基因工程探索性綜合性實(shí)驗(yàn)一　龍須菜中半乳糖-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)課件

《基因工程》探索性綜合性實(shí)驗(yàn)一龍須菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(Galactose-1-phosphateuridylyltransferase，GPU）基因拷貝數(shù)的確定《基因工程》探索性綜合性實(shí)驗(yàn)一龍須菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰1背景情況介紹

Division:

Rhodophyta

Class:

Rhodophyceae

Sub-class:

Florideae

Order:

Gigartinales

Family:

Gracilariaceae背景情況介紹

Division:

Rhod2基因工程探索性綜合性實(shí)驗(yàn)一龍須菜中半乳糖--磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)課件3TGTAGCCAAAGCTGTGCGTGGAAAATGTCGCGTTGTCTGCTTCTCCCCGAAGCTCAACCTAACTGTCGCTGAAATGGCCGTCAAGGAGATCAAGGCCGTTGTTGATGCCTGGGTTGAGGAGTATGACACCCTCTCCAAGCTCGATTACATCGGCCACGTGCAGATCTTCGAGAACAAGGGACAGATGATGGGATGCTCCAACCCTCATCCTCACGGTCAGATCTGGGCATCTGAGTTCGTTCCAGAAGAGCCGCGCATCGCACTCGCCAATCTCAAAGCCTATCACACTAAGAAGGGAACCCACATGTTGGAGGACTACGTCAAACTCGAAATGGAAGCAAAGGAACGTATCGTATGTCAGAAT該基因已克隆于pMD18T質(zhì)粒載體上，長(zhǎng)度為364bp，現(xiàn)可提供含有該質(zhì)粒的甘油菌JM109TGTAGCCAAAGCTGTGCGTGGAAAATGTCG4實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求

根據(jù)題目通過(guò)網(wǎng)絡(luò)和雜志查閱文獻(xiàn)，提交實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備報(bào)告，內(nèi)容包括。題目名稱、原理、技術(shù)路線、具體實(shí)驗(yàn)步驟、需要使用的試劑（溶液）名稱及其具體配制方案、其它需要使用的消耗材料（需要器皿清單）注意事項(xiàng)：獨(dú)立完成

實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求根據(jù)題目通過(guò)網(wǎng)絡(luò)和雜志查閱文獻(xiàn)，提交實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備報(bào)5實(shí)驗(yàn)原理基因組DNA用多種不同的限制性內(nèi)切酶酶切，用GPU基因探針雜交，若有多拷貝，則應(yīng)有多個(gè)雜交帶，若多數(shù)酶切結(jié)果顯示單一條帶則為單拷貝。

技術(shù)路線

總DNA提取酶切GPU基因探針雜交顯示

實(shí)驗(yàn)原理基因組DNA用多種不同的限制性內(nèi)切酶酶切，用GPU基6SouthernBlot原理SouthernBlot原理7基因工程探索性綜合性實(shí)驗(yàn)一龍須菜中半乳糖--磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)課件8探針標(biāo)記（Random）探針標(biāo)記（Random）9實(shí)驗(yàn)材料和試劑（/組）

紅藻2.5g；CTAB緩沖液5ml；酚/氯仿/異戊醇抽提液2ml；10T/1E1ml；10T/0.1E1ml；3M醋酸鈉溶液1ml變性液20ml；中和液40ml；轉(zhuǎn)移液100ml；洗膜液I10ml；洗膜液II10ml；緩沖液I100ml；緩沖液II20ml；緩沖液III20ml；顯色液10ml；緩沖液IV30ml實(shí)驗(yàn)材料和試劑（/組）紅藻2.5g；CTAB緩沖液510實(shí)驗(yàn)步驟

