HCN4基因心臟起搏機(jī)制與心律失常關(guān)系研究

HCN4基因心臟起搏機(jī)制與心律失常關(guān)系研究【內(nèi)容摘要】hcn4基因編碼超等化激活陽離子電流〔if〕通道構(gòu)造蛋白，具有調(diào)節(jié)心臟起搏的功能，心臟上打針hcn4基因轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞能夠起到生物起搏作用。hcn4與各種心律失常關(guān)系親密，家族性竇性心動過緩等遺傳性心律失?；颊遠(yuǎn)cn4基因外顯子堿基的缺失或顛換突變導(dǎo)致hcn4通道蛋白的改變，引起if幅度減少，屬于常染色體顯性遺傳。心力衰竭、心肌肥厚、心房顫抖等獲得性心律失?；颊遠(yuǎn)cn4基因的表達(dá)上調(diào)，能夠使if增大，導(dǎo)致心律失常發(fā)生。【本文關(guān)鍵詞語】hcn4基因；心律失常；心臟起搏機(jī)制hcn4基因?qū)儆诔然せ瞽h(huán)核苷酸門控陽離子通道基因家族〔hcn〕，參與編碼超極化激活陽離子電流〔if〕通道構(gòu)造蛋白，是心臟動作電位的緩慢的舒張期自動去極化激活的一個(gè)主要構(gòu)成部分，參與竇房結(jié)細(xì)胞自覺性舒張期膜去極化經(jīng)過，具有調(diào)控起搏的功能。1999年ludweding等［1］在篩查cdna文庫時(shí)，通過探針發(fā)現(xiàn)hcn4基因的cdna。隨后，seifert等［2］從人類丘腦cdna文庫中使用pcr技術(shù)和重組體質(zhì)粒構(gòu)建成功克隆出hcn4基因。2003年，seifert等［3］又通過原位雜交和免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)hcn4基因在發(fā)育中的胚胎心臟上高表達(dá)。hcn4基因突變可能與病態(tài)竇房結(jié)綜合征〔sicksinussyndrome;sss〕,心房顫抖〔atrialfibrillation,af〕的多種心律失常相關(guān)?，F(xiàn)筆者就hcn4基因的構(gòu)造功能、心臟起搏機(jī)制及其與多種心律失常發(fā)生發(fā)展關(guān)系的最新進(jìn)展做一綜述。1hcn4基因及其蛋白的構(gòu)造特點(diǎn)1.1hcn4基因的定位與構(gòu)造hcn4基因位于人染色體15q23q24，全長5065bp,含有8個(gè)外顯子，分子量為129.1kda［4］。hcn4基因cdna的全長為6.8kb，有1個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)〔sts〕。hcn4基因3’末端的未翻譯區(qū)長度為2.6kb，具有特征性的限制區(qū)域和堿基序列。5’末端的轉(zhuǎn)錄序列中有相當(dāng)高的gc含量〔77%〕，其四周有一個(gè)明顯的gpc島，這反映出hcn4蛋白n端可大量出現(xiàn)脯氨酸和甘氨酸的氨基酸殘基。northern雜交和pcr分析表示清楚，hcn4基因重要在心室及心房表達(dá)。1.2hcn4蛋白的構(gòu)造hcn4基因的編碼產(chǎn)品hcn4蛋白是由1203個(gè)氨基酸構(gòu)成，包括6個(gè)跨膜片段(s1s6)，一個(gè)孔道區(qū)以及一個(gè)環(huán)核苷酸結(jié)合域〔cnbd〕。其中s4片段有一群帶正電荷的氨基酸,具有電壓感受器作用,類似于在去極化激活的電壓門控k+通道中的作用。hcn4通道的激活元件包含s1,s1s2的聯(lián)合子，s2及s6的c末端區(qū)域［5，6］。位于s5和s6間的一段氨基酸序列部分貫穿細(xì)胞膜內(nèi),是構(gòu)成親水性孔道而使離子選擇性通過的部分,稱為孔道區(qū)(poreregion)或p區(qū),有大多數(shù)k+選擇性通道所特有的gyg標(biāo)記序列。不外除gyg標(biāo)記之外的氨基酸序列和k+選擇性通道是不一樣的,是造成對k+選擇性低的原因。hcn通道還表現(xiàn)出與環(huán)腺苷酸門控通道的高度同源性,即在c末端存在一個(gè)120個(gè)氨基酸的cnbd,它的作用是調(diào)節(jié)通道對camp反應(yīng)［7］。將cnbd切除后可模仿camp效應(yīng),即hcn門控的電壓依靠性被移向更正的電壓水平,其幅度類似于camp飽和濃度時(shí)的最大效應(yīng)。hcn4基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品可在大腦、心臟和睪丸中表達(dá)。2hcn4基因的功能及其心臟起搏機(jī)制2.1hcn家族基因產(chǎn)品的功能hcn通道屬于電壓門控陽離子通道超家族，hcn家族的基因產(chǎn)品hcn1、hcn2、hcn3、hcn4，是“特種電流〞〔funnycurrent,if〕通道的分子構(gòu)成元件；if是心臟起搏電流，并間接起到調(diào)控心率自覺遞質(zhì)活動的作用。