基因工程原理課件

第六章基因工程原理第一節(jié)基因工程的概念及其主要內(nèi)容第二節(jié)基因工程中的工具酶第三節(jié)基因克隆的質(zhì)粒載體第四節(jié)目的基因的分離第五節(jié)基因與載體的重組與導(dǎo)入受體細(xì)胞第六節(jié)重組體的篩選第七節(jié)目的基因的表達(dá)第六章基因工程原理第一節(jié)基因工程的概念及其主要內(nèi)容1第一節(jié)基因工程的概念及其主要內(nèi)容一、基因工程的概念：利用DNA體外重組或PCR擴增技術(shù)從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反應(yīng)形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，以期獲得基因表達(dá)的過程.第一節(jié)基因工程的概念及其主要內(nèi)容一、基因工程的概念：2基因工程(geneengineering)常和以下名稱混用遺傳工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重組DNA技術(shù)(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名詞時指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系.作動詞時是指基因的分離與重組過程?；蚬こ?geneengineering)常和以下名稱混用3二、基因工程的主要內(nèi)容或（步驟）1、從復(fù)雜的生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段。2、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞(亦稱寄主細(xì)胞)，并與之一起增殖。4、從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。5、從這些篩選出來的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用。6、將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。二、基因工程的主要內(nèi)容或（步驟）1、從復(fù)雜的生物有機體基因組4三、基因工程技術(shù)及其應(yīng)用三、基因工程技術(shù)及其應(yīng)用5轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物6轉(zhuǎn)基因動物作為生物發(fā)生器轉(zhuǎn)基因動物作為生物發(fā)生器7基因本身也是一個產(chǎn)業(yè)Rockfeller大學(xué)將人肥胖基因出售0.2億美元（1995年3月）Amgen公司將FKBP神經(jīng)免疫因子配體轉(zhuǎn)讓達(dá)3.29億美元（1997年）Millennium公司以4.65億美元向Bayer公司轉(zhuǎn)讓225種基因的開發(fā)權(quán)（1998年9月）基因本身也是一個產(chǎn)業(yè)Rockfeller大學(xué)將人肥胖基因出8蛋白質(zhì)工程的概念

在基因工程技術(shù)對編碼蛋白質(zhì)的基因的了解基礎(chǔ)上，對蛋白質(zhì)的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，進(jìn)而通過對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、氨基酸序列和翻譯后的修飾等手段改變甚至創(chuàng)造出新的和更有效的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程的概念在基因工程技術(shù)對編碼蛋白質(zhì)的9蛋白質(zhì)工程主要內(nèi)容主要目標(biāo)蛋白質(zhì)氨基酸序列的分析蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)功能預(yù)測和分析蛋白質(zhì)組分析蛋白質(zhì)工程主要內(nèi)容主要目標(biāo)10酶工程的概念是酶學(xué)與工程學(xué)的相互滲透和結(jié)合所發(fā)展起來以酶為研究對象，改造并應(yīng)用酶的特異催化功能。目標(biāo)就是通過工程化技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化相應(yīng)原料成為有用物質(zhì)的技術(shù)。傳統(tǒng)的酶工程主要是指天然酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)與應(yīng)用。隨著科學(xué)的發(fā)展，尤其是基因工程技術(shù)的日趨完善，為酶工程賦予了新的內(nèi)容，特別是利用DNA操作技術(shù)，修飾改造酶分子的結(jié)構(gòu)或活性位點、酶與底物作用位點，重組酶的生產(chǎn)，模擬酶的人工設(shè)計與合成等成為新的內(nèi)容。酶工程的概念是酶學(xué)與工程學(xué)的相互滲透和結(jié)合所發(fā)展起來以酶為研11

酶工程的主要內(nèi)容酶的分離純化酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)及反應(yīng)器酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)酶分子化學(xué)修飾、遺傳突變及結(jié)構(gòu)改造酶抑制劑與激活劑開發(fā)與研究人工設(shè)計與合成模擬酶及酶分子酶工程的主要內(nèi)容酶的分離純化12發(fā)酵工程概念

發(fā)酵工程屬于生物技術(shù)的下游技術(shù)，是工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞、生產(chǎn)生物制品的一種技術(shù)。傳統(tǒng)的發(fā)酵工程主要用于微生物?，F(xiàn)代生物技術(shù)還包括動物、植物細(xì)胞和工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵工程概念發(fā)酵工程屬于生物技13發(fā)酵工程技術(shù)發(fā)酵對象：傳統(tǒng)微生物發(fā)酵、基因工程菌發(fā)酵、動物細(xì)胞培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵類型：液體發(fā)酵、固體發(fā)酵、固定化培養(yǎng)、流式發(fā)酵發(fā)酵技術(shù)設(shè)備發(fā)酵工程技術(shù)發(fā)酵對象：14生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)藥：生物制藥；基因治療；人工器官農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)

轉(zhuǎn)基因植物：抗病蟲害新品種、抗逆新品種、高品質(zhì)新品種

轉(zhuǎn)基因動物：生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)和高品質(zhì)的畜產(chǎn)品

生物反應(yīng)器：利用動植物細(xì)胞或組織作為生物反應(yīng)器，直接生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)輕工與食品新型食品；營養(yǎng)食品；保健食品；輕工用酶