1、紅藻總DNA的提取稱取2.5g藻，加1~2ml/gCTAB緩沖液（勿忘加巰基乙醇），加2gPVPP固體，在冰浴中用力充分研磨（大約半小時(shí)）。然后轉(zhuǎn)移于塑料離心管中在60-65℃溫浴30min，不時(shí)顛倒混合，加蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度100g/ml，50℃3h，不時(shí)顛倒混合，用等體積酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）（取下層有機(jī)相）抽提（顛倒混合）10min，12000rpm離心5min，取上清，用氯仿抽提5min，12000rpm離心5min。取上清液，加入2/3體積的異丙醇，顛倒混合，在-20℃下沉淀15min，再于室溫12000rpm離心15min，祛除上清，用1ml70%乙醇洗沉淀，12000rpm離心15min，祛除上清，空氣干燥沉淀。37℃下，把核酸溶在100-200lTE1（10mMTris-Hcl，pH8.0，1mMEDTA）10min，14000rpm離心5min。在不干擾沉淀的情況下，把上清液移到新的微量管中，加RNase(10mg/ml)至終濃度100g/ml，37℃消化30min，酚-氯仿抽提后，加1/10體積3M醋酸鈉和2倍體積的-20℃無(wú)水乙醇，立即離心使DNA沉淀，用70%的-20℃乙醇洗滌沉淀DNA，空氣干燥，把DNA溶在50lTE2（10mMTris，pH8.0，0.1mMEDTA）。實(shí)驗(yàn)步驟1、紅藻總DNA的提取112、取5l龍須菜總DNA制品加1/10體積載樣緩沖液做電泳檢測(cè)，并加5l分子量對(duì)照，目測(cè)定量。3、用3~4種（每組選擇一種）限制性內(nèi)切酶酶切5g/種，一般20l酶切體系/1gDNA（見(jiàn)說(shuō)明書）,等量放大。完全酶切過(guò)夜后于80v1.0%瓊脂糖凝膠電泳1h，并加5l分子量對(duì)照。記錄Marker各條帶及樣品位置，做Southern轉(zhuǎn)跡。4、探針的制備和標(biāo)記對(duì)提取的含目的基因的質(zhì)粒，按試劑盒說(shuō)明標(biāo)記探針及檢測(cè)標(biāo)記率，按試劑盒操作說(shuō)明P13表準(zhǔn)備標(biāo)記探針和對(duì)照，管2~9各1l點(diǎn)于膜上，膜自然晾干，80℃烘烤2h，進(jìn)行顯色操作。探針稀釋到終濃度10ng/l。2、取5l龍須菜總DNA制品加1/10體積載樣緩沖液做電125、SouthernBlot：將凝膠放入培養(yǎng)皿中，加入20ml變性液（沒(méi)過(guò)凝膠），搖動(dòng)變性1h，傾去變性液，用蒸餾水漂洗一次；換中和液20ml，搖動(dòng)1h，之間更換一次中和液；在電泳槽內(nèi)加適量轉(zhuǎn)移液20XSSC，中間支架放一濾紙條，濾紙兩端浸沒(méi)在20XSSC中，濾紙與支架間不能有氣泡，取出中和的凝膠，點(diǎn)樣孔朝下倒扣于濾紙上，用玻璃棒滾動(dòng)去除膠與濾紙的氣泡，剪一張與膠大小相同的NC膜，放在無(wú)菌蒸餾水表面，使之自然吸水下沉，將膜轉(zhuǎn)入20XSSC中浸泡5min，將濕潤(rùn)的膜蓋在凝膠上面，膜一經(jīng)與凝膠接觸，不可再移動(dòng)；將兩張與膜大小相同的濾紙置2XSSC溶液中濕潤(rùn)，蓋在膜上，排除氣泡，濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙（高8~10cm），吸水紙上壓0.5~1kg重物，轉(zhuǎn)移12h。

5、SouthernBlot：136、轉(zhuǎn)移后，在膜上做標(biāo)記，紫外檢測(cè)凝膠轉(zhuǎn)移效果，膜自然晾干，80℃烘烤2h。7、膜的預(yù)雜交、雜交和顯色。37~42℃預(yù)熱DigEasyHyb，以1.2ml/12cm2量添加該液，封膜，預(yù)雜交30min。探針100℃5min變性后迅速置于0℃，傾去預(yù)雜交液，以0.42ml/12cm2膜量加新預(yù)雜交液，添加10ng變性標(biāo)記探針，封膜，42℃雜交過(guò)夜或68℃6h水浴震蕩。雜交完成后倒出雜交液，將膜放入小燒杯中加5ml洗滌液I，rt洗滌5min，重復(fù)一次，倒出洗滌液，加5ml洗滌液II，68℃洗滌15min，重復(fù)一次，取出膜于濾紙上，空氣干燥。