雖然hcn4個(gè)家族成員大約60%基因序列一樣，但他們的生物學(xué)功能各不一樣［8-10］：hcn通道在神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞中均被發(fā)現(xiàn)。hcn基因家族的4個(gè)成員在心臟中存在的有3個(gè),即hcn1、hcn2和hcn4。hcn2重要作用在于維持起搏節(jié)律的穩(wěn)定。hcn4重要作用是使起搏的頻率維持在一定水平以上并隨著機(jī)體不同的生理狀況而對頻率進(jìn)行調(diào)整。有研究發(fā)如今兔竇房結(jié)的某些單個(gè)細(xì)胞有hcn1基因的表達(dá),證明心肌細(xì)胞上存在hcn通道蛋白。hcn1和hcn2及hcn4分別組裝構(gòu)成的異源多聚體,這可能提供一個(gè)具有稍快起搏電流的中心細(xì)胞,這些細(xì)胞將具有比四周細(xì)胞稍快的搏動頻率,這是真正心臟起搏點(diǎn)的主要特征。hcn3重要分布于神經(jīng)纖維上,在心房肌組織上則以hcn2和hcn4亞型表達(dá)為主，在竇房結(jié)細(xì)胞中hcn4是最重要的hcn亞型。ishii、stieber等［3，11］對部分心肌組織中2種亞型對起搏通道的奉獻(xiàn)的比較,以為起搏通道由單獨(dú)的hcn2或hcn4亞型構(gòu)成,即起搏通道的同源構(gòu)成學(xué)說,但也有報(bào)道起搏通道由hcn2和hcn4共同構(gòu)成,為起搏通道的異源構(gòu)成學(xué)說。notomi、shigemoto等［12］也在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在大腦，hcn家族的4中亞型均被檢測到，但是各個(gè)不同的hcn亞型通道的mrnas的表達(dá)水安然平靜分布情況卻截然不同。hcn2是最豐富的神經(jīng)通道，在大腦中能夠普遍找到。與此對照的是，hcn1和hcn4在特定的區(qū)域表達(dá)量高：hcn4重要在丘腦表達(dá)，hcn1重要在海馬表達(dá)。hcn3在大腦的大部分地方的表達(dá)量低，但是在嗅球和下丘腦的一些核團(tuán)表達(dá)量較高。hcn通道也在腎臟和外周神經(jīng)元，例如脊神經(jīng)根等處表達(dá)?；蚯贸@示：hcn2的缺失能夠出現(xiàn)竇性心律失常和癲癇［13］，hcn1的缺失能夠出現(xiàn)運(yùn)動神經(jīng)學(xué)習(xí)和記憶的障礙［14］，hcn4的突變已經(jīng)在病人中發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為自覺性竇房結(jié)功能失常［15，16］。2.2hcn4的心臟起搏機(jī)制hcn4在竇房結(jié)細(xì)胞的舒張期去極化中起到主要作用。hcn4陽離子通道是六個(gè)跨膜超等家族之一［6，17］。通過對人胚胎腎293〔hek293〕細(xì)胞的研究，hcn4在hek293細(xì)胞比心肌細(xì)胞的激活閾值更低。與其他電壓門控通道相比，hcn4通道在超等化時(shí)開放，在正電位時(shí)關(guān)閉。hcn4的平均激活曲線的半最大電壓為-72.5mv，環(huán)核苷酸camp和cgmp通過使通道的激活曲線向更高層次的正電位轉(zhuǎn)移11mv進(jìn)而提升hcn4通道的活動性。if最為人所知的作用是通過在竇房結(jié)的產(chǎn)生的起搏電流控制心臟的心率和節(jié)律［18］。if在緊隨動作電位終止的細(xì)胞膜超等化時(shí)激活，并產(chǎn)生一個(gè)使細(xì)胞膜緩慢去極化的內(nèi)向na+電流。此時(shí)，竇房結(jié)細(xì)胞交感神經(jīng)刺激將升高camp的水安然平靜增長if，進(jìn)而加速舒張期去極化和心率。相反，毒蕈堿樣乙酰膽堿受體興奮降低camp的水安然平靜減少if，使心率減緩。在竇房結(jié)，hcn4通道的激活產(chǎn)生一個(gè)內(nèi)向的陽離子電流if，他能夠反復(fù)的使起搏點(diǎn)電位從70mv向-40mv去極化，最終導(dǎo)致動作電位的發(fā)生。王澤文等［19］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚，hcn4基因修飾大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞心臟起搏樣細(xì)胞具有竇房結(jié)細(xì)胞類似的動作電位。