基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件

基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)1限制性核酸內(nèi)切酶ＤＮＡ連接酶DNA聚合酶限制性核酸內(nèi)切酶2限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）這類酶又簡(jiǎn)稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶。是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶3寄主控制的限制（restriction）與修飾(modification)現(xiàn)象：人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。寄主控制的限制（restriction）4基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件5R/M體系：寄主是由兩種酶活性配合完成的一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶R/M體系：6

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶7

R/M體系的作用：保護(hù)自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解R/M體系的作用：8限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。由于R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，9Ⅰ型酶：

1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分離出的核酸內(nèi)切酶。分子量較大，反應(yīng)需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類酶有特異的識(shí)別位點(diǎn)但沒有特異的切割位點(diǎn)，而且切割是隨機(jī)的，所以在基因工程中應(yīng)用不大。Ⅰ型酶：10Ⅱ型酶

1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分離出來的限制酶。分子量較小（105Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應(yīng)只需Mg++的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)上。許多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重組。

Ⅱ型酶11Ⅲ型酶

這類酶可識(shí)別特定堿基順序，并在這一順序的3’端24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點(diǎn)也是沒有特異性的。Ⅲ型酶12Ⅱ型酶的基本特性

1.在DNA雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。2.兩個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的3.因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片斷，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。Ⅱ型酶的基本特性13核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式

粘性末端：兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是圍繞著一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)中心，這樣形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片斷。具有3’-OH（Pst1），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。Pst1EcoR15’CTGCAG3’5’GAATTC3’3’GACGTC5’3’CTTAAG5’

核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式14平末端兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷。不易重新環(huán)化。

平末端15基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件16同裂酶（isoschizomers)

指來源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對(duì)同裂酶(CCGG)，當(dāng)靶序列中一個(gè)5-甲基胞嘧啶時(shí)HpaⅡ不能進(jìn)行切割，而MspⅠ可以。同裂酶（isoschizomers)17同尾酶（isocaudamer）

指來源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。雜種位點(diǎn)（hybridsite）：由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)。

一般不能被原來的任何一種同尾酶識(shí)別。

BamHⅠGGATCCBclⅠTGATC

ACCTAGGACTAGT

同尾酶（isocaudamer）18

雜種位點(diǎn)（hybridsite）由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)。一般不能被原來的任何一種同尾酶識(shí)別。

BamHⅠGGATCCBclⅠTGATC

ACCTAGGACTAGT雜種位點(diǎn)：GATC

C（BamHⅠ）

CTAGT（BclⅠ）

雜種位點(diǎn)（hybridsite）由一對(duì)同19

限制片斷的末端連接作用分子間的連接：不同的DNA片斷通過互補(bǔ)的粘性末端之間的堿基配對(duì)而彼此連接起來。分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個(gè)互補(bǔ)末端之間的堿基配對(duì)而形成的環(huán)形分子。限制片斷的末端連接作用20基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件21限制酶的特性a.限制酶識(shí)別靶序列同DNA的來源無關(guān)；b.限制酶識(shí)別靶序列是唯一的（對(duì)某種限制酶只具一個(gè)限制位點(diǎn)的質(zhì)粒）。限制酶的特性22限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：第一個(gè)字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個(gè)字母。第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個(gè)字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號(hào)。羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào)。例：EcoRI:來自于EscheriacoliRY13的第一個(gè)限制酶。限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：23影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：1.DNA的純度：

DNase的污染(Mg++)

a.增加核酸內(nèi)切限制酶的用量，

b.擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體系（稀釋），

c.延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。

加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當(dāng)?shù)臏囟?。影響核酸?nèi)切酶活性的因素：242.DNA的甲基化程度3.酶切消化反應(yīng)的溫度：大多數(shù)酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度37度。4.DNA的分子結(jié)構(gòu)：某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)?；虿《綝NA所需要的酶量要比消化線性的DNA高29倍。2.DNA的甲基化程度25

核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液1.氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀：

不正確的NaCl或Mg++濃度，會(huì)降低限制酶的活性，還可能導(dǎo)致識(shí)別序列的改變。

2.Tris-HCl：

維持最適的pH值（pH＝7.4）。

3.β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）：

維持酶的穩(wěn)定性。

4.牛血清蛋白（BSA）：維持酶的穩(wěn)定性。核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液26核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的消化作用1.核酸內(nèi)切限制酶以同型二聚體形式與靶序列發(fā)生作用。2.核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的局部消化完全的酶切消化：識(shí)別序列n個(gè)堿基的核酸內(nèi)切限制酶，對(duì)DNA的切割能達(dá)到每隔4n切割一次的水平。局部酶切消化：不讓核酸內(nèi)切限制酶對(duì)大量的DNA消化完全，就可以獲得平均分子量大小有所增加的限制片斷產(chǎn)物，進(jìn)行不完全的限制酶消化反應(yīng)。a.縮短酶切的消化反應(yīng)的保溫時(shí)間b.降低反應(yīng)的溫度（37--4）結(jié)束酶的活性。核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的消化作用273.核酸內(nèi)切限制酶對(duì)真核生物基因組的消化作用小分子量的片斷-----少（電泳-容易分離目的片斷）大分子量的片斷-----多（基因文庫）

