微生物學控制與發(fā)酵考試重點

微生物學控制與發(fā)酵考試重點微生物學控制與發(fā)酵考試重點微生物學控制與發(fā)酵考試重點資料僅供參考文件編號：2022年4月微生物學控制與發(fā)酵考試重點版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準:發(fā)布日期：1、代謝控制發(fā)酵：指利用遺傳學的方法或者其它生物化學的方法，人為地在脫氧核糖核酸（DNA）分子水平上改變和控制微生物的代謝，使目標產(chǎn)物大量生成、積累的發(fā)酵。2、營養(yǎng)缺陷型：指原菌株由于發(fā)生基因突變，致使合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，從而喪失了合成某些物質(zhì)的能力，必須在培養(yǎng)基中補加該營養(yǎng)物質(zhì)才能生長的突變型菌株。3、結(jié)構(gòu)類似物：指與代謝途徑中的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相類似，能與代謝物一樣與調(diào)節(jié)酶結(jié)合引起酶活性的變化，但不具有代謝物生理功能的一類化合物。4、調(diào)節(jié)酶：是參與代謝調(diào)節(jié)的酶的總稱。作為一個反應鏈的限速因子，對整個反應起限速作用。常稱為關(guān)鍵酶，主要包括變構(gòu)酶、同功酶和多功能酶。5、積累反饋抑制：每一個最終產(chǎn)物只單獨地、部分地抑制共同步驟第一個酶，并且各最終產(chǎn)物的抑制作用互不影響，當幾個最終產(chǎn)物同時存在時，他們的抑制作用是積累的6、轉(zhuǎn)化：指相當大的游離的供體細胞的DNA片段被直接吸收到受體細胞內(nèi)，并整合于受體細胞的基因組中，從而使受體細胞獲得供體細胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。7、操縱子：是指原核生物基因組的一個表達調(diào)控序列，長度約1000bp左右，由若干結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，其表達受到同一調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控。8、巴斯德效應：在有氧的條件下，由于進行呼吸作用而使酒精發(fā)酵和糖酵解作用受到抑制的現(xiàn)象。9、誘變：利用物理或化學因素處理微生物細胞群體，促使其中少數(shù)細胞中的遺傳物質(zhì)（主要是DNA）的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起微生物的遺傳性狀發(fā)生變化，然后通過目的選擇標記設法從群體中篩選出少數(shù)性狀優(yōu)良的突變菌株的過程。10、二次生長：在分批培養(yǎng)微生物的過程中，由于微生物分階段利用基質(zhì)中的主要成分，而出現(xiàn)的兩個高速生長現(xiàn)象。1、能荷：能荷是機體能量在數(shù)量上的衡量形式。為從量上表示細胞內(nèi)ATP-ADP-AMP的能量情況，1968年Alkinson提出了能荷概念。2、滲漏缺陷型：指遺傳性障礙不完全的缺陷型。由于這種突變是它的某一種酶的活性下降而不是完全喪失，因此，滲漏缺陷型能夠少量地合成某一代謝最終產(chǎn)物，能在基本培養(yǎng)基上進行少量的生長。4、組成酶：在特定的細胞內(nèi)，無論其組織或介質(zhì)的組成如何、誘導物是否存在，它都有一種接近恒定數(shù)量的酶存在或本能的合成的酶（1分）。5、協(xié)同反饋抑制：在代謝途徑中，會產(chǎn)生兩個以上的代謝產(chǎn)物，任何一種代謝產(chǎn)物的積累都不會對代謝途徑的第一步反應的酶起抑制作用，只有當代謝產(chǎn)物同時過量積累時，才會對代謝途徑的第一步反應得酶起抑制作用。6、次級代謝產(chǎn)物：微生物生長到一定階段才產(chǎn)生的化學結(jié)構(gòu)十分復雜、對該微生物無明顯生理功能，或并非是微生物生長和繁殖所必需的物質(zhì)。