steiber等［3］的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表示清楚，hcn4+/-的小鼠是能存活的，能夠正常喂養(yǎng)，與正常的小鼠無區(qū)別。但是，hcn4-/-的小鼠胚胎在胚胎期的9.5天時(shí)死亡。可見，心臟hcn4基因的特定缺失會造成與普遍缺失一樣的胚胎致死率。hcn4基因缺失的胚胎比正常的胚胎心率慢，同時(shí)心臟上沒有產(chǎn)生動作電位的成熟的起搏點(diǎn)，心率和動作電位不能通過camp水平升高而增長。steiber等［3］推斷hcn4基因在新生兒竇房結(jié)中對起搏電位的產(chǎn)生起著至關(guān)主要的作用。quj等［20］以腺病毒為載體將鼠hcn4〔mhcn4〕直接打針入狗左心耳根部，同時(shí)右心房縫一參考電極，3-4天后，迷走神經(jīng)刺激抑制竇性節(jié)律，顯示左心房部位有異位起搏點(diǎn)產(chǎn)生，增長刺激亦可抑制該起搏點(diǎn)，對離子通道進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在沒有表達(dá)hcn4基因的細(xì)胞if為7±4pa(電壓-130mv時(shí))，而表達(dá)有mhcn4基因的心房肌細(xì)胞起搏電流增大500倍以上，在電壓-125mv時(shí)電流達(dá)3823±713pa，閾值約為-75mv，平均最大半激活電壓為-95.2±0.4mv，而膜電容在兩組沒區(qū)別。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中,研究小組通過導(dǎo)管將mhcn2注入狗的左前分支上，在打針點(diǎn)構(gòu)成較快的逸搏心率,提示在哺乳動物心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染編碼起搏電流的hcn基因能夠構(gòu)成有效的生物起搏［21］。這些研究均提示hcn4基因具有特征性的表達(dá)形式和緩慢門控作用，參與控制心臟起搏細(xì)胞的節(jié)律性活動。3hcn4基因與心律失常發(fā)生的相關(guān)性3.1hcn4與遺傳性心律失常在hcn4與各種心律失常的關(guān)系中，研究的最早、最多的當(dāng)屬其與遺傳性心律失常發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。ueda等［16］分析了6名竇房結(jié)功能障礙患者，3名進(jìn)展性心臟傳導(dǎo)阻滯患者和14名自覺性的心室顫抖患者的hcn4基因，發(fā)現(xiàn)這些患者6個(gè)已經(jīng)知道的離子通道出現(xiàn)陰性突變。同時(shí)，ueda等通過對一名43歲病態(tài)竇房結(jié)綜合癥的女性患者研究，鑒定出hcn4基因第5個(gè)外顯子的一個(gè)ga轉(zhuǎn)換的雜合現(xiàn)象，導(dǎo)致了核跨膜區(qū)域和環(huán)核苷酸連接區(qū)域的聯(lián)合部位的一個(gè)保守殘基asp553asn〔d553n〕的替換。這名患者的姐姐和兒子也患有同種疾病，而在他們的hcn4基因也發(fā)現(xiàn)突變的雜合現(xiàn)象，但是在對照組380組染色體中未發(fā)現(xiàn)的突變。體外分析提示由于一個(gè)顯性負(fù)相型的hcn4通道運(yùn)輸障礙，出現(xiàn)膜表達(dá)下降和if減低。該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表示清楚轉(zhuǎn)染的cos7細(xì)胞中突變通道的共表達(dá)通過顯性負(fù)相方式減少細(xì)胞外表正常通道，同時(shí)膜片鉗檢測證明伴有if幅度的減低。milanesi等［22］發(fā)現(xiàn)竇性心動過緩與hcn4離子通道的編碼基因突變相關(guān)。竇房結(jié)的起搏通道自動產(chǎn)生電流和間接調(diào)控camp依靠的心率自動調(diào)節(jié)。與心動過緩相關(guān)的突變發(fā)生在靠近c(diǎn)amp結(jié)合處的部位，功能分析表示清楚突變的通道正?；貞?yīng)camp，與正常的通道相比在一個(gè)更負(fù)的電位激活。這些變化類似模擬稍微的迷走神經(jīng)刺激，通過減少內(nèi)向的舒張期電流而減慢心率。因而，減少起搏通道的作用而導(dǎo)致家族性心動過緩。milanesi等篩查了52名心臟起搏點(diǎn)hcn4基因編碼區(qū)突變的竇性心動過緩患者。他們鑒定出一個(gè)患有無癥狀性竇性心動過緩的意大利家庭〔心率43次/分〕，攜帶一個(gè)hcn4基因第7個(gè)外顯子ser672到arg(s672r)的錯(cuò)意突變，而這個(gè)突變是由于第2016個(gè)核苷酸ca的顛換所引起。