6、轉(zhuǎn)移后，在膜上做標(biāo)記，紫外檢測(cè)凝膠轉(zhuǎn)移效果，膜自然晾干，14(以下為顯色過(guò)程)膜于小燒杯中加5ml緩沖液I，洗滌1min，倒去緩沖液I，加10ml緩沖液II，rt放置30min，倒去緩沖液II，家5ml緩沖液I，洗滌30s，取出膜置于培養(yǎng)皿內(nèi)，以5ml含<Dig>Ap結(jié)合物的緩沖液I/50cm2膜量（內(nèi)含<Dig>Ap抗體1l）添加，rt30min，取出膜置于小燒杯中，加10ml緩沖液I，洗滌15min，重復(fù)一次，倒去緩沖液I，加緩沖液III1.25ml，放置2min，（配制顯色液）傾去緩沖液III，加5ml顯色液，置于暗中靜止待顯色，顯色結(jié)束取出膜加3ml緩沖液IV，洗滌5min，空氣干燥。(以下為顯色過(guò)程)15實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：有毒害物質(zhì)及其處理（巰基乙醇、EB、苯酚/氯仿）設(shè)備（紫外透射儀、離心機(jī)）統(tǒng)籌兼顧、提前設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)周期：4~5天實(shí)驗(yàn)報(bào)告：實(shí)驗(yàn)原理、步驟、結(jié)果與討論、建議。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：16《基因工程》探索性綜合性實(shí)驗(yàn)二龍須菜、真江蘺、扁江蘺親緣關(guān)系研究《基因工程》探索性綜合性實(shí)驗(yàn)二龍須菜、真江蘺、扁江蘺親緣關(guān)系17分布GracilariaverrucosaIndonesiaGracilariaverrucosaItalyGracilariaverrucosaJapanGracilariaverrucosaKorea,NorthGracilariaverrucosaKorea,South分布GracilariaverrucosaIndonesia18Gracilariaspp.ItalyGracilariaspp.MalaysiaGracilariaspp.PortugalGracilariaspp.ThailandGracilariaspp.VietnamGracilariatenuistipitatavar.liuiChinaGracilariatenuistipitatavar.liuiPhilippinesGracilariatenuistipitatavar.liuiThailandGracilariatenuistipitatavar.liuiVietnamGracilariaverrucosaArgentinaGracilariaverrucosaEgyptGracilariaverrucosaFranceGracilariaspp.ItalyGracilarias19GracilariaheterocladaPhilippinesGracilariaheterocladaVietnamGracilariahoweiPeruGracilarialemaneiformisJapanGracilarialemaneiformisMexicoGracilarialemaneiformisPeruGracilarialongaItalyGracilariapacificaCanadaGracilariaparvisporaUnitedStatesofAmericaGracilariasalicorniaThailandGracilariasalicorniaVietnamGracilariaspp.BurmaGracilariaheterocladaPhilippin20GracilariaasisaticaChinaGracilariaasisaticaVietnamGracilariabursa-pastorisJapanGracilariacaudataBrazilGracilariachangiiThailandGracilariachilensisChileGracilariachilensisNewZealandGracilariacorneaBrazilGracilariacorneaCaribbeanGracilariacoronopiferaUnitedStatesofAmericaGracilariacoronopiferaVietnamGracilariacrassissimaCaribbeanGracilariaasisaticaChinaGracil21根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的紅藻基因序列，采用rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2進(jìn)行親源關(guān)系的研究。實(shí)驗(yàn)原理技術(shù)路線設(shè)計(jì)引物總DNA提取或裂解藻細(xì)胞PCR回收目的片段TA克隆轉(zhuǎn)化測(cè)序分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求同前根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的紅藻基因序列，采用rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)22真核生物rDNA結(jié)構(gòu)單元