環(huán)境

污染治理；廢物利用；污染物生物降解生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)藥：生物制藥；基因治療；人工器官15生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)：利用細(xì)胞和生物分子進(jìn)行藥品、農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)開發(fā)和環(huán)境治理的產(chǎn)業(yè)，該產(chǎn)業(yè)技術(shù)由醫(yī)藥生物技術(shù)、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)共同組成醫(yī)藥生物技術(shù)重點攻克癌癥、艾滋病、老年癡呆癥、帕金森病、心臟病、糖尿病等危害人類的頑疾農(nóng)業(yè)生物技術(shù)著眼于提高農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。環(huán)境生物技術(shù)重點用于清除危險廢棄物

生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)：利用細(xì)胞和生物分子進(jìn)行藥品、農(nóng)產(chǎn)16生物制藥產(chǎn)業(yè)化特點高技術(shù)：高層次人才，高新技術(shù)手段，多學(xué)科滲透高投入：在國外，一個生物藥品平均要投入1~3億美元，并隨著開發(fā)難度的增大,有逐步增高的趨勢長周期：國際上，一個新的生物藥品需要6~8年時間高風(fēng)險:一個新藥品的開發(fā)，經(jīng)過一系列的程序-研發(fā)、中試、動物實驗、I~III期臨床實驗，上市和嚴(yán)格的藥政監(jiān)督管理。每一步都可能失敗，而前功盡棄高回報:開發(fā)成功一個新的生物藥品,回報很高。如美國Amgen公司，首次開發(fā)上市的EPO、G-SCF到1997年的銷售額分別接近和達(dá)到20億美元生物制藥產(chǎn)業(yè)化特點高技術(shù)：高層次人才，高新技術(shù)手段，多學(xué)科滲17基因工程試劑的高回報堿性成纖維細(xì)胞生長因子231元/ug紅細(xì)胞生成素1072元/ug白細(xì)胞介素-2410元/ug巨細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子1960元/ug胰島素10.2元/mg基因工程試劑的高回報堿性成纖維細(xì)胞生長因子218美國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展情況美國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展情況19

美國生物制藥產(chǎn)品種類及數(shù)量（PHRAM）疾病種類產(chǎn)品數(shù)量疾病種類產(chǎn)品數(shù)量感染性疾病39心臟病26神經(jīng)系統(tǒng)疾病28呼吸系統(tǒng)疾病22艾滋病及相關(guān)疾病19自主免疫系統(tǒng)疾病19皮膚病19移植13消化系統(tǒng)疾病11遺傳疾病11血液疾病9糖尿病及并發(fā)癥7不育癥5眼病3生長發(fā)育不良癥3骨質(zhì)疏松2妊娠預(yù)防2腫瘤疾病175

美國生物制藥產(chǎn)品種類及數(shù)量（PHRAM）疾病種類20基因治療人數(shù)情況基因治療人數(shù)情況21生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化—農(nóng)業(yè)領(lǐng)域已有35個科120多種植物獲得轉(zhuǎn)基因植物，一些重要的農(nóng)作物獲得商品化的轉(zhuǎn)基因品種。種植面積迅猛發(fā)展。采用的基因正在從抗除草劑、抗菌素、抗病蟲害基因到抗逆境、高品質(zhì)方向發(fā)展。由單個質(zhì)量性狀基因向多基因數(shù)量性狀轉(zhuǎn)變。植物反應(yīng)器生產(chǎn)稀有蛋白。生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化—農(nóng)業(yè)領(lǐng)域22世界轉(zhuǎn)基因作物大田釋放情況

(1987.1-1998.4)轉(zhuǎn)基因作物特性批準(zhǔn)項數(shù)所占比例抗除草劑129729.6%抗蟲104623.8%提高產(chǎn)品質(zhì)量88620.2%抗病毒4369.9%改善農(nóng)學(xué)性狀2114.8%抗真菌病2084.7%其他3036.9%總計4387100%世界轉(zhuǎn)基因作物大田釋放情況

(1987.1-1998.4)轉(zhuǎn)23轉(zhuǎn)基因作物種植面積轉(zhuǎn)基因作物種植面積24生物技術(shù)與傳統(tǒng)中藥中藥現(xiàn)代化——核心是建立與現(xiàn)代基因?qū)W說相應(yīng)的現(xiàn)代中藥理論現(xiàn)代中藥理論的建立——確立中藥與基因表達(dá)的關(guān)系

中藥藥靶（基因）或作用位點基因的尋找

中藥化學(xué)組：中藥有效成分包括較單一的成分和多種成分

中藥臨床藥效的科學(xué)評價與分析方法生物技術(shù)的應(yīng)用

中藥基因組——利用現(xiàn)代生物技術(shù)研究分析中藥對人體（細(xì)胞）基因表達(dá)（蛋白質(zhì)）的影響。技術(shù)平臺：大規(guī)?；虮磉_(dá)分析（基因芯片、SAGE、蛋白質(zhì)組等技術(shù)）以及相關(guān)信息數(shù)據(jù)庫的建立

中藥化學(xué)組——利用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)分析有效成分及其藥物代謝、動力學(xué)。技術(shù)平臺：色譜及色譜-質(zhì)譜，色譜-波譜，波譜-波譜聯(lián)用等分析技術(shù)與層析、臨界萃取等分離技術(shù)

中藥新劑型生物技術(shù)與傳統(tǒng)中藥中藥現(xiàn)代化——核心是建立與現(xiàn)代基因?qū)W說相應(yīng)25第二節(jié)基因工程中的工具酶限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類--用于生物細(xì)胞的破壁，轉(zhuǎn)化，核酸純化，檢測等第二節(jié)基因工程中的工具酶限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的26一、限制性內(nèi)切酶（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名（三）、限制酶的特點（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）（五）、限制酶的用途一、限制性內(nèi)切酶（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類27（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類1.