然后，他們對這個(gè)家族所有27名成員的dna進(jìn)行檢查，pcrsscp分析表示清楚所有心動過緩表型中有s672r突變的共分離，這個(gè)結(jié)果提示該突變?yōu)槌Ｈ旧w顯性遺傳。出現(xiàn)基因突變的家族成員的心率范圍為43次/分至60次/分，而正?；虻募易宄蓡T的心律范圍為64次/分至81次/分，同時(shí)計(jì)算出hcn4基因與竇性心動過緩的最大優(yōu)勢對數(shù)評分為5.47。nof等［23］對一個(gè)有8名患有無癥狀的竇性心動過緩的患者的四世同堂的家庭的鑒定中檢測出一個(gè)hcn4基因第4個(gè)外顯子的1439gc的雜合現(xiàn)象，堿基的顛換導(dǎo)致跨膜核成型區(qū)域gly480arg(g480r)保守殘基替換。這個(gè)突變在8個(gè)未受影響的家族成員和100個(gè)不相關(guān)的對照基因中未發(fā)現(xiàn)?；蚬δ芊治霰硎厩宄蛔兺ǖ赖碾妷杭せ畋日Ｍǖ赖?；基因表達(dá)分析表示清楚與正常通道相比，突變通道出現(xiàn)合成和運(yùn)輸?shù)恼系K。schulzebahr等［15］對一名66歲具有暈厥癥狀的典型竇性心動過緩和間歇性心房顫抖的老年女性患者的鑒定中發(fā)現(xiàn)hcn4基因第5個(gè)外顯子有一個(gè)1bp的缺失(1631缺c)的雜合現(xiàn)象，堿基的缺失引起密碼子573框移導(dǎo)致進(jìn)而導(dǎo)致c端環(huán)核苷酸連接區(qū)域的蛋白縮短。這個(gè)突變在其3個(gè)未患病的孩子及對照組362對染色體中未發(fā)現(xiàn)。cos7細(xì)胞的膜片鉗實(shí)驗(yàn)表示清楚突變通道介導(dǎo)的if對細(xì)胞camp水平升高不敏感；共同表達(dá)研究表示清楚hcn4基因的突變能夠?qū)е嘛@性負(fù)相效應(yīng)。以上研究均表示清楚，hcn4基因與遺傳性心律失常，尤其是家族性竇性心動過緩的發(fā)生發(fā)展親密相關(guān)。外顯子堿基的缺失或顛換而導(dǎo)致的雜合現(xiàn)象是hcn4基因突變的重要機(jī)制，同時(shí)hcn4基因突變符合常染色體顯性遺傳。3.2hcn4與獲得性心律失常robinsonrb［17］等研究指出，高血壓大鼠和心力衰竭病人的心室肌上有if的明顯變化。在老年自覺性高血壓大鼠if增大，用血管緊張素iiat1受體阻斷劑羅沙坦可降低增大的if電導(dǎo)。在β2腎上腺能過表達(dá)的老年小鼠，伴隨心肌肥厚心室的if增大5倍，同時(shí)有hcn4基因上調(diào)優(yōu)勢表達(dá)。michels等［24］的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表示清楚，通過單通道分析hcn4基因和if，單通道hcn4基因閾電位比hcn家族多種亞型共存在細(xì)胞膜上多通道作用時(shí)閾電位高。這個(gè)觀察結(jié)果支持一種假設(shè)if在心力衰竭、心肌肥厚和心房顫抖等這些獲得性心律失常存在時(shí)的過度表達(dá)導(dǎo)致心律失常的發(fā)生，同時(shí)提示特定if阻滯劑的電位治療作用能夠改變疾病病理變化經(jīng)過。故hcn4基因在獲得性心律失常的發(fā)生中可能是一個(gè)關(guān)鍵性的起搏通道基因，且其致病機(jī)制為hcn4基因表達(dá)上調(diào)和if的增大。4結(jié)束語hcn4基因作為一種新近發(fā)現(xiàn)的編碼心臟if的通道基因，關(guān)于其突變機(jī)制、心臟起搏機(jī)制及其與心律失常關(guān)系的研究正在不斷深切進(jìn)入。當(dāng)前，研究較多的還是hcn4基因心臟起搏機(jī)制及其與竇房結(jié)功能障礙的關(guān)系，尤其是家族性竇性心動過緩已表現(xiàn)出hcn4基因突變?nèi)笔Щ蝾崜Q常染色體顯性遺傳的特征。同時(shí)越來越多的研究已經(jīng)揭示該基因在多種心律失常的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后及生物起搏等方面都發(fā)揮了無足輕重的作用。hcn4基因與其他一些心律失常如風(fēng)濕性心臟病心房顫抖等的研究也正在繼續(xù)，我們需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來說明其發(fā)生機(jī)制。通過對其構(gòu)造功能研究，能夠得知hcn4天然發(fā)生突變是怎樣影響if通道功能，將為心律失常的診斷和治療的提供理論基礎(chǔ)?！