真核生物rDNA結(jié)構(gòu)單元23SSUrDNAandITS*Curdiea/Melanthalia*Gracilariopsis/Gracilariophila:^Atlanticspecies*Gracilaria:^Atlanticcylindricalhenriquesiana/^gracilis/^domingensiscladesSSUrDNAandITS*Curdiea/Melan24ITS1:Pacific/Atlantic/cylindricalhenriquesianalineage/gracilislineage/flattedorcompressedAtlanticspecies-lowbootstrapvalueITS2:tikvahiaelineage-compressedtoflattedformswith“textorri”typespermatangiaandsimilarmorphology/cervicornislineage-lowbootstrap/flattedribbon-likespeciesITS1:Pacific/Atlantic25PCR技術(shù)原理PCR技術(shù)原理26循環(huán)

denature94C30S

annealingTm-5C

elongate72C

cycle25-35循環(huán)

denature94C30S

anneal27實(shí)驗(yàn)材料和試劑（/組）紅藻2.5g；CTAB緩沖液5ml；LB固體培養(yǎng)基100ml；LB液體培養(yǎng)基50ml；0.75mMCaCl220ml；預(yù)先準(zhǔn)備冰浴，研缽，60-65℃水浴/50℃水浴

實(shí)驗(yàn)材料和試劑（/組）紅藻2.5g；CTAB緩沖液5m28實(shí)驗(yàn)步驟

1、紅藻總DNA的提取-同前2、PCR反應(yīng)及感受態(tài)制備準(zhǔn)備：合成引物以ddH2O按說(shuō)明配制成50pmol/l。在25l反應(yīng)體系中按如下量和條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：10XPCRBuffer2.5l,10mMdNTP1l,primers0.5leach,25mMMg2+3l,Temp2l,Tag0.1l,以ddH2O補(bǔ)充終體積，液面加25l石蠟油;94C10min,94C1min1min,50C1min30s,72C2min,30circle?，F(xiàn)有兩對(duì)引物pair1（SNria和ASria）和pair2（SNria和ASsis），對(duì)龍須菜可選用任何一對(duì)引物，但對(duì)另外兩種紅藻，只能用pair1。要求5組混合后分裝（下有PCR反應(yīng)時(shí)同），各組分別加模板。PCR結(jié)束后取5l加1/6體積載樣緩沖液，電泳檢測(cè),加分子量對(duì)照。（4人/組）擴(kuò)增長(zhǎng)度與設(shè)計(jì)一致（應(yīng)為>1500bp），則相同條件擴(kuò)大至3X50l，反應(yīng)完成后，匯合，取5l加1/6體積載樣緩沖液，電泳檢測(cè)，其余以150l氯仿抽提，2倍體積無(wú)水乙醇沉淀過(guò)夜。固體LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)DH5。挑取單菌落接種于3mlLB/10ml管中，370C震蕩培養(yǎng)，12-16h。實(shí)驗(yàn)步驟1、紅藻總DNA的提取-同前293、感受態(tài)的制備：過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)菌按1%轉(zhuǎn)接量接種于20mlLB/100ml三角瓶中X2，370C震蕩培養(yǎng)2-3h,至對(duì)數(shù)前期，外觀微濁，00C，冰浴30min，無(wú)菌條件下，取1.5ml培養(yǎng)物于Ep管中，12000rpm離心2min，去上清，加750l0.75mMCaCl2懸浮，00C，冰浴15min，12000rpm離心2min，去上清，加100l0.75mMCaCl2懸浮，00C，冰浴1-2h，為感受態(tài)細(xì)胞。3、感受態(tài)的制備：304、制備1.0%瓊脂糖回收膠（梳齒以膠帶黏附合并），前述2沉淀以12000rpm離心10min,去上清，以30lTE溶解，加1/6體積載樣緩沖液電泳，按“DNA回收試劑盒”說(shuō)明回收條帶。5、按“pMD18T載體”試劑盒說(shuō)明進(jìn)行回收片段與載體的連接，其中pMD18T載體用0.5l，連接液(solutionI)用5l，總連接體積10l。4、制備1.0%瓊脂糖回收膠（梳齒以膠帶黏附合并），前述2沉316、轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物加入上述感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min，放入420C水浴中靜置60s,取出，冰浴1min，加入800lLB培養(yǎng)基，370C震蕩培養(yǎng)，45min，15,000rpm離心1min,去700l上清,各取100l涂布固體LB(Amp終濃度100g/ml)平板，共兩個(gè)，370C培養(yǎng)過(guò)夜。6、轉(zhuǎn)化：327、重組體檢測(cè)：以牙簽挑取單菌落轉(zhuǎn)接加Amp保存母板（每大組準(zhǔn)備一個(gè)保存母板，加Amp，并在平板背面劃格分割），同時(shí)在通用引物進(jìn)行的PCR檢測(cè)管中洗滌牙簽以加入模板（整個(gè)菌體為模板），檢測(cè)插入片段的長(zhǎng)度，在20l反應(yīng)體系中按如下量和條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：10XPCRBuffer2.5l,10mMdNTP0.4l,primers(U1/U2)0.1leach,25mMMg2+2.4l,Tag0.1l,以ddH2O補(bǔ)充終體積，液面覆蓋石蠟油;94C10min,94C1min30s,50C1min30s,72C1min30s,30circle。要求5組混合后分裝，各組分別加模板。7、重組體檢測(cè)：338、電泳檢測(cè)插入長(zhǎng)度正確的（1600~1700bp），在3ml含Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，取0.85ml培養(yǎng)菌液，加終濃度15%甘油，混合后送測(cè)序。9、序列同源性分析。軟件：Clustal/Macaw8、電泳檢測(cè)插入長(zhǎng)度正確的（1600~1700bp），在3m34實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：前述PCR反應(yīng)的均一性無(wú)菌操作實(shí)驗(yàn)周期：4~7天實(shí)驗(yàn)報(bào)告：實(shí)驗(yàn)原理、步驟、結(jié)果與討論、建議。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：35《基因工程》探索性綜合性實(shí)驗(yàn)一龍須菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(Galactose-1-phosphateuridylyltransferase，GPU）基因拷貝數(shù)的確定《基因工程》探索性綜合性實(shí)驗(yàn)一龍須菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰36背景情況介紹