I型：由三個基因構(gòu)成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色體上，三個基因構(gòu)成一個復(fù)合體，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），無特異切割位點。2.

II型：限制與修飾基因產(chǎn)物獨立起作用，在Ｅ.coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。3.

III型：修飾酶與Ｉ型酶相同，hsdＭ與hsdＳ基因產(chǎn)物結(jié)合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。

上述三個系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類1.

I型：由三個基因構(gòu)成，hsd28（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名

1.定義：廣義指上述三個系統(tǒng)中的限制酶；狹義指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。例如：HindⅢ前三個字母來自于菌種名稱H.

influenzae，“ｄ”表示菌系為ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個限制酶。EcoRI—Escherichiacoli

RI

HindⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenes

I(Ⅱ)（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名1.定義：廣義指上述29（三）、限制酶的特點

1.識別順序和酶切位點

１）識別４-8個相連的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外側(cè)，產(chǎn)生５’-端突起

２）富含ＧＣ（三）、限制酶的特點1.識別順序和酶切位點30

３）對稱性—雙對稱

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４）切點大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外５）限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是５’-Ｐ和３’-ＯＨ2.

末端種類

１）３’-端突起，個數(shù)為２或４個核苷酸

PstI

5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２）５’-端突起，個數(shù)為２或４個核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’

粘性末端能與另一個相同的粘連末端相連接，任何兩個具有相同識別位點的DNA分子經(jīng)限制酶切割后能夠重新連接成新的重組DNA分子。在進(jìn)行DNA重組時，應(yīng)用限制酶同時切割目的基因和載體DNA，使之產(chǎn)生相對的粘性末端，然后再將二者連接成重組DNA分子３）對稱性—雙對稱31３）

平齊末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互補的粘性末端ａ）切點在識別順序之外的，如：FokI

FokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能識別簡并順序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

３）

平齊末端32（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶2.特點：1）識別相同順序2）切割位點的異同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）33（五）、限制酶的用途

1.

DNA重組2.

限制酶（物理）圖譜繪制3.

突變分析（RFLP分析）4.限制酶的部分酶切與完全酶切附：IIS型限制酶的特點1.

具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結(jié)構(gòu)。2.

酶切位點與識別位點不一致，切點常在識別位點的一側(cè)，1--20nt。3.

酶切后的末端經(jīng)補平后又可發(fā)生酶切反應(yīng)。4.

產(chǎn)生粘性末端可以是1--5個核苷酸。5.

均為單體，分子量為47—108kD。（五）、限制酶的用途1.

DNA重組34酶切圖譜的構(gòu)建（a）請構(gòu)建該環(huán)狀DNA分子的酶切圖譜酶切圖譜的構(gòu)建（a）請構(gòu)建該環(huán)狀DNA分子的酶切圖譜35酶切圖譜的構(gòu)建（b）酶切圖譜的構(gòu)建（b）36二、DNA甲基化酶

（一）、甲基化酶的種類與識別順序1.

限制修飾系統(tǒng)I、II、III型中的甲基化酶三個系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤。在DNA重組實驗中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應(yīng)的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。如：M.EcoRI

GA

mATTCC

EcoRI

GAATTC

不同

M．HpaI

C

mCGG

HpaI

CCGG相同二、DNA甲基化酶

（一）、甲基化酶的種類與識別順序1.

372.

II型甲基化酶對限制酶活性的影響

１）

抑制同種限制酶的活性

M.BamHIGGATmCC—BamHI(GGATCC)M.EcoRIGAmATTC—EcoRI(GAATTC)

２）

抑制不同種限制酶的活性a.順序完全重疊如：M.ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA）b.順序邊界重疊如：M.BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG）

３）

抑制不同種限制酶的部分活性M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.

甲基化酶的用途

１）

改變某些限制酶識別順序的特異性，以便重組體的形成２）

在建立基因文庫時，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切2.

II型甲基化酶對限制酶活性的影響38M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭RE用于基因組文庫的建立用于cDNA的連接REREREM.RECH3CH3CH3RERERERERERERERER39三、核酸酶

（一）、外切酶III（ExoIII）

1.一般特點：

來自于E.coli，分子量28,000kD

2.催化反應(yīng)類型

1)外切酶活性：3’→5’，產(chǎn)生5’-單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的ds-DNA，pH7.6-8.52)核酸酶H活性：除去DNA-RNA雜交分子中的RNA分子，pH7.6-8.53)3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反應(yīng)，pH6.8-7.44)內(nèi)切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將DNA鍵切開，pH7.6-8.5三、核酸酶

（一）、外切酶III（ExoIII）1.403.

外切酶活性特點

1)反應(yīng)底物：互補ds-DNA2)堿基釋放速度：C>>A-T>>G3)反應(yīng)產(chǎn)物：5’-單磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，過度反應(yīng)將導(dǎo)致DNA降解

4.

用途

1)

核酸（DNA）標(biāo)記2)

基因突變----缺失3)

DNA序列測定時作順序缺失

5.

使用注意事項

1)

正式使用前，測定在一定條件下酶的反應(yīng)速度2)

在一定條件下，ExoIII不能作用GC富集區(qū)(來自于cDNA加尾)3.

