生物技術與疾病診斷課件

9.2-生物技術與疾病診斷

9.2-生物技術與疾病診斷1常見傳染病甲類傳染?。菏笠?、霍亂乙類傳染?。翰《拘愿窝?、細菌性和阿米巴性痢疾、傷寒、愛滋、淋病、梅毒、脊髓灰質(zhì)炎、白喉、百日咳、流行性腦脊髓膜炎、猩紅熱、腎綜合征出血熱、、鉤端螺旋體、布魯桿菌病、炭疽、流行性和地方性斑疹傷寒、流行性乙型腦炎、黑熱病、瘧疾、登革熱、肺結(jié)核、新生兒破傷風。丙類傳染病：血吸蟲病、絳蟲病、包蟲病、麻風病、流行性感冒、流行性腮腺炎、風疹、急性出血性結(jié)膜炎，除霍亂、痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。

常見傳染病甲類傳染?。菏笠?、霍亂2海地霍亂生物技術與疾病診斷課件3鼠疫（黑死?。┦笠撸ê谒啦。?

傳統(tǒng)的傳染病診斷技術:一是根據(jù)臨床癥狀判斷，但這必須要求被感染者發(fā)病，根據(jù)病狀進行判斷，況且有些疾病臨床表現(xiàn)非常相似，不具有典型性狀，容易造成誤診！

5

二是先對病原物質(zhì)進行分離培養(yǎng)，對培養(yǎng)物進行生理生化檢驗，從而確定病原體的種類。這種方法需要花費較多時間，成本高速度慢效率低，另外，有些病毒類和衣原體類的病原體至今仍沒有有效的體外培養(yǎng)方法，從而影響了診斷.二是先對病原物質(zhì)進行分離培養(yǎng)，對培養(yǎng)物進行生理生化檢6

現(xiàn)代生物技術的開發(fā)應用，為醫(yī)療衛(wèi)生領域提供了嶄新的診斷和監(jiān)測技術。人們對疾病，特別是傳染病的診斷，一個很重要的問題就是如何盡早檢測感染因子的種類，因為它對疾病的針對性治療及其預后有著極其重要的意義。DNA探針技術現(xiàn)代生物技術的開發(fā)應用，為醫(yī)療衛(wèi)生領域提供了嶄新的診7一.ELISA技術與單克隆抗體

1.

ELISA技術

ELISA技術稱為酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzymelinked

immunosorbentassay)技術。

其原理是將酶與抗體(原)交聯(lián)形成酶-抗體(原)復合物。利用抗原與抗體的特異結(jié)合以及酶將無色底物催化成有色底物，并根據(jù)在一定范圍內(nèi)酶量與顏色呈正相關的關系進行檢測。根據(jù)底物顏色的有無以及顏色的深淺可以判斷陰性或陽性反應以及反應強度，可以用于定性或定量分析。一.ELISA技術與單克隆抗體1.ELISA技術82.常用的ELISA診斷技術測定抗體間的間接ELISA病原體或其他外源大分子物質(zhì)進入機體后都可能刺激機體產(chǎn)生相應的抗體，所以可以通過檢測某種病原體的相應抗體來判斷是否曾經(jīng)某種病原體所感染，達到診斷的目的。測定抗原的雙抗體夾心ELISA

病原體及其大分子物質(zhì)進入機體后都可能成為一種抗原。所以檢測機體內(nèi)的抗原同樣可以判斷機體是否感染了相應的抗原。

2.常用的ELISA診斷技術測定抗體間的間接ELISA9生物技術與疾病診斷課件10夾心法夾心法113.基因工程抗原

傳統(tǒng)抗原制備：

1.體外培養(yǎng)病原體。再將病原體收集，經(jīng)一系列處理后制成。

2.對于不能進行體外培養(yǎng)的病原體，只能從受感染的動物或患者的組織中分離收集病原體，再經(jīng)一系列處理后制成。

3.基因工程抗原傳統(tǒng)抗原制備：12缺點：首先，抗原生產(chǎn)過程本身就有很大的危險。因為制造抗原時，要大量培養(yǎng)病原體，如果這些病原體逸出，將會造成很大危害；其次，產(chǎn)品的質(zhì)量難以控制，難以標準化，從而導致各批次產(chǎn)品質(zhì)量的差異；最后，生產(chǎn)費用高，特別是那些體外不能培養(yǎng)的病原體更是如此。