Division:

Rhodophyta

Class:

Rhodophyceae

Sub-class:

Florideae

Order:

Gigartinales

Family:

Gracilariaceae背景情況介紹

Division:

Rhod37基因工程探索性綜合性實(shí)驗(yàn)一龍須菜中半乳糖--磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)課件38TGTAGCCAAAGCTGTGCGTGGAAAATGTCGCGTTGTCTGCTTCTCCCCGAAGCTCAACCTAACTGTCGCTGAAATGGCCGTCAAGGAGATCAAGGCCGTTGTTGATGCCTGGGTTGAGGAGTATGACACCCTCTCCAAGCTCGATTACATCGGCCACGTGCAGATCTTCGAGAACAAGGGACAGATGATGGGATGCTCCAACCCTCATCCTCACGGTCAGATCTGGGCATCTGAGTTCGTTCCAGAAGAGCCGCGCATCGCACTCGCCAATCTCAAAGCCTATCACACTAAGAAGGGAACCCACATGTTGGAGGACTACGTCAAACTCGAAATGGAAGCAAAGGAACGTATCGTATGTCAGAAT該基因已克隆于pMD18T質(zhì)粒載體上，長(zhǎng)度為364bp，現(xiàn)可提供含有該質(zhì)粒的甘油菌JM109TGTAGCCAAAGCTGTGCGTGGAAAATGTCG39實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求

根據(jù)題目通過(guò)網(wǎng)絡(luò)和雜志查閱文獻(xiàn)，提交實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備報(bào)告，內(nèi)容包括。題目名稱、原理、技術(shù)路線、具體實(shí)驗(yàn)步驟、需要使用的試劑（溶液）名稱及其具體配制方案、其它需要使用的消耗材料（需要器皿清單）注意事項(xiàng)：獨(dú)立完成