外切酶活性特點41ds-DNA結(jié)構(gòu):切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'ds-DNA結(jié)構(gòu):切口,缺口,斷口缺口(gap)425'P5'P5'P5'P5'P3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HOOH3'OH3'OH3'OH3'P5'P5'P5'P5'P5'P5'P5'3'HOP5'OH3'P5'RNaseHExoIII的外切酶和RNaseH的作用5'P5'P5'P5'P5'P3'HO3'HO3'HO3'H431234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于順序缺失ExoIII

ExoIII

[α-32P]

[α-32P]

dCTP

dCTP

5'PP5'5'PP5'3'HOOH3'3'HOOH3'ExoIII用于DNA標(biāo)記1234abc123444（二）、Rnase（三）、RNaseH（二）、RNase

大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA樣品或蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的RNA分子。

1.RNaseA分離自牛胰臟，對熱穩(wěn)定，抗去污劑（100℃加熱15min仍具活性）,用于除去DNA樣品中的RNA分子

2.核酸酶S7，亦稱微球菌核酸酶，對RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源mRNA

（三）、RNaseH

作用于DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈，用于cDNA文庫建立時除去RNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成。

（二）、Rnase（三）、RNaseH（二）、RNase45（四）、DNaseI1.特點：具內(nèi)切酶活性，作用于ds-DNA，但無核苷酸序列特異型，產(chǎn)生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或Ca2+,Mn2+可使酶活達(dá)最大值當(dāng)酶濃度很低時，ds-DNA分子上將形成切口，不同類型二價陽離子對兩條鏈上切口位置形成有以下影響：Mg2+存在時，兩條鏈上的切口獨立無關(guān)，Mn2+存在時，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置

2.用途

1)切口移位，制備DNA探針2)制備RNA樣品時除去DNA分子3)基因突變時產(chǎn)生切口

（四）、DNaseI1.特點：具內(nèi)切酶活性，作用于ds46

Mn++存在時

Mg++存在時

DNaseI作用特點DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI與PolI的切口移位PolIMn++存在時Mg++存在時DNaseIDNaseI47四、DNA聚合酶（一）、E.coliDNA聚合酶I（polI）

1.E.coli的DNA聚合酶系統(tǒng)

PolI參與DNA修復(fù),具3’→5’和5’→3’外切酶活性polII同上具3’→5’外切酶活性polIII參與DNA復(fù)制,具3’→5’和5’→3’外切酶活性

2.E.colipolI的特點

1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦稱為Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響3）外切酶活性

四、DNA聚合酶（一）、E.coliDNA聚合酶I（pol483.用途

1）除去3’-端突起的單鏈DNA（在無dNTP時）2）補齊5’-突起端3）合成第二條cDNA4）切口移位制備探針其中用途2)和3)常用大片段3.用途49（二）、T4DNA聚合酶

1.特點：

5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,為polI的兩倍3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分別為40和4000nt/min

2.

用途：

制備高比活性探針(1010cpm/μgDNA);DNA末端修飾---缺失

外切酶活性

聚合酶活性

無dNTPdNTP（二）、T4DNA聚合酶1.特點：外切酶50（三）、TaqDNA聚合酶1.特點：

分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75℃，對95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性2.用途：

主要用于DNA的體外擴增，經(jīng)25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個DNA分子因而可被擴增4×106倍。DNA擴增技術(shù)又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它包括以下三個步驟：DNA模板變性(95℃)→與DNA引物退火(45℃)→

引物延伸(75℃)

（三）、TaqDNA聚合酶1.特點：51TaqPol和PCR

5’3’變性

3’5’

5’3’引物

3’5’復(fù)性

5’3’5’3’

3’5’引物3’5’5’3’延伸

5’3’3’5’

3’5’

TaqPol和PCR5’52五、連接酶（一）、T4DNA連接酶

1.特點：

只連接ds-DNA分子，要求3’-羥基和5’-磷酸基

2.用途：

1)相同或相容粘性末端的連接2)平整末端的相連DNA平端來源：限制酶作用結(jié)果;限制酶與其它酶共同作用結(jié)果。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多

五、連接酶（一）、T4DNA連接酶535’-AAGCTT-3’5’-AOH

PAGCTT-3’PAGCTTAOH3’-TTCGAA-5’3’-TTCGAP

HOA-5’HOATTCGAP

退火5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’或

5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’

T4DNA連接酶5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’或

5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’T4DNA連接酶的連接反應(yīng)(兩種插入方向)

+5’-AAGCTT-3’5’-AOHPAG54第三節(jié)分子克隆的質(zhì)粒載體

一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性；二、質(zhì)粒DNA的分離與純化；三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型；四、常用質(zhì)粒載體舉例；第三節(jié)分子克隆的質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性；55一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性（一）、質(zhì)粒DNA1、質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能夠自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈的DNA分子。2、編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。R質(zhì)?？蓪⑵淇剐赞D(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。2、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。3、質(zhì)粒DNA不僅能在細(xì)菌中復(fù)制，并且在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。4、環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型：共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），開環(huán)DNA（ocDNA），線性DNA（cDNA），具有不同的電泳遷移率，可在瓊脂糖凝膠電泳中分開。一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性（一）、質(zhì)粒DNA56基因工程原理課件57（二）、質(zhì)粒的拷貝數(shù)與不親和性1、質(zhì)粒的拷貝數(shù)是指某種質(zhì)粒在一個細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的數(shù)目。根據(jù)每個寄主細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為1-5個）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200份拷貝）。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。2、質(zhì)粒的不親和性，有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細(xì)胞的增殖構(gòu)成中，其中必然有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。（二）、質(zhì)粒的拷貝數(shù)與不親和性1、質(zhì)粒的拷貝數(shù)是指某種質(zhì)粒在58二、質(zhì)粒DNA的分離與純化（放在實驗中講）二、質(zhì)粒DNA的分離與純化（放在實驗中講）59三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型（一）質(zhì)粒載體的發(fā)展概況；（二）質(zhì)粒載體的特點（基本條件）；（三）遺傳標(biāo)記基因（四）質(zhì)粒載體的類型三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型（一）質(zhì)粒載體的發(fā)展概況；60（一）發(fā)展概況

1.