缺點：13利用基因工程技術可以克服ELISA技術中需要制備抗體和抗原過程中的不足。

同疫苗生產(chǎn)一樣，將抗原基因克隆在細菌或真核細胞表達系統(tǒng)中，由這些表達系統(tǒng)可以生產(chǎn)大量抗原。而且生產(chǎn)過程不必接觸病原體，也便于標準化生產(chǎn)，成本低廉。利用基因工程技術可以克服ELISA技術中需14多克隆抗體與單克隆抗體ELISA技術除了要制備抗原檢測抗體外，有時還必須制備抗體，用于檢測抗原。

抗體的制備可以將制備的抗原直接免疫動物，在被免疫的動物的血清中將會含有相應的抗體，通過一系列的純化技術就可獲得相應的抗體。但由于一個抗原往往會有多個抗體的混合物，這種混合物稱之為多克隆抗體。

多克隆抗體與單克隆抗體ELISA技術除了要制備抗15利用多克隆抗體進行疾病的診斷，至少有幾方面的缺點：

①特異性較低②產(chǎn)品質(zhì)量難于控制③生產(chǎn)過程費時，步驟多且成本較高利用多克隆抗體進行疾病的診斷，至少有幾方面的缺點：16單克隆抗體是利用細胞融合技術，在體外大量培養(yǎng)融合細胞，由融合細胞產(chǎn)生大量的抗體。由于單克隆抗體只識別某一特定的抗原決定簇，所以它旅游特異性強、成分均一、靈敏度高、產(chǎn)量大和容易標準化生產(chǎn)等優(yōu)點。因此，明顯優(yōu)于多克隆抗體。

單克隆抗體是利用細胞融合技術，在體外大量培養(yǎng)融合細胞，由17單克隆抗體主要過程：1）免疫脾細胞的制備2）骨髓瘤細胞的培養(yǎng)與篩選3）細胞融合4）陽性克隆的篩選5）克隆化6）細胞的凍存與復蘇7）大規(guī)模單克隆抗體的制備單克隆抗體主要過程：18

單克隆抗體雖然主要用于病原體感染的體外診斷，但其應用遠不僅于此，其應用范圍相當廣泛，包括：

1)鑒定微生物原體。2)確定激素水平。3)檢測腫瘤相關蛋白質(zhì)。

4)檢驗血液中的藥物

5)腫瘤檢測

6)其他領域的應用。

單克隆抗體雖然主要用于病原體感染的體外診斷，但其應用遠19二.DNA診斷技術1978年，Kan和Dozy首先應用羊水細胞DNA限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）做鐮狀細胞貧血癥的產(chǎn)前診斷，從而開創(chuàng)了DNA診斷的新技術。主要包括：DNA探針雜交技術PCR技術PCR-RFLP技術PCR-ASO技術PCR-ELISA技術PCR-SSCP技術PCR-DGGE技術LCR技術RFLP-探針技術生物芯片技術二.DNA診斷技術1978年，Kan和Dozy首先應20DNA探針雜交技術技術根據(jù)：來源不同的DNA加熱變性后，只要兩條多核苷酸鏈的堿基有一定數(shù)量能彼此互補，就可以經(jīng)退火處理形成新的雜交體雙螺旋結(jié)構(gòu)。這種根據(jù)堿基互補配對原理而使兩條不同來源的、有部分互補序列的兩條單鏈相互結(jié)合形成異源雙鏈的技術稱為核酸雜交。核酸雜交不僅限于DNA和DNA之間，在RNA與DNA之間、RNA與RNA之間都可通過雜交形成雙鏈.