7變構(gòu)調(diào)節(jié)：小分子化合物與酶分子活性中心以外的某一部位特異結(jié)合，引起酶蛋白分子構(gòu)象變化，從而改變酶的活性，這種調(diào)節(jié)稱為酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)或別構(gòu)調(diào)節(jié)。8、脫敏作用：變構(gòu)酶經(jīng)特定處理后，不喪失酶活性而失去對變構(gòu)效應物的敏感性，稱為脫敏作用。例如低溫、汞鹽等起到脫敏作用。9、同化作用：同化作用（又叫做合成代謝）是指生物體把從外界環(huán)境中獲取的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成自身的組成物質(zhì)，并且儲存能量的變化過程。即生物體利用能量將小分子合成為大分子的一系列代謝途徑。3、代謝互鎖：分支途徑上游的某個酶受到另一條分支途徑的終產(chǎn)物，甚至于本分支途徑幾乎不相關(guān)的代謝中間物的抑制或激活，使酶的活力受到調(diào)節(jié)，此即代謝互鎖。7.主動轉(zhuǎn)運：物質(zhì)分子或離子）由膜的低濃度一側(cè)移向高濃度一側(cè)，由細胞膜上的特殊蛋白質(zhì)參與，必須由被轉(zhuǎn)運的物質(zhì)外部膜或細胞）供給能量。8、代謝：是細胞內(nèi)發(fā)生的各種化學反應的總稱，它主要由分解代謝Catabolism）和合成代Anabolism）兩個過程組成。3、轉(zhuǎn)導：由噬菌體將一個細胞的基因傳遞給另一細胞的過程。4、次級代謝產(chǎn)物：微生物生長到一定階段才產(chǎn)生的化學結(jié)構(gòu)十分復雜、對該微生物無明顯生理功能，或并非是微生物生長和繁殖所必需的物質(zhì)。5、菌種退化：指群體中退化細胞在數(shù)量上占一定數(shù)值后表現(xiàn)出菌種生產(chǎn)性能下降的現(xiàn)象。7、同功酶：指能催化相同的生化反應，但酶蛋白分子結(jié)構(gòu)有差異的一類酶，它們雖同存于一個個體或同一組織中，但在生理、免疫和理化特性上卻存在著差別。9、誘導酶：在環(huán)境中存在某種物質(zhì)的情況下才能夠合成的酶。10、抗生素：生物在其生命活動過程中所產(chǎn)生的，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響其它生物機能的有機物質(zhì)。1、菌種復壯：采取一定的措施，使退化的群體中保持原有菌種特性的細胞生長、繁殖以更新退化菌株的過程。4、途徑工程：一門利用分子生物學的原理系統(tǒng)分析細胞代謝網(wǎng)絡，并通過DNA重組技術(shù)合理設計細胞代謝途徑及遺傳修飾，進而完成細胞特性改造的應用性學科。6、葡萄糖效應：是葡萄糖分解產(chǎn)物引起的對酶的生成的分解代謝產(chǎn)物阻礙作用。7、代謝控制發(fā)酵：用遺傳學或其他生化方法，人為的在DNA分子水平上，改變控制微生物的代謝，使有用產(chǎn)物大量生產(chǎn)，得到積累的發(fā)酵。β—半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透性酶、β-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙?；浮Ｗ瓒粽T導酶的活性特異代謝物（變構(gòu)效應物），構(gòu)象酶的生物合成（酶量）調(diào)節(jié)。酶反應底物相結(jié)合變構(gòu)酶解聚，或變構(gòu)酶的編碼基因發(fā)生突變，生物素調(diào)節(jié)和能荷調(diào)節(jié)。EMP途徑，或稱為糖酵解途徑，也稱為雙磷酸己糖（HDP）途徑。