注意被操作基因的安全，進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)控，質(zhì)粒載體的安全性是十分重要的.請(qǐng)問(wèn)質(zhì)粒載體的安全條件包括哪幾個(gè)方面？１０。為什么野生型的l噬菌體DNA不宜作為基因工程載體？１1．什么是藍(lán)白斑篩選法?12.藍(lán)白斑篩選法為什么也會(huì)有假陽(yáng)性？13．M１3系列載體具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？1４．黏粒載體具有哪些特點(diǎn)與不足?15。輔助噬菌體DＮA和相應(yīng)的噬菌粒是如何協(xié)同工作的？16．如果知道某一基因的功能及其相應(yīng)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列組成，可以通過(guò)何種方法克隆該基因？１７．什么是基因文庫(kù)？1８．什么是基因組文庫(kù)(ｇｅnｏmｉｃlibｒarｙ）？構(gòu)建基因組文庫(kù)，涉及哪些基本過(guò)程？它同遺傳學(xué)上的基因庫(kù)有什么不同？1９．什么是ｃＤNA文庫(kù)(compｌemｅnｔＤNAlibｒarｙ)?同基因組文庫(kù)有何差別?20．黏性末端連接法是最常用的連接方法,具有許多優(yōu)點(diǎn),但是也有一些不足，請(qǐng)指出這些不足之處。21．什么是同聚物加尾連接法(hｏmｏｐｏｌｙｍeｒtailsｊoｉning）？用何種方法加尾?具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？2２。何謂接頭連接法(１ｉnkeｒligaｔiｏn）?２3。什么是同裂酶？為什么說(shuō)用同裂酶進(jìn)行體外重組效率最高？24。為了大量獲得許多用于生化鑒定的產(chǎn)物,你想將擬南芥中的一個(gè)序列已知、編碼單體酶蛋白的基因在單細(xì)胞微生物中表達(dá)，你如何確保最終能得到產(chǎn)物?25。某一質(zhì)粒載體具有Ｔｅｔr和Kａnr的表型,在Kan抗性基因內(nèi)有一BglI的切點(diǎn)?，F(xiàn)用BglI切割該載體進(jìn)行基因克隆，問(wèn):(1)轉(zhuǎn)化后涂皿時(shí)應(yīng)加什么樣的抗生素?（2）培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌落具有什么樣的抗性基因型？（3)如何利用抗性變化篩選到含有插入片段的重組體？２6．以pBR32２DNA作為載體，從四環(huán)素抗性基因區(qū)克隆外源DＮA時(shí),可采用環(huán)絲氨酸富集法篩選重組體,說(shuō)明其基本原理和基本操作過(guò)程.27．放射性抗體檢測(cè)法(rａdioaｃｔｉvｅａnｔｉｂodyｔest)的基本原理是什么?28．什么是隨機(jī)引物（randompｒimer）?如何標(biāo)記DNA？２9.什么是印跡（bｌotｔing)雜交?30.什么是原位菌落雜交（colonyｈybridization）？3１。說(shuō)明Southern雜交的原理和方法.32．Noｒthern印跡與Southｅrn印跡有什么不同?33.建立了一個(gè)基因文庫(kù)后,如何鑒定一個(gè)攜帶目的基因的克??？答案：1.答：限制性內(nèi)切核酸酶采用三字母的命名原則,即屬名＋種名+株名的各一個(gè)首字母，再加上序號(hào)?；驹瓌t：3-4個(gè)字母組成，方式是:屬名＋種名＋株名＋序號(hào)；首字母:取屬名的第一個(gè)字母，且斜體大寫(xiě)；第二字母:取種名的第一個(gè)字母，斜體小寫(xiě);第三字母:（1)取種名的第二個(gè)字母，斜體小寫(xiě);（2）若種名有詞頭，且已命名過(guò)限制酶，則取詞頭后的第一字母代替。