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)

2.

第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。

3.第三階段：進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。

（一）發(fā)展概況1.

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)61（二）載體特點1、至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。2、

至少應(yīng)有一個克隆位點，以供外源DNA插入。3、

至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞。4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。注：前三個特點必不可少。（二）載體特點1、至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物62（三）遺傳標(biāo)記基因1、標(biāo)記基因的作用1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞這種指示可以是選擇性的（Ampr，Tetr，Kanr），也可以是非選擇性的（如lacZ）2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。*這種指示也可以是選擇性的（如TcS），也可以是非選擇性的（如TcS，

lacZα），絕大多數(shù)為后者。

**有的遺傳標(biāo)記基因可以完成上述兩項作用。當(dāng)充任第一作用時，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時，目前多采用非選擇性的—檢測性標(biāo)記基因。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（lacZ等）。（三）遺傳標(biāo)記基因1、標(biāo)記基因的作用632、

標(biāo)記基因的種類

1）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）主要是抗生素抗性基因:Ampr，Tetr，Cmlr，Kanr，Strr2）生化標(biāo)記基因

其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ3、常用的遺傳標(biāo)記基因及其作用機制

1)四環(huán)素抗性基因（Tetr，Tcr）

Tetracycline可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399AAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。

2)氨芐青霉素抗性基因（Ampr，Apr）

Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，可特異地切割氨芐青霉素的β—內(nèi)酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。2、

標(biāo)記基因的種類643)氯霉素抗性基因（Cmlr，Cmr）

Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體50S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；?，導(dǎo)致乙酰化的氯霉素不能結(jié)合在核糖體上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因

Kanamycin，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。Kanr等抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。3)氯霉素抗性基因（Cmlr，Cmr）655）β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補作用。這兩個部分可獨立存在，分別由兩個基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZα）均可作為標(biāo)記基因。

lacZ（lacZα）中含有多克隆位點，當(dāng)無外源DNA片段插入時，質(zhì)粒表達(dá)β—半乳糖苷酶的α-肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼α-肽）表達(dá)的lacZ基因產(chǎn)物（β鏈）互補，產(chǎn)生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示劑X-gal和誘導(dǎo)劑IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因的插入后，破壞了lacZα-肽基因的結(jié)構(gòu)，細(xì)菌內(nèi)不能產(chǎn)生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。β—半乳糖苷酶基因的優(yōu)點:

a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀b.

lacZα編碼5‘-端可容許很大的變化（如加入多克隆位點）而不影響酶活性c.lacZα和β鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）66

PLacZαLacZβ

轉(zhuǎn)錄

翻譯

αβLacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18BamHI片段重組DNA分子轉(zhuǎn)化E.coli外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子PLacZαL67（四）、質(zhì)粒載體的類型1、根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分

（1）.

質(zhì)粒型載體—環(huán)狀dsDNA分子，自主復(fù)制（2）.

病毒型載體—環(huán)狀、線狀、ss-和ds-DNA分子，形成病毒顆粒（3）.混合型載體—具質(zhì)粒和病毒特性，特性的轉(zhuǎn)換依賴于宿主細(xì)胞生物學(xué)特性

（四）、質(zhì)粒載體的類型1、根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分682、根據(jù)載體功能劃分

（1）.普通型載體1)特點:至少有一個以上的克隆位點和兩個標(biāo)記基因，其中一個用于轉(zhuǎn)化體選擇，另一個用于重組子檢測。2)用途:基因組或cDNA文庫的構(gòu)建;次克隆(subcloning)或限制酶譜分析；外源DNA擴增。例子:pBR322和pUC載體。

上述兩例中的非重組子來源有兩個：

a.

酶切反應(yīng)時仍未被作用的pBR322或pUC18分子b.酶切后的載體分子經(jīng)自我連接又形成載體分子2、根據(jù)載體功能劃分69普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖70pUC18和pUC19載體pUC18和pUC19載體71（2）、表達(dá)型載體（expressionvector）1)

特點:

a.

基因的啟動子序列和終止子序列；b.

一般無檢測標(biāo)記基因；c.

克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）；d.

重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。2)

結(jié)構(gòu):

a.

轉(zhuǎn)化單元--宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化b.

表達(dá)單元--外源基因表達(dá)3)類型:

Ⅰ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列+啟動子）+終止子

Ⅱ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子+翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子）+終止子

Ⅲ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)+信號肽鏈編碼區(qū)+終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體）（2）、表達(dá)型載體（expressionvector）72三種表達(dá)型載體結(jié)構(gòu)圖三種表達(dá)型載體結(jié)構(gòu)圖73顯然,不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提供。換言之,被表達(dá)的外源基因一旦確定,表達(dá)載體的類型也就確定了。4)用途:a.

表達(dá)外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物b.