單純擴散、易化擴散、主動轉(zhuǎn)運反應速度與底物濃度（或變構(gòu)抑制劑濃度）的關(guān)系曲線呈S型細胞核中；三羧酸循環(huán)的酶常分布于線粒體；糖酵解的酶常分布于細胞液（胞質(zhì)）中 反饋阻遏 反饋抑制1、控制對象 酶的生物合成 酶的活性2、控制的水平 DNAmRNA酶蛋白 酶蛋白的構(gòu)象變化3、控制裝置 終產(chǎn)物與阻遏蛋白親和力 終產(chǎn)物與變構(gòu)部位親和力4、控制裝置的動作 阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合不能合成mRNA 通過變構(gòu)效應，酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化5、形成的控制 開、關(guān)控制 控制酶活性大小6、反應 遲緩、粗的控制 迅速、精確的控制7、細胞經(jīng)濟 高分子化合物（酶蛋白） 低分子化合物（酶促產(chǎn)物）工業(yè)生產(chǎn)上使用的優(yōu)良菌種應具備的特征？（1）原料方面：廣，轉(zhuǎn)化率高（2）產(chǎn)物方面：目的產(chǎn)物含量高，副產(chǎn)物少；3菌體方面：生長快、繁殖力強，耐受力強，抗污染、抗噬菌體能力強，遺傳特性穩(wěn)定。4）設備方面：產(chǎn)泡沫少，培養(yǎng)條件易，需氧量小，適宜大罐生產(chǎn)。3、原生質(zhì)體融合育種的步驟？

1標記菌株的篩選2原生質(zhì)體的制備3原生質(zhì)體的再生4原生質(zhì)體的融合5融合子的選擇6實用性菌株的篩選，即人為的定向篩選融合子。谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)賴氨酸，提高賴氨酸產(chǎn)量的主要調(diào)控措施？（1）切斷或減弱支路代謝。通過高斯氨酸缺陷型來阻斷合成蘇氨酸和蛋氨酸的代謝支路（2）解除反饋調(diào)節(jié)。因為天冬氨酸激酶受蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反饋抑制，通過選育結(jié)構(gòu)類似物來使天冬氨酸激酶脫敏，解除反饋調(diào)節(jié)，另外，還可以用多種突變株使磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶脫敏與激活。（3）解除代謝互鎖（4）改善膜的通透性（5）增加前體物質(zhì)的合成（6）選育溫度敏感突變株（7）選育脲酶回復突變株8）利用基因工程技術(shù)構(gòu)建賴氨酸工程菌株5、簡要寫出使外源基因在大腸桿菌中表達的構(gòu)建過程？

構(gòu)建過程可概括為：“分”，“切”，“接”，“轉(zhuǎn)”，“篩”，“表”。（1）“分”：分離目的基因，利用PCR擴增，反轉(zhuǎn)錄或化學合成法獲得目的基因。（2）“切”：使用限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和表達載體。3）“接”：DNA連接酶鏈接目的基因與載體。（4）“轉(zhuǎn)”：將整合載體轉(zhuǎn)化進入宿主細胞大腸桿菌。（5）“篩”：篩選陽性子。（6）“表”：誘導表達及發(fā)酵條件優(yōu)化。3、選育檸檬酸高產(chǎn)菌株的措施有哪些？

（1）出發(fā)菌株的選擇（2）利用碳酸鈣平板，選擇透明圈大的菌株（3）利用添加pH指示劑溴酚藍的麥芽汁平板，選擇顯色圈大的菌株（4）選育高滲透壓的菌株（5）選育不分解利用檸檬酸的菌株6）選育形態(tài)突變株A選育菌落直徑為正常菌落直徑1/3的小菌落B選擇菌絲和孢子顏色比較淺的突變株C選擇孢子緊密而細小的突變株D選育在葡萄糖合成培養(yǎng)基中孢子不生長、遲長或少長的突變株E選育形成微小菌球體（直徑在0.1mm以下）的突變株（7）選育單氟乙酸、三氟乙酸或者2，4－二硝基酚敏感突變株（8）選育谷氨酸或精氨酸缺陷突變株（9）選育抗藥性突變株10）選育強化二氧化碳固定反應的突變株4、營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選步驟？