第四字母：若有株名，株名則作為第四字母，是否大小寫(xiě),根據(jù)原來(lái)的情況而定,但用正體。順序號(hào)：若在同一菌株中分離了幾種限制酶，則按先后順序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、…等，用正體。２。答：Ⅱ類限制酶雖然識(shí)別和切割的序列都具有特異性,但是這種特異性受特定條件的限制，即在一定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來(lái)的特異性.條件的改變，限制酶的特異性就會(huì)松動(dòng)，識(shí)別的序列和切割都有一些改變,改變后的活性通常稱第二活性，而將這種因條件的改變會(huì)出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個(gè)星號(hào)表示，因此第二活性又稱為星活性。概括起來(lái)，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種:(１）高甘油含量(〉5％，v／v）;(2)限制性內(nèi)切核酸酶用量過(guò)高（〉10０U/ugＤNA）；（3）低離子強(qiáng)度（<2５mmol/L）；（4）高pＨ（８．0以上);（5)含有有機(jī)溶劑，如DMＳO，乙醇等；（6）有非Mg２＋的二價(jià)陽(yáng)離子存在(如Mｎ2+,Cu2+，Ｃ0２+，Zｎ2+等)。3．答：影響DNＡ連接酶催化連接反應(yīng)的因素有很多，但溫度對(duì)連接反應(yīng)的影響較大。黏性末端鏈通常以1２°C一15°C最好,這種溫度有利于末端退火和連接酶的活性穩(wěn)定。溫度高了難以進(jìn)行末端退火，低于上述溫度會(huì)降低連接酶的活性.平末端連接以室溫為宜，因?yàn)槠侥┒诉B接不存在DＮA的退火問(wèn)題,但是溫度高于30℃，連接酶特別不夠穩(wěn)定。平末端連接時(shí)連接酶的濃度要比黏性末端連接時(shí)高１0－1０0倍。ＤNA中有殘存的tRＮA不會(huì)抑制ＤNＡ連接酶的活性，但是，如果NaCｌ的濃度高于１5０mmｏl/Ｌ，則對(duì)連接反應(yīng)有強(qiáng)的抑制作用。另外反應(yīng)體系中有NＨ４+離子的存在，對(duì)Ｅ。coｌiDNA連接酶具有激活作用.Ｅ。coliＤNA連接酶需要NAD+作輔助因子,而T４ＤNA連接酶需要ATP。4．答：Kｌenoｗ酶是1９74年Kｌenｏｗ用枯草桿菌蛋白酶水解DＮA聚合酶I，得到兩個(gè)片段,其中大片段的分子量為75kDａ，它具有5'—3＇聚合酶和3'-5’外切核酸酶的活性，小片段具有５'-３’外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNＡ聚合酶Ｉ中會(huì)降解５＇引物的５'－3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用.Kｌenoｗ酶主要有下列用途：（１）修復(fù)反應(yīng)，制備平末端可用Klｅｎow酶修復(fù)限制性內(nèi)切核酸酶或其他方法產(chǎn)生的5＇或3'突出末端,制備平末端,這樣可以使原來(lái)具有不相容的黏性末端的DNＡ片段通過(guò)平末端重組。如在反應(yīng)系統(tǒng)中加入放射性同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸，用這種末端填補(bǔ)的方法可以制備３’末端標(biāo)記的探針。用Kｌenow酶修復(fù)5’突出末端的反應(yīng)主要是利用了Klｅｎoｗ酶的DNA聚合酶活性,是填補(bǔ)反應(yīng)；而修復(fù)３’突出末端則是用Ｋlenow酶的3＇—5’外切核酸酶的活性，是切割反應(yīng).