DNA探針雜交技術技術根據(jù)：21基因探針：將已知序列的特定基因用同位素、熒光素或酶進行標記，制備成一種診斷試劑。由于基因探針在適當條件下可與同源序列互補形成雜交體，因此，使基因探針與待檢組織細胞內(nèi)的基因片段發(fā)生雜交反應，通過探針上的標記觀察探針是否與標本DNA結(jié)合，從而可判斷標本DNA中是否有與探針一致的片段，最終對標本是否有遺傳疾病或是否被某種微生物感染做出診斷。

基因探針：將已知序列的特定基因用同位素、熒光素或酶進行標22生物技術與疾病診斷課件23PCR技術

聚合酶鏈反應（PCR）技術是一項體外擴增特異DNA片段的技術。除了可以用于基因工程目的基因的制備外，還可用于某些疾病的診斷。

尋找傳染性因子的特異DNA序列，以這段DNA序列作為靶序列，設計特異引物，對待測樣品進行PCR擴增。如果檢測出了相應的擴增帶件事則判定為陽性反應。反之，無擴增帶，則為陰性反應。

PCR技術聚合酶鏈反應（PCR）技術是一項體外擴24生物技術與疾病診斷課件25PCR-RFLP技術

限制性片段多態(tài)性（RFLP）是指由于堿基的改變導致DNA上的某一限制性內(nèi)切核酸酶水解位點增加或減少。當這種DNA用限制酶水解時，產(chǎn)生的DNA片段數(shù)將相應的增加或減少，并且其DNA片段的分子質(zhì)量也發(fā)生相應的改變。許多遺傳疾病就是由于DNA上堿基的變化引起的。如果這種改變正好增加或減少了DNA限制性內(nèi)切核酸酶的水解位點，那么就可以用PCR技術先擴增包括之一突變位置在內(nèi)的DNA片段，獲得大量的DNA片段后通過RFLP方法進行分析。PCR-RFLP技術

限制性片段多態(tài)性（RFLP）是指26PCR-ASO技術目前發(fā)現(xiàn)的遺傳病中，許多疾病并不是基因的缺失或限制性內(nèi)切核酸酶水解位點有關聯(lián)的點突變。絕大部分只是一些單純的堿基突變，所以不能用上述的PCR技術或者PCR-RFLP技術進行診斷。但是每一種遺傳性疾病都有一些經(jīng)常發(fā)生突變的位點，稱為突變的熱點。利用這一特點可以進行PCR-ASO分析。ASO稱為等位基因寡核苷酸。PCR-ASO的檢測方法就是將待測的樣品先經(jīng)PCR擴增獲得大量的待分析的DNA片段，然后將這些片段分別點樣在固相支持膜上。另一方面，人工合成包括突變熱點在內(nèi)的17～30個核苷酸的正常的和突變的寡核苷酸，并分別進行放射性同位素標記稱為寡核苷酸探針。PCR-ASO技術目前發(fā)現(xiàn)的遺傳病中，27

利用這兩種探針分別于膜上的PCR產(chǎn)物進行雜交。突變了的基因只能與突變的寡核苷酸雜交，而正常的基因只能與正常的個核苷酸探針雜交，通過放射自顯影技術便可判斷雜交的結(jié)果，從而判斷基因的突變與否。樣品PCR擴增待分析DNA片段PCR固相支持膜正常寡核苷酸突變寡核苷酸同位素標記同位素標記放射自顯影檢測利用這兩種探針分別于膜上的PCR產(chǎn)物進行雜交。突變了的28PCR-ELISA技術

PCR-ELISA技術是指將PCR技術和ELISA技術結(jié)合起來的一種檢驗技術。在PCR的一對引物中，其中一條用生物素標記，另一條用地高辛標記，酶標微孔板上用生物素的親和素標記（生物素的親和素可以與生物素特異地結(jié)合）。PCR擴增后經(jīng)過純化去除引物dNTP和引物二聚體等小分子后，將PCR擴增后的純化片段加入到微孔板中。此時微孔板上包被的生物素親和素將與引物上的生物素結(jié)合而捕捉了PCR片段，再在微孔板中加入堿性磷酸酯酶或辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，該抗體將于另一引物上的地高辛結(jié)合從而形成生物素親和素-生物素-PCR片段-地高辛-抗地高辛抗體-酶的復合物。加入酶的相應底物后進行顯色，便可判斷PCR擴增的有無。PCR-ELISA技術