1出發(fā)菌株的誘變處理2菌株的中間培養(yǎng)3淘汰野生型菌株4營養(yǎng)缺陷型菌株的分離：營養(yǎng)缺陷型的濃縮；營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出5營養(yǎng)缺陷型的鑒定簡述在谷氨酸發(fā)酵過程中，控制生物素的濃度對谷氨酸產(chǎn)率的影響？1）生物素作為羧化酶的輔酶或輔基，參與細胞內(nèi)固定CO2的反應。細菌細胞膜的合成需要生物素的參與。2）谷氨酸發(fā)酵菌株對生物素以保證菌體的生長。3）發(fā)酵液中必須有生物素以保證菌體生長。4）過量的生物素存在會使菌體的細胞膜合成致密，不利于谷氨酸通過細胞膜從細胞中分離出來，以提高谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)率。5）發(fā)酵液中生物素的濃度以亞適量最好。2、代謝控制發(fā)酵的基本思路及主要措施？

答：(1)切斷代謝支路，如利用營養(yǎng)缺陷型菌株和滲透缺陷型菌株；2）接觸菌體自身的反饋調(diào)節(jié)，如抗類似物突變株和營養(yǎng)缺陷型菌株的應用；3）增加前提物質(zhì)的合成；4）特殊調(diào)節(jié)機制，如解除代謝互鎖，優(yōu)先合成和平衡合成的利用。3、生物體內(nèi)的代謝調(diào)節(jié)在三種水平上進行：（1）細胞調(diào)節(jié)；（2）激素調(diào)節(jié)；（3）神經(jīng)調(diào)節(jié)。試敘述這三種水平調(diào)節(jié)的特點？答：細胞調(diào)節(jié)是原始的、基本的調(diào)節(jié)；激素調(diào)節(jié)緩慢、持久而廣泛；神經(jīng)調(diào)節(jié)則迅速、準確而集中；激素調(diào)節(jié)和神經(jīng)調(diào)節(jié)屬于高級的調(diào)節(jié)。1、初級代謝產(chǎn)物衍生為次級代謝產(chǎn)物的基本途徑？

答：（1）葡萄糖碳源摻入途徑（2）莽草酸途徑（3）與核苷有關(guān)的途徑（4）聚酮體和聚丙酸途徑（5）由氨基酸衍生的途徑（6）甲羥戊酸途徑（7）其他復合途徑1、論述代謝控制發(fā)酵育種思路。答：1營養(yǎng)缺陷型突變株的應用2滲漏突變株的應用3選育抗結(jié)構(gòu)類似物突變株4選育營養(yǎng)缺陷型回復突變株5增加前體物的合成6增加細胞透性，去除細胞內(nèi)終產(chǎn)物7利用特殊的調(diào)控機制，選育應用菌株1、簡述在谷氨酸發(fā)酵過程中，控制生物素的濃度對谷氨酸產(chǎn)率的影響。答：1生物素作為羧化酶的輔酶或輔基，參與細胞內(nèi)固定CO2的反應。細菌細胞膜的合成需要生物素的參與。2谷氨酸發(fā)酵菌株對生物素以保證菌體的生長。3發(fā)酵液中必須有生物素以保證菌體生長。4過量的生物素存在會使菌體的細胞膜合成致密，不利于谷氨酸通過細胞膜從細胞中分離出來，以提高谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)率。5發(fā)酵液中生物素的濃度以亞適量最好?，F(xiàn)從自然界中篩選一株產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌，請你結(jié)合傳統(tǒng)及誘變方法篩選該菌株，并設計該菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶及其分離工藝路線？答：1．從土壤中篩選蛋白酶枯草芽孢菌株的步驟：富集培養(yǎng)（1分）取土樣平攤于一干凈的紙上，從四個角和中央各取一點土，混勻，稱取1g，置于裝有15mL肉湯培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于80-90℃熱水浴中保溫10-15min，然后于28℃搖床上（120rpm）培養(yǎng)24h。涂布分離（1分）將培養(yǎng)液再一次熱處理后，以10倍稀釋法適當稀釋，取最后三個稀釋度的稀釋液各0.1mL于無菌的酪素平板中，每個稀釋度平均兩皿。用滅過菌的涂布棒將菌液均勻涂布在酪素平板上，倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h挑菌落（1分）觀察酪素平板上菌落周圍的透明圈，挑透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌接入斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h，備用。