用Klｅnow酶的切割反應(yīng)來(lái)修復(fù)3＇突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。（2）標(biāo)記DＮA３＇突出末端（ｐrotrｕdinｇend）該反應(yīng)分兩步進(jìn)行：先用３＇-5'的外切核酸酶活性除去3＇突出末端，產(chǎn)生3'隱含末端，然后在高濃度的標(biāo)記底物(-32ｐ—dＮTP）存在下,使降解(3’—5＇）作用與聚合(5’—3＇）作用達(dá)到平衡.這種反應(yīng)也叫交換或取代反應(yīng)（exｃhaｎge／rｅｐlａｃemeｎtrｅaction)。不過(guò)這一反應(yīng)用T4DＮA聚合酶的效果更好，因它的3'-5’外切核酸酶活性較強(qiáng).（3)其他的一些用途:包括用雙脫氧末端終止法進(jìn)行ＤＮA序列分析、用于cDNA第二鏈的合成、在定點(diǎn)突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法(ｐriｍerｅxｔension)制備單鏈DNA探針等。5．答：主要差別是：CIP68°C時(shí)失活,而B(niǎo)ＡP６8°Ｃ穩(wěn)定，且耐酚抽提。應(yīng)用:(1）ｄｓDNA的5'端脫磷酸，防止ＤＮA的自身連接。但是用CIP處理后，最好將CIP除去后，再進(jìn)行連接反應(yīng).(2)DNＡ和RNA脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記。6.答：外切核酸酶是從噬菌體感染的E．ｃoli中分離純化的，能夠從雙鏈DNA上依次切下5’單核苷酸，作用底物是雙鏈ＤNＡ的５'磷酸末端,不能切割羥基化5’端.該酶雖然能切割單鏈ＤNA,但效率較低(下降200倍）。不能切割帶切口或缺口的dsDNA。該酶作用時(shí)是行進(jìn)性的，一步一步進(jìn)行的.在基因工程中主要用于除去雙鏈DNA突出的5’末端,以便讓末端轉(zhuǎn)移酶加尾。7．DＮaｓeI是一種內(nèi)切核酸酶，在Mg2+存在下,DＮａsｅＩ隨機(jī)切割DNA兩條鏈中的任意一條鏈；當(dāng)Ｍn2＋代替Mｇ2+時(shí),DNａseI幾乎是在雙鏈ＤNＡ兩條鏈相對(duì)的位置上打開(kāi)缺口，使雙鏈ＤNA斷裂,產(chǎn)生的末端幾乎是平末端或只突出1～2個(gè)核苷酸的ＤＮA片段。ＤNａseI有許多用途:(1）在切口移位標(biāo)記中，制造切口;(2）在足跡法中保護(hù)DＮA;(3）除去RＮＡ制備物中的DNA；（4)體外轉(zhuǎn)錄中除去DNA模板;（5）檢測(cè)染色體中的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)；(6）產(chǎn)生可在噬菌體Ｍ13載體上進(jìn)行測(cè)序的隨機(jī)克隆。8.質(zhì)粒通過(guò)以下幾種機(jī)制維持在細(xì)胞中的穩(wěn)定：(1）多聚體質(zhì)粒的分解如果質(zhì)粒在復(fù)制時(shí)形成多聚體的話,在細(xì)胞分裂過(guò)程中質(zhì)粒丟失的可能性就會(huì)增加。一個(gè)多聚體是由多個(gè)單體相互連接而成的。多聚體的形成可能是由于在復(fù)制終止時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤或者是由于單體間重組的結(jié)果。由于多聚體在細(xì)胞分裂時(shí)將作為一個(gè)質(zhì)粒進(jìn)入一個(gè)子細(xì)胞，這樣，多聚體的形成就大大降低了質(zhì)粒的有效拷貝數(shù)，因此，多聚體也就大大增加了細(xì)胞分裂時(shí)質(zhì)粒丟失的機(jī)會(huì).