用于構(gòu)建cDNA文庫顯然,不同類型載體中所缺少的部分必須由外源基因提74四、常用質(zhì)粒載體舉例1、pBR322載體2、pUC載體四、常用質(zhì)粒載體舉例1、pBR322載體751、pBR322載體優(yōu)點：1、分子量較小，為4363bp，不僅利于自身DNA的純化，可容納的外源DNA也較大。2、具有兩種抗菌素抗性基因可供轉(zhuǎn)化子的選擇記號。3、具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素擴增后，每個細(xì)胞中可累積1000-3000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。1、pBR322載體優(yōu)點：76

BamHI片段(Tcr)

pBR322PstI(Apr)片段

重組分子I

重組分子Ⅱ(ApsTcr)(AprTcs）

PstI片段

外源DNABamHI片段重組分子I

涂布Ap平板Apr轉(zhuǎn)化子

分別轉(zhuǎn)化E.coli(ApSTcS)重組分子Ⅱ涂布Tc平板Tcr轉(zhuǎn)化子影印到Tc平板上AprTcS為重組子AprTcr為原載體

影印到Ap平板上ApSTcr為重組子即為非重組子利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程BamHI片段(Tcr)pBR322PstI(Apr)片77篩選重組子的示意圖篩選重組子的示意圖782、pUC18和pUC19

pUC系列質(zhì)粒載體具有三個顯著特點：（1）、分子量更小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（不用氯霉素擴增，每個細(xì)胞含500-700個拷貝）。（2）、含易于檢測是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZα，可利用-互補原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。（3）、多克隆位點區(qū)（MCS）由人工合成的多個單一酶切位點構(gòu)成。每一種限制性內(nèi)切酶會產(chǎn)生不同的粘性末端，可選用兩種內(nèi)切酶組合在質(zhì)粒載體和外源DNA上產(chǎn)生相同的末端，進(jìn)行雙粘端連接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。其MCS區(qū)與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到M13mp載體，進(jìn)行DNA測序和體外突變等研究。2、pUC18和pUC19pUC系列79pUC18和pUC19載體pUC18和pUC19載體80利用菌落顏色篩選重組子利用菌落顏色篩選重組子81分子克隆載體的選擇1.選擇克隆載體的幾個重要參數(shù)（1）實驗對象（2）實驗性質(zhì)（3）載體容量（4）合適克隆位點（5）載體的穩(wěn)定性（6）載體DNA制備的難易（7）外源基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點等分子克隆載體的選擇1.選擇克隆載體的幾個重要參數(shù)822.

實驗對象（1）供體：遺傳背景與DNA特點等，其中包括染色體DNA大小，基因大小與結(jié)構(gòu)，堿基組成，目的基因的產(chǎn)物特點以及遺傳物質(zhì)的傳遞方式等。（2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質(zhì)的傳遞方式(包括人為的方法)，DNA限制修飾系統(tǒng)，DNA重組基因特點，基因產(chǎn)物修飾系統(tǒng)，即轉(zhuǎn)錄與翻譯后修飾系統(tǒng)。如常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。如：

E.coliDH5、E.coliDH5α、E.coliDH5αF’

1）

三者均有限制-修飾系統(tǒng)和重組基因缺陷，外源DNA可存活，且不發(fā)生重組2）

DH5α和DH5αF’都具有一個可供遺傳標(biāo)記lacZα檢測的遺傳背景3）

DH5αF’可供M13mp系列載體配套使用，M13病毒的感染需要F’的存在2.

實驗對象（1）供體：遺傳背景與DNA特點等，其中包括染833.

實驗性質(zhì)分子克隆的一般程序包括以下幾步：（1）分離供體DNA或RNA（mRNA）和載體DNA（2）構(gòu)建基因文庫或cDNA文庫（3）目的基因或cDNA克隆的篩選（4）目的基因或cDNA片段的鑒定：限制酶譜，次克隆，核苷酸序列分析，基因結(jié)構(gòu)分析等（5）基因表達(dá)與調(diào)控機理的研究3.實驗性質(zhì)分子克隆的一般程序包括以下幾步：84基因工程原理課件851)建立文庫用載體常在E.coli進(jìn)行i.目的基因與供體基因大小小—質(zhì)粒載體，操作方便，鑒定簡單大—λ或cos質(zhì)粒載體,甚至pYAC載體(為減少文庫規(guī)模，即使基因組小的也可用λ和cos載體）ii.篩選方法

ⅰ)互補法：可表達(dá),選一般載體;不表達(dá)，選表達(dá)載體(外源基因必須表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物必須具備活性)ⅱ)免疫法：與上同，但表達(dá)產(chǎn)物不一定具生物活性ⅲ)雜交法：各種載體均可2)目的基因的鑒定次克隆：選用質(zhì)粒載體，限制酶譜分析，基因結(jié)構(gòu)分析等定序：定序載體（M13mp系列），其他質(zhì)粒載體（如pUC系列，pBR322，T3，T7，SP6啟動子載體）3)基因表達(dá)與調(diào)控外源基因可表達(dá)—普通載體;不表達(dá)—表達(dá)型（分泌）載體

1)建立文庫用載體常在E.coli進(jìn)行864.

載體容量

M13mp載體<4kb細(xì)菌質(zhì)粒載體<10kbλ載體<23kbcos質(zhì)粒載體<48kbP1載體<95kbpYAC載體∽1000kb5.

合適的克隆位點單克隆位點和多克隆位點4.