PCR-ELISA技術是指將PC29PCR-SSCP技術

該方法稱為聚合酶鏈反應-DNA單鏈構(gòu)型多態(tài)性。

原理是利用了正常的和突變的DNA單鏈在三維空間構(gòu)型上的差異，這種差異在電泳時將會有不同的電泳格局。

其方法是將正常和突變的DNA樣品經(jīng)PCR擴增得到正常和突變的DNA片段。將這兩種片段變性成為單鏈，兩樣品并行地進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。變性后的PCR產(chǎn)物的兩條單鏈DNA將按其核苷酸序列的特征形成三維結(jié)構(gòu)，并且突變樣品的三維結(jié)構(gòu)與正常樣品的三維結(jié)構(gòu)不同，從而形成不同的電泳格局。

PCR-SSCP技術該方法稱為聚合酶鏈反應-DNA單30PCR-DGGE技術該方法稱聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳技術,是將正常基因和突變基因分別進行PCR擴增，然后將擴增后的兩種PCR產(chǎn)物混合后變性再復性。PCR-DGGE技術該方法稱聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳技31LCR技術

LCR技術稱為連接酶鏈反應。該方法的原理是設計兩對引物1、2和1`、2`。其中1和1`互補，2和2`互補，1和2又與待測模板DNA的一條鏈互補，1`和2`與另一條鏈互補。LCR技術

LCR技術稱為連接酶鏈反應。32THANKS!THANKS!339.2-生物技術與疾病診斷

9.2-生物技術與疾病診斷34常見傳染病甲類傳染病：鼠疫、霍亂乙類傳染?。翰《拘愿窝?、細菌性和阿米巴性痢疾、傷寒、愛滋、淋病、梅毒、脊髓灰質(zhì)炎、白喉、百日咳、流行性腦脊髓膜炎、猩紅熱、腎綜合征出血熱、、鉤端螺旋體、布魯桿菌病、炭疽、流行性和地方性斑疹傷寒、流行性乙型腦炎、黑熱病、瘧疾、登革熱、肺結(jié)核、新生兒破傷風。丙類傳染病：血吸蟲病、絳蟲病、包蟲病、麻風病、流行性感冒、流行性腮腺炎、風疹、急性出血性結(jié)膜炎，除霍亂、痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。

常見傳染病甲類傳染?。菏笠摺⒒魜y35海地霍亂生物技術與疾病診斷課件36鼠疫（黑死?。┦笠撸ê谒啦。?7

傳統(tǒng)的傳染病診斷技術:一是根據(jù)臨床癥狀判斷，但這必須要求被感染者發(fā)病，根據(jù)病狀進行判斷，況且有些疾病臨床表現(xiàn)非常相似，不具有典型性狀，容易造成誤診！

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二是先對病原物質(zhì)進行分離培養(yǎng)，對培養(yǎng)物進行生理生化檢驗，從而確定病原體的種類。這種方法需要花費較多時間，成本高速度慢效率低，另外，有些病毒類和衣原體類的病原體至今仍沒有有效的體外培養(yǎng)方法，從而影響了診斷.二是先對病原物質(zhì)進行分離培養(yǎng)，對培養(yǎng)物進行生理生化檢39

現(xiàn)代生物技術的開發(fā)應用，為醫(yī)療衛(wèi)生領域提供了嶄新的診斷和監(jiān)測技術。人們對疾病，特別是傳染病的診斷，一個很重要的問題就是如何盡早檢測感染因子的種類，因為它對疾病的針對性治療及其預后有著極其重要的意義。DNA探針技術現(xiàn)代生物技術的開發(fā)應用，為醫(yī)療衛(wèi)生領域提供了嶄新的診40一.ELISA技術與單克隆抗體

1.