為了避免這種情況的發(fā)生，很多質(zhì)粒都具有位點(diǎn)專一性重組的系統(tǒng)，可以破壞多聚體。（2）分離（parｔitｉoniｎｇ)質(zhì)粒通過(guò)一種分離系統(tǒng)來(lái)防止在細(xì)胞分裂過(guò)程中質(zhì)粒的丟失,這種機(jī)制保證在細(xì)胞分裂過(guò)程中每個(gè)子細(xì)胞至少可得到一個(gè)質(zhì)?？截?，這是由稱為par功能（Parfunｃｔioｎs）完成的.所謂pａr功能是指某些質(zhì)粒，包括F、Ｒ1等質(zhì)粒上具有的一些短的區(qū)域，這些區(qū)域能夠增強(qiáng)質(zhì)?？截惖暮线m分配。如果從質(zhì)粒中將這種區(qū)域拿掉，質(zhì)粒丟失的頻率就會(huì)相當(dāng)高。已經(jīng)深入研究過(guò)Ｐ1質(zhì)粒的分離系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)Ｐ1質(zhì)粒的分離系統(tǒng)由一個(gè)順式激活pａr序列和兩個(gè)蛋白ParA和,PａrB的基因構(gòu)成,其中一個(gè)蛋白同ｐar位點(diǎn)結(jié)合.關(guān)于par位點(diǎn)是怎樣增強(qiáng)質(zhì)粒適當(dāng)分離的機(jī)制有兩種模型，按照這兩種模型，細(xì)菌的膜具有真核生物有絲分裂紡錘體的功能,在細(xì)胞分裂之前將質(zhì)粒分開(kāi)。par位點(diǎn)是質(zhì)粒同質(zhì)膜結(jié)合的區(qū)域，在細(xì)胞分裂時(shí),由于膜的生長(zhǎng),質(zhì)粒的兩個(gè)拷貝就被拉到兩個(gè)子細(xì)胞中。這兩個(gè)模型對(duì)于細(xì)胞分裂時(shí)，質(zhì)粒同質(zhì)膜的結(jié)合是怎樣保證每個(gè)細(xì)胞至少得到一個(gè)質(zhì)粒的解釋是不同的。模型.A:ｐar位點(diǎn)同細(xì)菌質(zhì)膜的一個(gè)假定位點(diǎn)結(jié)合。在這個(gè)模型中，每一種質(zhì)粒都有它自己獨(dú)特的同質(zhì)膜結(jié)合的位點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，位點(diǎn)也加倍,每一個(gè)質(zhì)?？截惤Y(jié)合一個(gè)位點(diǎn).由于這些位點(diǎn)隨著細(xì)胞分裂而分開(kāi),每一個(gè)質(zhì)粒拷貝將分配到一個(gè)子細(xì)胞。這就保證了質(zhì)粒不會(huì)丟失.該模型要解決的問(wèn)題是質(zhì)膜上必須有許多獨(dú)特的位點(diǎn)以供不同的質(zhì)?？截惤Y(jié)合,這似乎不太可能。將模型Ａ稍微改動(dòng)一下，就可以滿足質(zhì)粒分離所需的位點(diǎn)。如果我們假定質(zhì)粒結(jié)合的位點(diǎn)不在質(zhì)膜而是在細(xì)菌的染色體上就可以了。染色體上有很多的位點(diǎn),并且隨著DNA的復(fù)制而加倍，這些位點(diǎn)可供質(zhì)粒結(jié)合。剩下的唯一問(wèn)題就是在質(zhì)膜上有同染色體結(jié)合的獨(dú)特位點(diǎn),這樣，質(zhì)粒將隨著染色體的分離而分離。模型B同模型A基本類似，在這個(gè)模型中，質(zhì)粒的兩個(gè)拷貝在同質(zhì)膜結(jié)合之前必須通過(guò)它們的ｐar位點(diǎn)相互配對(duì)。然后這兩個(gè)質(zhì)粒在細(xì)胞分裂過(guò)程中隨著質(zhì)膜位點(diǎn)的分離而分離。