載體容量87第六章基因工程原理第一節(jié)基因工程的概念及其主要內(nèi)容第二節(jié)基因工程中的工具酶第三節(jié)基因克隆的質(zhì)粒載體第四節(jié)目的基因的分離第五節(jié)基因與載體的重組與導(dǎo)入受體細(xì)胞第六節(jié)重組體的篩選第七節(jié)目的基因的表達(dá)第六章基因工程原理第一節(jié)基因工程的概念及其主要內(nèi)容88第一節(jié)基因工程的概念及其主要內(nèi)容一、基因工程的概念：利用DNA體外重組或PCR擴增技術(shù)從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反應(yīng)形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，以期獲得基因表達(dá)的過程.第一節(jié)基因工程的概念及其主要內(nèi)容一、基因工程的概念：89基因工程(geneengineering)常和以下名稱混用遺傳工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重組DNA技術(shù)(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名詞時指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系.作動詞時是指基因的分離與重組過程?；蚬こ?geneengineering)常和以下名稱混用90二、基因工程的主要內(nèi)容或（步驟）1、從復(fù)雜的生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段。2、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞(亦稱寄主細(xì)胞)，并與之一起增殖。4、從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。5、從這些篩選出來的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用。6、將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。二、基因工程的主要內(nèi)容或（步驟）1、從復(fù)雜的生物有機體基因組91三、基因工程技術(shù)及其應(yīng)用三、基因工程技術(shù)及其應(yīng)用92轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物93轉(zhuǎn)基因動物作為生物發(fā)生器轉(zhuǎn)基因動物作為生物發(fā)生器94基因本身也是一個產(chǎn)業(yè)Rockfeller大學(xué)將人肥胖基因出售0.2億美元（1995年3月）Amgen公司將FKBP神經(jīng)免疫因子配體轉(zhuǎn)讓達(dá)3.29億美元（1997年）Millennium公司以4.65億美元向Bayer公司轉(zhuǎn)讓225種基因的開發(fā)權(quán)（1998年9月）基因本身也是一個產(chǎn)業(yè)Rockfeller大學(xué)將人肥胖基因出95蛋白質(zhì)工程的概念

在基因工程技術(shù)對編碼蛋白質(zhì)的基因的了解基礎(chǔ)上，對蛋白質(zhì)的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，進(jìn)而通過對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、氨基酸序列和翻譯后的修飾等手段改變甚至創(chuàng)造出新的和更有效的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程的概念在基因工程技術(shù)對編碼蛋白質(zhì)的96蛋白質(zhì)工程主要內(nèi)容主要目標(biāo)蛋白質(zhì)氨基酸序列的分析蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)功能預(yù)測和分析蛋白質(zhì)組分析蛋白質(zhì)工程主要內(nèi)容主要目標(biāo)97酶工程的概念是酶學(xué)與工程學(xué)的相互滲透和結(jié)合所發(fā)展起來以酶為研究對象，改造并應(yīng)用酶的特異催化功能。目標(biāo)就是通過工程化技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化相應(yīng)原料成為有用物質(zhì)的技術(shù)。傳統(tǒng)的酶工程主要是指天然酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)與應(yīng)用。隨著科學(xué)的發(fā)展，尤其是基因工程技術(shù)的日趨完善，為酶工程賦予了新的內(nèi)容，特別是利用DNA操作技術(shù)，修飾改造酶分子的結(jié)構(gòu)或活性位點、酶與底物作用位點，重組酶的生產(chǎn)，模擬酶的人工設(shè)計與合成等成為新的內(nèi)容。酶工程的概念是酶學(xué)與工程學(xué)的相互滲透和結(jié)合所發(fā)展起來以酶為研98

酶工程的主要內(nèi)容酶的分離純化酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)及反應(yīng)器酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)酶分子化學(xué)修飾、遺傳突變及結(jié)構(gòu)改造酶抑制劑與激活劑開發(fā)與研究人工設(shè)計與合成模擬酶及酶分子酶工程的主要內(nèi)容酶的分離純化99發(fā)酵工程概念

發(fā)酵工程屬于生物技術(shù)的下游技術(shù)，是工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞、生產(chǎn)生物制品的一種技術(shù)。傳統(tǒng)的發(fā)酵工程主要用于微生物。現(xiàn)代生物技術(shù)還包括動物、植物細(xì)胞和工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵工程概念發(fā)酵工程屬于生物技100發(fā)酵工程技術(shù)發(fā)酵對象：傳統(tǒng)微生物發(fā)酵、基因工程菌發(fā)酵、動物細(xì)胞培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵類型：液體發(fā)酵、固體發(fā)酵、固定化培養(yǎng)、流式發(fā)酵發(fā)酵技術(shù)設(shè)備發(fā)酵工程技術(shù)發(fā)酵對象：101生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)藥：生物制藥；基因治療；人工器官農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)

轉(zhuǎn)基因植物：抗病蟲害新品種、抗逆新品種、高品質(zhì)新品種

轉(zhuǎn)基因動物：生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)和高品質(zhì)的畜產(chǎn)品

生物反應(yīng)器：利用動植物細(xì)胞或組織作為生物反應(yīng)器，直接生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)輕工與食品新型食品；營養(yǎng)食品；保健食品；輕工用酶

環(huán)境

污染治理；廢物利用；污染物生物降解生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)藥：生物制藥；基因治療；人工器官102生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)：利用細(xì)胞和生物分子進(jìn)行藥品、農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)開發(fā)和環(huán)境治理的產(chǎn)業(yè)，該產(chǎn)業(yè)技術(shù)由醫(yī)藥生物技術(shù)、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)共同組成醫(yī)藥生物技術(shù)重點攻克癌癥、艾滋病、老年癡呆癥、帕金森病、心臟病、糖尿病等危害人類的頑疾農(nóng)業(yè)生物技術(shù)著眼于提高農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。環(huán)境生物技術(shù)重點用于清除危險廢棄物