純種鑒定（1分）菌種經(jīng)革蘭氏染色，油鏡觀察，根據(jù)細胞形態(tài)及菌落特征進行鑒別。純化（1分）將選定的菌株于酪素平板上采用平板劃線分離技術(shù)進行純化。將經(jīng)過純化后的菌株經(jīng)過培養(yǎng)后，進行16sRNA檢測和細菌生理生化試驗，對照NCBI基因序列和《伯杰氏手冊》查找與篩選菌株相對應的菌屬及種，最終確定為枯草芽孢桿菌。2、通過傳統(tǒng)紫外誘變技術(shù)或化學試劑篩選性能穩(wěn)定，高產(chǎn)蛋白酶的菌株a接種產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌在LB培養(yǎng)液中，37℃，150r/mim培養(yǎng)24h，取培養(yǎng)液按1:5濃度稀釋培養(yǎng)6h，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌2次，加等體積生理鹽水振蕩打碎菌塊制成菌懸液，選擇10-5的稀釋度進行正式試驗，使培養(yǎng)皿中的液體厚度在2mm左右，并放入無菌磁力攪拌針，置磁力攪拌器上，調(diào)整培養(yǎng)皿位置，使其距20W紫外燈30cm，照射不同時間，選擇總致死率在60%-80%左右的紫外線誘變計量時間。（1分）b將誘變處理后的菌液無菌涂布在分離培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，根據(jù)菌落在分離培養(yǎng)基產(chǎn)生的透明圈直徑與菌落直徑的比值，選取比值最大的菌落，然后將其進行復篩。（1分）c將產(chǎn)蛋白酶出發(fā)菌株與篩選的變異菌株，分別接種于裝有30ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶，于37℃，150r/min培養(yǎng)24h。按5%接種量接種到裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，每株做3個平行，于37℃，180r/min搖床發(fā)酵。發(fā)酵48h測定發(fā)酵液中的蛋白酶酶活，選取比出發(fā)菌株蛋白酶活力提高最大的幾株進行進一步研究。（1分）d將經(jīng)過復篩選擇的菌株進行過程產(chǎn)酶分析，取菌株在37℃，180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)，選取在發(fā)酵過程中不同時間產(chǎn)酶變化，以單位產(chǎn)酶活高，產(chǎn)酶量大，且發(fā)酵周期短，生長迅速的菌株，作為進一步研究菌株（1分）。并將經(jīng)過幾輪篩選得到的最終菌株進行遺傳穩(wěn)定性研究，將菌株在斜面培養(yǎng)基中保存，每轉(zhuǎn)接1次作為傳遞1代，每隔10代進行接入相同的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分析單位菌體產(chǎn)酶變化，選取遺傳穩(wěn)定的菌株作為研究，并進行蛋白酶的酶學性質(zhì)研究，確定其為堿性蛋白酶，酸性蛋白酶還是中性蛋白酶（1分）。3、發(fā)酵生產(chǎn)及純化工藝路線菌種培養(yǎng)——分離純化——種子培養(yǎng)——無菌接種（1分）——發(fā)酵罐培養(yǎng)（1分）營養(yǎng)成分無菌空氣（1分）——過濾分離菌體（1分）——膜過濾分離蛋白（1分）——濃縮蛋白液——噴霧干燥——固體蛋白酶制劑用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸，請設計代謝控制方案以提高產(chǎn)賴氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量？畫出谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸時，由葡萄糖到賴氨酸的代謝途徑。（5分）葡萄糖天冬氨酸