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒常常具有增加質(zhì)粒適當(dāng)分離的位點(diǎn)，但是這些區(qū)域并沒(méi)有相同的結(jié)構(gòu)，并不以相同的機(jī)制起作用。例如，質(zhì)粒ｐSCl01的par區(qū)可以增加質(zhì)粒的超螺旋，至于超螺旋的增加如何幫助質(zhì)粒的適當(dāng)分離是不清楚的?？赡苁窃鰪?qiáng)了質(zhì)粒分離后的迅速?gòu)?fù)制，防止了下次分裂時(shí)的丟失。（３）質(zhì)粒溺愛(ài)（plasmidａｄｄictiｏｎ）即使質(zhì)粒具有分離功能,質(zhì)粒也會(huì)從增殖的細(xì)胞中丟失。在一類復(fù)仇的細(xì)胞中，質(zhì)粒能夠編碼一些殺死丟失了質(zhì)粒的細(xì)胞。像F質(zhì)粒、R1質(zhì)粒、以及P1噬菌體都有這種功能。這些質(zhì)粒編碼一些毒性蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)一旦表達(dá)就會(huì)殺死細(xì)胞。根據(jù)質(zhì)粒的來(lái)源不同，毒性蛋白質(zhì)可通過(guò)各種方式殺死細(xì)胞。例如，質(zhì)粒的毒性蛋白Ccd，通過(guò)改變DNA螺旋酶來(lái)殺死細(xì)胞,由于螺旋酶的改編，引起了雙螺旋DNA的斷裂。質(zhì)粒R1的殺手蛋白Ｈok,破壞細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的功能，引起細(xì)胞活力的喪失。為什么毒性蛋白僅僅是在細(xì)胞丟失了質(zhì)粒之后立即殺死細(xì)胞？當(dāng)細(xì)胞含有這種質(zhì)粒時(shí),沉溺系統(tǒng)的蛋白質(zhì)或ＲNA可作為一種解毒藥,既能阻止毒蛋白的合成,又能同毒蛋白結(jié)合并阻止毒蛋白起作用。然而,這些其他基因的產(chǎn)物要比毒性蛋白不穩(wěn)定得多,所以它們會(huì)很快失活。如果一個(gè)細(xì)胞丟失了質(zhì)粒，既沒(méi)有毒性蛋白也沒(méi)有解毒劑的合成。但是,由于解毒劑更不穩(wěn)定,當(dāng)解毒劑失活后,毒性蛋白就可以起殺傷作用。這些系統(tǒng)使細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)生溺愛(ài)，并防止細(xì)胞丟失質(zhì)粒。9。（１）非傳遞性和不被帶動(dòng)轉(zhuǎn)移。對(duì)于多數(shù)基因克隆操作來(lái)說(shuō)，都不希望載體能夠進(jìn)行自主傳遞，也不希望被帶動(dòng)轉(zhuǎn)移。（２)具有條件致死突變，如溫度敏感質(zhì)粒pＪC30７（CoｌEl的衍生質(zhì)粒）在哺乳動(dòng)物正常體溫下就喪失復(fù)制能力,可防止克隆基因擴(kuò)散，只存在于限定的宿主細(xì)胞中.（3）一般情況下不希望與宿主染色體發(fā)生重組,因?yàn)橹亟M后有可能給宿主帶來(lái)突變。（４）有較小的宿主范圍。10．（１）菌體DNA沒(méi)有容載能力,因?yàn)槭删w的頭部對(duì)DNA包裝的量是有限制的,不能大于基因組的10５%，所以要將l噬菌體改造成載體，必須削減分子量.（２)野生型的lDNＡ對(duì)于一些常用的酶都有多個(gè)識(shí)別和切割位點(diǎn)，不便于克隆。（３）沒(méi)有可供選擇的標(biāo)記。（4)野生型的ｌ噬菌體具有感染性,因此不夠安全.11．這種方法是根據(jù)組織化學(xué)的原理來(lái)篩選重組體。主要是在l載體的非必要區(qū)插入一個(gè)帶有大腸桿菌ｂ—半乳糖苷酶的基因片段,攜帶有l(wèi)ac基因片段的l載體轉(zhuǎn)入ｌac的宿主菌后，在含有5—溴-４—氯—3—引哚-ｂ—D—半乳糖苷（X－gal)平板上形成淺藍(lán)色的噬菌斑。