ELISA技術

ELISA技術稱為酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzymelinked

immunosorbentassay)技術。

其原理是將酶與抗體(原)交聯(lián)形成酶-抗體(原)復合物。利用抗原與抗體的特異結(jié)合以及酶將無色底物催化成有色底物，并根據(jù)在一定范圍內(nèi)酶量與顏色呈正相關的關系進行檢測。根據(jù)底物顏色的有無以及顏色的深淺可以判斷陰性或陽性反應以及反應強度，可以用于定性或定量分析。一.ELISA技術與單克隆抗體1.ELISA技術412.常用的ELISA診斷技術測定抗體間的間接ELISA病原體或其他外源大分子物質(zhì)進入機體后都可能刺激機體產(chǎn)生相應的抗體，所以可以通過檢測某種病原體的相應抗體來判斷是否曾經(jīng)某種病原體所感染，達到診斷的目的。測定抗原的雙抗體夾心ELISA

病原體及其大分子物質(zhì)進入機體后都可能成為一種抗原。所以檢測機體內(nèi)的抗原同樣可以判斷機體是否感染了相應的抗原。

2.常用的ELISA診斷技術測定抗體間的間接ELISA42生物技術與疾病診斷課件43夾心法夾心法443.基因工程抗原

傳統(tǒng)抗原制備：

1.體外培養(yǎng)病原體。再將病原體收集，經(jīng)一系列處理后制成。

2.對于不能進行體外培養(yǎng)的病原體，只能從受感染的動物或患者的組織中分離收集病原體，再經(jīng)一系列處理后制成。

3.基因工程抗原傳統(tǒng)抗原制備：45缺點：首先，抗原生產(chǎn)過程本身就有很大的危險。因為制造抗原時，要大量培養(yǎng)病原體，如果這些病原體逸出，將會造成很大危害；其次，產(chǎn)品的質(zhì)量難以控制，難以標準化，從而導致各批次產(chǎn)品質(zhì)量的差異；最后，生產(chǎn)費用高，特別是那些體外不能培養(yǎng)的病原體更是如此。

缺點：46利用基因工程技術可以克服ELISA技術中需要制備抗體和抗原過程中的不足。

同疫苗生產(chǎn)一樣，將抗原基因克隆在細菌或真核細胞表達系統(tǒng)中，由這些表達系統(tǒng)可以生產(chǎn)大量抗原。而且生產(chǎn)過程不必接觸病原體，也便于標準化生產(chǎn)，成本低廉。利用基因工程技術可以克服ELISA技術中需47多克隆抗體與單克隆抗體ELISA技術除了要制備抗原檢測抗體外，有時還必須制備抗體，用于檢測抗原。

抗體的制備可以將制備的抗原直接免疫動物，在被免疫的動物的血清中將會含有相應的抗體，通過一系列的純化技術就可獲得相應的抗體。但由于一個抗原往往會有多個抗體的混合物，這種混合物稱之為多克隆抗體。

多克隆抗體與單克隆抗體ELISA技術除了要制備抗48利用多克隆抗體進行疾病的診斷，至少有幾方面的缺點：

①特異性較低②產(chǎn)品質(zhì)量難于控制③生產(chǎn)過程費時，步驟多且成本較高利用多克隆抗體進行疾病的診斷，至少有幾方面的缺點：49單克隆抗體是利用細胞融合技術，在體外大量培養(yǎng)融合細胞，由融合細胞產(chǎn)生大量的抗體。由于單克隆抗體只識別某一特定的抗原決定簇，所以它旅游特異性強、成分均一、靈敏度高、產(chǎn)量大和容易標準化生產(chǎn)等優(yōu)點。因此，明顯優(yōu)于多克隆抗體。

單克隆抗體是利用細胞融合技術，在體外大量培養(yǎng)融合細胞，由50單克隆抗體主要過程：1）免疫脾細胞的制備2）骨髓瘤細胞的培養(yǎng)與篩選3）細胞融合4）陽性克隆的篩選5）克隆化6）細胞的凍存與復蘇7）大規(guī)模單克隆抗體的制備單克隆抗體主要過程：51