實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求根據(jù)題目通過(guò)網(wǎng)絡(luò)和雜志查閱文獻(xiàn)，提交實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備報(bào)40實(shí)驗(yàn)原理基因組DNA用多種不同的限制性內(nèi)切酶酶切，用GPU基因探針雜交，若有多拷貝，則應(yīng)有多個(gè)雜交帶，若多數(shù)酶切結(jié)果顯示單一條帶則為單拷貝。

技術(shù)路線

總DNA提取酶切GPU基因探針雜交顯示

實(shí)驗(yàn)原理基因組DNA用多種不同的限制性內(nèi)切酶酶切，用GPU基41SouthernBlot原理SouthernBlot原理42基因工程探索性綜合性實(shí)驗(yàn)一龍須菜中半乳糖--磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)課件43探針標(biāo)記（Random）探針標(biāo)記（Random）44實(shí)驗(yàn)材料和試劑（/組）

紅藻2.5g；CTAB緩沖液5ml；酚/氯仿/異戊醇抽提液2ml；10T/1E1ml；10T/0.1E1ml；3M醋酸鈉溶液1ml變性液20ml；中和液40ml；轉(zhuǎn)移液100ml；洗膜液I10ml；洗膜液II10ml；緩沖液I100ml；緩沖液II20ml；緩沖液III20ml；顯色液10ml；緩沖液IV30ml實(shí)驗(yàn)材料和試劑（/組）紅藻2.5g；CTAB緩沖液545實(shí)驗(yàn)步驟

1、紅藻總DNA的提取稱取2.5g藻，加1~2ml/gCTAB緩沖液（勿忘加巰基乙醇），加2gPVPP固體，在冰浴中用力充分研磨（大約半小時(shí)）。然后轉(zhuǎn)移于塑料離心管中在60-65℃溫浴30min，不時(shí)顛倒混合，加蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度100g/ml，50℃3h，不時(shí)顛倒混合，用等體積酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）（取下層有機(jī)相）抽提（顛倒混合）10min，12000rpm離心5min，取上清，用氯仿抽提5min，12000rpm離心5min。取上清液，加入2/3體積的異丙醇，顛倒混合，在-20℃下沉淀15min，再于室溫12000rpm離心15min，祛除上清，用1ml70%乙醇洗沉淀，12000rpm離心15min，祛除上清，空氣干燥沉淀。37℃下，把核酸溶在100-200lTE1（10mMTris-Hcl，pH8.0，1mMEDTA）10min，14000rpm離心5min。在不干擾沉淀的情況下，把上清液移到新的微量管中，加RNase(10mg/ml)至終濃度100g/ml，37℃消化30min，酚-氯仿抽提后，加1/10體積3M醋酸鈉和2倍體積的-20℃無(wú)水乙醇，立即離心使DNA沉淀，用70%的-20℃乙醇洗滌沉淀DNA，空氣干燥，把DNA溶在50lTE2（10mMTris，pH8.0，0.1mMEDTA）。實(shí)驗(yàn)步驟1、紅藻總DNA的提取462、取5l龍須菜總DNA制品加1/10體積載樣緩沖液做電泳檢測(cè)，并加5l分子量對(duì)照，目測(cè)定量。3、用3~4種（每組選擇一種）限制性內(nèi)切酶酶切5g/種，一般20l酶切體系/1gDNA（見(jiàn)說(shuō)明書）,等量放大。完全酶切過(guò)夜后于80v1.0%瓊脂糖凝膠電泳1h，并加5l分子量對(duì)照。記錄Marker各條帶及樣品位置，做Southern轉(zhuǎn)跡。4、探針的制備和標(biāo)記對(duì)提取的含目的基因的質(zhì)粒，按試劑盒說(shuō)明標(biāo)記探針及檢測(cè)標(biāo)記率，按試劑盒操作說(shuō)明P13表準(zhǔn)備標(biāo)記探針和對(duì)照，管2~9各1l點(diǎn)于膜上，膜自然晾干，80℃烘烤2h，進(jìn)行顯色操作。探針稀釋到終濃度10ng/l。2、取5l龍須菜總DNA制品加1/10體積載樣緩沖液做電475、SouthernBlot：將凝膠放入培養(yǎng)皿中，加入20ml變性液（沒(méi)過(guò)凝膠），搖動(dòng)變性1h，傾去變性液，用蒸餾水漂洗一次；換中和液20ml，搖動(dòng)1h，之間更換一次中和液；在電泳槽內(nèi)加適量轉(zhuǎn)移液20XSSC，中間支架放一濾紙條，濾紙兩端浸沒(méi)在20XSSC中，濾紙與支架間不能有氣泡，取出中和的凝膠，點(diǎn)樣孔朝下倒扣于濾紙上，用玻璃棒滾動(dòng)去除膠與濾紙的氣泡，剪一張與膠大小相同的NC膜，放在無(wú)菌蒸餾水表面，使之自然吸水下沉，將膜轉(zhuǎn)入20XSSC中浸泡5min，將濕潤(rùn)的膜蓋在凝膠上面，膜一經(jīng)與凝膠接觸，不可再移動(dòng)；將兩張與膜大小相同的濾紙置2XSSC溶液中濕潤(rùn)，蓋在膜上，排除氣泡，濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙（高8~10cm），吸水紙上壓0.5~1kg重物，轉(zhuǎn)移12h。