外源基因插人lａc(或lａc基因部分被取代)后,重組的噬菌體將喪失分解X－gaｌ的能力，轉(zhuǎn)入laｃ－宿主菌后，在含有5—溴-4—氯—3—引哚—b—Ｄ—半乳糖苷（Ｘ-gａl）平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍(lán)色噬菌斑。12.b—半乳糖苷酶的Ｎ末端是非必需的,，可以進(jìn)行修飾,并不影響酶的活性或a肽的互補(bǔ)性。如果插入的外源DＮA引起a肽的可讀框的改變，或者插入片段在正確的可讀框中含有終止密碼的話，就會(huì)形成白色噬菌斑.如果插入DＮA的堿基數(shù)正好是３的倍數(shù)，或者插入的DNA中不含有終止密碼的話，仍然會(huì)形成藍(lán)色噬菌斑。這種插入物的長(zhǎng)度可達(dá)幾百個(gè)堿基對(duì)。M13載體的這種性質(zhì)可以用來(lái)檢測(cè)和選擇產(chǎn)生新的終止密碼或改變可讀框，即移碼突變。１3。M13克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)：(1）克隆的片段大:M13噬菌體的DNＡ在包裝時(shí)不受體積的限制,所以容載能力大，有報(bào)道,有些噬菌體顆粒可以包裝比野生型絲狀噬菌體ＤNＡ長(zhǎng)６—7倍的ＤNA(插人片段可達(dá)40kb）。(2)可直接產(chǎn)生單鏈DNＡ，這對(duì)于DNＡ測(cè)序、DNＡ誘變、制備特異的單鏈DNＡ探針都是十分有用的。（3）單鏈ＤNA和雙鏈ＤNA都可以轉(zhuǎn)染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。M13克隆系列的不足：(1）較大的外源片段插入后,在擴(kuò)增過(guò)程中往往不夠穩(wěn)定，一般說(shuō),克隆的片段越大，發(fā)生丟失的機(jī)率越大.（2）單鏈載體分子感染的細(xì)胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。1４.主要特點(diǎn)有：（１）具有質(zhì)粒復(fù)制子，進(jìn)入寄主細(xì)胞后能夠像質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制,并且能夠被氯霉素?cái)U(kuò)增。（2)具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記。（3)具有l(wèi)噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。(4)容載能力大?？寺〉淖畲笃卧?５ｋb，最小片段為１9kb。(5)簡(jiǎn)化了篩選.如果載體的分子量在5kb的話，得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)子幾乎排除由載體自連的可能性，因?yàn)橐怀晒Πb，至少要７個(gè)分子的載體自連,盡管如此，也是不能被包裝的，因?yàn)镃OS位點(diǎn)太多了。黏粒載體也有如下不足：（1）如果兩個(gè)黏粒之間有同源序列，可能會(huì)發(fā)生重組，結(jié)果會(huì)使被克隆的片段重排或丟失.(2)含不同重組DNA片段的菌落生長(zhǎng)速度不同，會(huì)造成同一個(gè)子板上菌落大小不一.另外由于不同大小的插入片段對(duì)宿主細(xì)胞的作用不同,會(huì)造成文庫(kù)擴(kuò)增量的比例失調(diào).(3)包裝過(guò)程復(fù)雜，包裝效率不穩(wěn)定,代價(jià)高。１5.雖然噬菌粒載體攜帶有M13的IG區(qū)，能夠合成單鏈DNA，但是