疽韵聻閰⒖嘉墨I(xiàn)】1ludwiga,zongx,stieberj,etal.twopacemakerchannelsfromhumanheartwithprofoundlydifferentactivationkinetics[j].embo,1999,18〔23〕:2323-2329.2seifertr,scholtena,gaussr,etal.molecularcharacterizationofaslowlygatinghumanhyperpolarizationactivatedchannelpredominantlyexpressedinthalamus,heart,andtestis[j].procnatlacadsci,1999,96:9391-9396.3stieberj,herrmanns,feils,etal.thehyperpolarizationactivatedchannelhcn4isrequiredforthegenerationofpacemakeractionpotentialsintheembryonicheart[j].procnatlacadsci,2003,100:15235-15240.4hofmannf,bielm,ernationalunionofpharmacology.li.nomenclatureandstructurefunctionrelationshipsofcyclicnucleotideregulatedchannels[j].pharmacolrev,2005,57〔4〕:455-462.5ishiitm,takanom,ohmorih,etal.determinantsofactivationkineticsinmammalianhyperpolarizationactivatedcationchannels[j].jgenphysiol2001,53(1):93-100.6wangj,chens,siegelbaums.regulationofhyperpolarizationactivatedhcnchannelgatingandcampmodulationduetointeractionsofcoohterminusandcore[j].transmembraneregions.jgenphysiol,2001,118〔2〕:237-250.7gaussr,seifertr,kauppub,etal.molecularidentificationofahyperpolarizationactivatedchannelinseaurchinsperm[j].nature,1998,393〔4〕:583-587.8bielm,schneidera,wahlc,etal.cardiachcnchannels:structure,functionandmodulation[j].trendscardiovascmed,2002,12〔2〕:206-212.9ludwiga,zongx,jeglitschm,etal.afamilyofhyperpolarizationactivatedmammaliancationchannels[j].nature,1998,393〔4〕:587-591.10santorob,liudt,yaoh,etal.identificationofageneencodingahyperpolarizationactivatedpacemakerchannelofbrain[j].cell,1998,93〔5〕:717-729.11ishiitm,takanom,xielh,etal.molecularcharacterizationofthehyperpolarizationactivatedcationchannelinrabbitheartsinoatrialnode[j].jbiolchem,1999,274〔4〕:12835-12839.12notomit,shigemotor,etal.immunohistochemicallocalizationofihchannelsubunits,hcn14,intheratbrain[j].jcompneurol,2004,471〔2〕:241-276.13ludwiga,buddet,stieberj,etal.absenceepilepsyandsinusdysrhythmiainmicelackingthepacemakerchannelhcn2[j].emboj,2003,22〔2〕:216-224.14nolanmf,malleretg,leekh,etal.thehyperpolarizationactivatedhcn1channelisimportantformotorlearningandneuronalintegrationbycerebellarpurkinjecells[j].cell,2003,115〔4〕:551-564.15schulzebahre,neua,friederichp,etal.pacemakerchanneldysfun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