生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)：利用細(xì)胞和生物分子進(jìn)行藥品、農(nóng)產(chǎn)103生物制藥產(chǎn)業(yè)化特點高技術(shù)：高層次人才，高新技術(shù)手段，多學(xué)科滲透高投入：在國外，一個生物藥品平均要投入1~3億美元，并隨著開發(fā)難度的增大,有逐步增高的趨勢長周期：國際上，一個新的生物藥品需要6~8年時間高風(fēng)險:一個新藥品的開發(fā)，經(jīng)過一系列的程序-研發(fā)、中試、動物實驗、I~III期臨床實驗，上市和嚴(yán)格的藥政監(jiān)督管理。每一步都可能失敗，而前功盡棄高回報:開發(fā)成功一個新的生物藥品,回報很高。如美國Amgen公司，首次開發(fā)上市的EPO、G-SCF到1997年的銷售額分別接近和達(dá)到20億美元生物制藥產(chǎn)業(yè)化特點高技術(shù)：高層次人才，高新技術(shù)手段，多學(xué)科滲104基因工程試劑的高回報堿性成纖維細(xì)胞生長因子231元/ug紅細(xì)胞生成素1072元/ug白細(xì)胞介素-2410元/ug巨細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子1960元/ug胰島素10.2元/mg基因工程試劑的高回報堿性成纖維細(xì)胞生長因子2105美國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展情況美國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展情況106

美國生物制藥產(chǎn)品種類及數(shù)量（PHRAM）疾病種類產(chǎn)品數(shù)量疾病種類產(chǎn)品數(shù)量感染性疾病39心臟病26神經(jīng)系統(tǒng)疾病28呼吸系統(tǒng)疾病22艾滋病及相關(guān)疾病19自主免疫系統(tǒng)疾病19皮膚病19移植13消化系統(tǒng)疾病11遺傳疾病11血液疾病9糖尿病及并發(fā)癥7不育癥5眼病3生長發(fā)育不良癥3骨質(zhì)疏松2妊娠預(yù)防2腫瘤疾病175

美國生物制藥產(chǎn)品種類及數(shù)量（PHRAM）疾病種類107基因治療人數(shù)情況基因治療人數(shù)情況108生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化—農(nóng)業(yè)領(lǐng)域已有35個科120多種植物獲得轉(zhuǎn)基因植物，一些重要的農(nóng)作物獲得商品化的轉(zhuǎn)基因品種。種植面積迅猛發(fā)展。采用的基因正在從抗除草劑、抗菌素、抗病蟲害基因到抗逆境、高品質(zhì)方向發(fā)展。由單個質(zhì)量性狀基因向多基因數(shù)量性狀轉(zhuǎn)變。植物反應(yīng)器生產(chǎn)稀有蛋白。生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化—農(nóng)業(yè)領(lǐng)域109世界轉(zhuǎn)基因作物大田釋放情況

(1987.1-1998.4)轉(zhuǎn)基因作物特性批準(zhǔn)項數(shù)所占比例抗除草劑129729.6%抗蟲104623.8%提高產(chǎn)品質(zhì)量88620.2%抗病毒4369.9%改善農(nóng)學(xué)性狀2114.8%抗真菌病2084.7%其他3036.9%總計4387100%世界轉(zhuǎn)基因作物大田釋放情況

(1987.1-1998.4)轉(zhuǎn)110轉(zhuǎn)基因作物種植面積轉(zhuǎn)基因作物種植面積111生物技術(shù)與傳統(tǒng)中藥中藥現(xiàn)代化——核心是建立與現(xiàn)代基因?qū)W說相應(yīng)的現(xiàn)代中藥理論現(xiàn)代中藥理論的建立——確立中藥與基因表達(dá)的關(guān)系

中藥藥靶（基因）或作用位點基因的尋找

中藥化學(xué)組：中藥有效成分包括較單一的成分和多種成分

中藥臨床藥效的科學(xué)評價與分析方法生物技術(shù)的應(yīng)用

中藥基因組——利用現(xiàn)代生物技術(shù)研究分析中藥對人體（細(xì)胞）基因表達(dá)（蛋白質(zhì)）的影響。技術(shù)平臺：大規(guī)?；虮磉_(dá)分析（基因芯片、SAGE、蛋白質(zhì)組等技術(shù)）以及相關(guān)信息數(shù)據(jù)庫的建立

中藥化學(xué)組——利用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)分析有效成分及其藥物代謝、動力學(xué)。技術(shù)平臺：色譜及色譜-質(zhì)譜，色譜-波譜，波譜-波譜聯(lián)用等分析技術(shù)與層析、臨界萃取等分離技術(shù)

中藥新劑型生物技術(shù)與傳統(tǒng)中藥中藥現(xiàn)代化——核心是建立與現(xiàn)代基因?qū)W說相應(yīng)112第二節(jié)基因工程中的工具酶限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類--用于生物細(xì)胞的破壁，轉(zhuǎn)化，核酸純化，檢測等第二節(jié)基因工程中的工具酶限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的113一、限制性內(nèi)切酶（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名（三）、限制酶的特點（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）（五）、限制酶的用途一、限制性內(nèi)切酶（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類114（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類1.

I型：由三個基因構(gòu)成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色體上，三個基因構(gòu)成一個復(fù)合體，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），無特異切割位點。2.

II型：限制與修飾基因產(chǎn)物獨立起作用，在Ｅ.coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。3.

III型：修飾酶與Ｉ型酶相同，hsdＭ與hsdＳ基因產(chǎn)物結(jié)合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。

上述三個系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類1.

I型：由三個基因構(gòu)成，hsd115（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名

1.定義：廣義指上述三個系統(tǒng)中的限制酶；狹義指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。例如：HindⅢ前三個字母來自于菌種名稱H.

influenzae，“ｄ”表示菌系為ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個限制酶。EcoRI—Escherichiacoli

RI

HindⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenes

I(Ⅱ)（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名1.定義：廣義指上述116（三）、限制酶的特點

1.識別順序和酶切位點

１）識別４-8個相連的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；Sf