5、SouthernBlot：486、轉(zhuǎn)移后，在膜上做標(biāo)記，紫外檢測(cè)凝膠轉(zhuǎn)移效果，膜自然晾干，80℃烘烤2h。7、膜的預(yù)雜交、雜交和顯色。37~42℃預(yù)熱DigEasyHyb，以1.2ml/12cm2量添加該液，封膜，預(yù)雜交30min。探針100℃5min變性后迅速置于0℃，傾去預(yù)雜交液，以0.42ml/12cm2膜量加新預(yù)雜交液，添加10ng變性標(biāo)記探針，封膜，42℃雜交過(guò)夜或68℃6h水浴震蕩。雜交完成后倒出雜交液，將膜放入小燒杯中加5ml洗滌液I，rt洗滌5min，重復(fù)一次，倒出洗滌液，加5ml洗滌液II，68℃洗滌15min，重復(fù)一次，取出膜于濾紙上，空氣干燥。

6、轉(zhuǎn)移后，在膜上做標(biāo)記，紫外檢測(cè)凝膠轉(zhuǎn)移效果，膜自然晾干，49(以下為顯色過(guò)程)膜于小燒杯中加5ml緩沖液I，洗滌1min，倒去緩沖液I，加10ml緩沖液II，rt放置30min，倒去緩沖液II，家5ml緩沖液I，洗滌30s，取出膜置于培養(yǎng)皿內(nèi)，以5ml含<Dig>Ap結(jié)合物的緩沖液I/50cm2膜量（內(nèi)含<Dig>Ap抗體1l）添加，rt30min，取出膜置于小燒杯中，加10ml緩沖液I，洗滌15min，重復(fù)一次，倒去緩沖液I，加緩沖液III1.25ml，放置2min，（配制顯色液）傾去緩沖液III，加5ml顯色液，置于暗中靜止待顯色，顯色結(jié)束取出膜加3ml緩沖液IV，洗滌5min，空氣干燥。(以下為顯色過(guò)程)50實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：有毒害物質(zhì)及其處理（巰基乙醇、EB、苯酚/氯仿）設(shè)備（紫外透射儀、離心機(jī)）統(tǒng)籌兼顧、提前設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)周期：4~5天實(shí)驗(yàn)報(bào)告：實(shí)驗(yàn)原理、步驟、結(jié)果與討論、建議。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：51《基因工程》探索性綜合性實(shí)驗(yàn)二龍須菜、真江蘺、扁江蘺親緣關(guān)系研究《基因工程》探索性綜合性實(shí)驗(yàn)二龍須菜、真江蘺、扁江蘺親緣關(guān)系52分布GracilariaverrucosaIndonesiaGracilariaverrucosaItalyGracilariaverrucosaJapanGracilariaverrucosaKorea,NorthGracilariaverrucosaKorea,South分布GracilariaverrucosaIndonesia53Gracilariaspp.ItalyGracilariaspp.MalaysiaGracilariaspp.PortugalGracilariaspp.ThailandGracilariaspp.VietnamGracilariatenuistipitatavar.liuiChinaGracilariatenuistipitatavar.liuiPhilippinesGracilariatenuistipitatavar.liuiThailandGracilariatenuistipitatavar.liuiVietnamGracilariaverrucosaArgentinaGracilariaverrucosaEgyptGracilariaverrucosaFranceGracilariaspp.ItalyGracilarias54GracilariaheterocladaPhilippinesGracilariaheterocladaVietnamGracilariahoweiPeruGracilarialemaneiformisJapanGracilarialemaneiformisMexicoGracilarialemaneiformisPeruGracilarialongaItalyGracilariapacificaCanadaGracilariaparvisporaUnitedStatesofAmericaGracilariasalicorniaThailandGracilariasalicorniaVietnamGracilariaspp.BurmaGracilariaheterocladaPhilippin55GracilariaasisaticaChinaGracilariaasisaticaVietnamGracilariabursa-pastorisJapanGracilariacaudataBrazilGracilariachangiiThailandGracilariachilensisChileGracilariachilensisNewZealandGracilariacorneaBrazilGracilariacorneaCaribbeanGracilariacoronopiferaUnitedStatesofAmericaGracilariacoronopiferaVietnamGracilariacrassissimaCaribbeanGracilariaasisaticaChinaGracil56根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的紅藻基因序列，采用rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2進(jìn)行親源關(guān)系的研究。實(shí)驗(yàn)原理技術(shù)路線設(shè)計(jì)引物總DNA提取或裂解藻細(xì)胞PCR回收目的片段TA克隆轉(zhuǎn)化測(cè)序分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求同前根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的紅藻基因序列，采用rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)57真核生物rDNA結(jié)構(gòu)單元

真核生物rDNA結(jié)構(gòu)單元58SSUrDNAandITS*Curdiea/Melanthalia*Gracilariopsis/Gracilariophila:^Atlanticspecies*Gracilaria:^Atlanticcylindricalhenriquesiana/^gracilis/^domingensiscladesSSUrDNAandITS*Curdiea/Melan59ITS1:Pacific/Atlantic/cylindricalhenriquesianalineage/gracilislineage/flattedorcompressedAtlanticspecies-lowbootstrapvalueITS2:tikvahiaelineage-compressedtoflattedformswith“textorri”typespermatangiaandsimilarmorphology/cervicornislineage-lowbootstrap/flattedribbon-likespeciesITS1:Pacific/Atlantic60PCR技術(shù)原理PCR技術(shù)原理61循環(huán)

denature94C30S

annealingTm-5C

elongate72C

cycle25-35循環(huán)

denature94C30S

anneal62實(shí)驗(yàn)材料和試劑（/組）紅藻2.5g；CTAB緩沖液5ml；LB固體培養(yǎng)基100ml；LB液體培養(yǎng)基50ml；0.75mMCaCl220ml；預(yù)先準(zhǔn)備冰浴，研缽，60-65℃水浴/50℃水浴

實(shí)驗(yàn)材料和試劑（/組）紅藻2.5g；CTAB緩沖液5m63實(shí)驗(yàn)步驟

1、紅藻總DNA的提取-同前2、PCR反應(yīng)及感受態(tài)制備準(zhǔn)備：合成引物以ddH2O按說(shuō)明配制成50pmol/l。在25l反應(yīng)體系中按如下量和條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：10XPCRBuffer2.5l,10mMdNTP1l,primers0.5leach,25mMMg2+3l,Temp2l,Tag0.1l,以ddH2O補(bǔ)充終體積，液面加25l石蠟油;94C10min,94C1min1min,50C1min30s,