單克隆抗體雖然主要用于病原體感染的體外診斷，但其應用遠不僅于此，其應用范圍相當廣泛，包括：

1)鑒定微生物原體。2)確定激素水平。3)檢測腫瘤相關蛋白質(zhì)。

4)檢驗血液中的藥物

5)腫瘤檢測

6)其他領域的應用。

單克隆抗體雖然主要用于病原體感染的體外診斷，但其應用遠52二.DNA診斷技術1978年，Kan和Dozy首先應用羊水細胞DNA限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）做鐮狀細胞貧血癥的產(chǎn)前診斷，從而開創(chuàng)了DNA診斷的新技術。主要包括：DNA探針雜交技術PCR技術PCR-RFLP技術PCR-ASO技術PCR-ELISA技術PCR-SSCP技術PCR-DGGE技術LCR技術RFLP-探針技術生物芯片技術二.DNA診斷技術1978年，Kan和Dozy首先應53DNA探針雜交技術技術根據(jù)：來源不同的DNA加熱變性后，只要兩條多核苷酸鏈的堿基有一定數(shù)量能彼此互補，就可以經(jīng)退火處理形成新的雜交體雙螺旋結(jié)構(gòu)。這種根據(jù)堿基互補配對原理而使兩條不同來源的、有部分互補序列的兩條單鏈相互結(jié)合形成異源雙鏈的技術稱為核酸雜交。核酸雜交不僅限于DNA和DNA之間，在RNA與DNA之間、RNA與RNA之間都可通過雜交形成雙鏈.

DNA探針雜交技術技術根據(jù)：54基因探針：將已知序列的特定基因用同位素、熒光素或酶進行標記，制備成一種診斷試劑。由于基因探針在適當條件下可與同源序列互補形成雜交體，因此，使基因探針與待檢組織細胞內(nèi)的基因片段發(fā)生雜交反應，通過探針上的標記觀察探針是否與標本DNA結(jié)合，從而可判斷標本DNA中是否有與探針一致的片段，最終對標本是否有遺傳疾病或是否被某種微生物感染做出診斷。

基因探針：將已知序列的特定基因用同位素、熒光素或酶進行標55生物技術與疾病診斷課件56PCR技術

聚合酶鏈反應（PCR）技術是一項體外擴增特異DNA片段的技術。除了可以用于基因工程目的基因的制備外，還可用于某些疾病的診斷。

尋找傳染性因子的特異DNA序列，以這段DNA序列作為靶序列，設計特異引物，對待測樣品進行PCR擴增。如果檢測出了相應的擴增帶件事則判定為陽性反應。反之，無擴增帶，則為陰性反應。

PCR技術聚合酶鏈反應（PCR）技術是一項體外擴57生物技術與疾病診斷課件58PCR-RFLP技術

限制性片段多態(tài)性（RFLP）是指由于堿基的改變導致DNA上的某一限制性內(nèi)切核酸酶水解位點增加或減少。當這種DNA用限制酶水解時，產(chǎn)生的DNA片段數(shù)將相應的增加或減少，并且其DNA片段的分子質(zhì)量也發(fā)生相應的改變。許多遺傳疾病就是由于DNA上堿基的變化引起的。如果這種改變正好增加或減少了DNA限制性內(nèi)切核酸酶的水解位點，那么就可以用PCR技術先擴增包括之一突變位置在內(nèi)的DNA片段，獲得大量的DNA片段后通過RFLP方法進行分析。PCR-RFLP技術

限制性片段多態(tài)性（RFLP）是指59PCR-ASO技術目前發(fā)現(xiàn)的遺傳病中，許多疾病并不是基因的缺失或限制性內(nèi)切核酸酶水解位點有關聯(lián)的點突變。絕大部分只是一些單純的堿基突變，所以不能用上述的PCR技術或者PCR-RFLP技術進行診斷。但是每一種遺傳性疾病都有一些經(jīng)常發(fā)生突變的位點，稱為突變的熱點。利用這一特點可以進行PCR-ASO分析。ASO稱為等位基因寡核苷酸。PCR-ASO的檢測方法就是將待測的樣品先經(jīng)PCR擴增獲得大量的待分析的DNA片段，然后將這些片段分別點樣在固相支持膜上。另一方面，人工合成包括突變熱點在內(nèi)的17～30個核苷酸的正常的和突變的寡核苷酸，并分別進行放射性同位素標記稱為寡核苷酸探針。PCR-ASO技術目前發(fā)現(xiàn)的遺傳病中，60

利用這兩種探針分別于膜上的PCR產(chǎn)物進行雜交。突變了的基因只能與突變的寡核苷酸雜交，而正常的基因只能與正常的個核苷酸探針雜交，通過放射自顯