3.核酸內(nèi)切限制酶對(duì)真核生物基因組的消化作用28ＤＮＡ連接酶（DNAligase）與分子的體外連接ＤＮＡ連接酶（DNAligase）與分子的體外連接29末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它是從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量的堿性蛋白質(zhì)，在二甲胂酸緩沖液中，能催化5’脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5’－3’方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3’-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ片段為引物，在3’-OH端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的單鏈DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的雙鏈DNA末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）30基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件31用途：1.催化[α-32P]-3’-脫氧核苷酸標(biāo)記DNA片斷的3’末端?？捎糜跍y(cè)序的終止，一位不含游離的3’-OH末端。2.催化非放射性的標(biāo)記物摻入到DNA片斷的3’-末端：生物素等，摻入后可產(chǎn)生熒光染料或抗生物素蛋白結(jié)合物的接受位點(diǎn)。3.用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。用途：32堿性磷酸酶：來自于大腸桿菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），該酶用于脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成為5’-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5’端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊釪NA片段自身連接（或環(huán)化）時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。堿性磷酸酶：33S1核酸酶：來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末端水解成平末端及cDNA發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的處理。反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）這類酶來自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。S1核酸酶：34體外連接的三種方式：

1.用ＤＮＡ連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片斷

2.用Ｔ４ＤＮＡ連接酶將平末端的DNA片斷連接；或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片斷加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ連接酶連接。3.先在DNA片斷末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ連接酶連接

體外連接的三種方式：35ＤＮＡ連接酶：能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團(tuán)（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。

只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。ＤＮＡ連接酶：36基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件37基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件38酶－－AMP（腺苷－磷酸）磷酸酰胺鍵DNA的腺苷酸復(fù)合物3’-OH對(duì)P原子作親核攻擊形成磷酸二酯鍵連接酶的作用機(jī)理此反應(yīng)是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發(fā)的需要花費(fèi)兩個(gè)高能磷酸鍵（賴氨酸殘基）酶－－AMP（腺苷－磷酸）D39

連接酶的來源1.DNA連接酶：大腸桿菌染色體編碼的2.T4DNA連接酶：大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的

DNA連接酶－－NAD+T4DNA連接酶－－ATP連接酶的來源40Ｔ４ＤＮＡ連接酶（DNAligase）該酶常從Ｔ４噬菌體的受感細(xì)胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個(gè)片段以共價(jià)鍵的形式結(jié)合起來。DNA連接酶對(duì)具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對(duì)平末端的DNA分子也可以進(jìn)行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。Ｔ４ＤＮＡ連接酶（DNAligase）41基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件42

影響連接酶作用的因素1.反應(yīng)溫度：連接缺口的溫度：37度

連接粘性末端的最佳溫度：4～15度2.Ｔ４ＤＮＡ連接酶的用量：

平末端DNA分子的連接反應(yīng)中，最適1～2個(gè)單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個(gè)單位。ATP的用量10μmol~1mmol/L之間

3.提高外源片斷與載體的濃度的比值，（10～20倍）影響連接酶作用的因素43

粘性末端DAN片斷的連接

由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連。對(duì)載體的5’末端進(jìn)行處理，用細(xì)菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團(tuán)，使載體不能自連。而外源片斷的5’-P能與載體的3’-OH進(jìn)行共價(jià)鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去5’-P的鏈不能進(jìn)行連接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

粘性末端DAN片斷的連接44基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件45

平末端DNA片斷的連接1.T4DNA連接酶

2.用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法平末端DNA片斷的連接46

同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A和B分別中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40個(gè)堿基同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A47

同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無法用原來的限制酶作特異性的切割，獲得插入片斷進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無48銜接物連接法

平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。

HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A銜接物連接法HpaII49

銜接物（linker）是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。雙銜接物：可以實(shí)現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時(shí)對(duì)克隆片斷的再刪除也比較方便。銜接物（linker）是指用化學(xué)方法合成的一段由10～1250銜接物連接法銜接物連接法51雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過DNA聚合酶合成第二鏈加入SalI銜接物SI核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由Klenow補(bǔ)齊，加入第二銜接物EcolI雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過DNA聚合酶合成52在用DNA銜接物連接法時(shí)，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點(diǎn)，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的基因切斷。在用DNA銜接物連接法時(shí)，如果待克隆DNA的53DNA接頭（adapter）連接法：1978年，美國康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系的教授吳瑞博士發(fā)明的。它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。粘性末端容易通過堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對(duì)DNA接頭分子末端，進(jìn)行必要的修飾。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。DNA接頭（adapter）連接法：54基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件55DNA接頭連接法DNA接頭連接法56

熱穩(wěn)定的連接

從嗜熱高溫方線菌的菌株中分離出來的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。寡核苷酸連接測(cè)定（oligonucletideligationassay,OLA）

用兩個(gè)寡核苷酸探針，同已知序列的靶DNA雜交，探針在靶DNA分子的位置是相鄰的。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（lingasechainreaction,LCR）；也叫連接擴(kuò)增反應(yīng)（lingaseamplicationreaction）

用寡核苷酸探針通過DNA連接酶的作用擴(kuò)增已知序列的靶DNA的方法。需要4種引物，

熱穩(wěn)定的連接57寡核苷酸連接測(cè)定

AGTGACCTTCACTGGA

AGTGACCTAGT

T

ACCT

TCACTGGATCACTGGA

AGTGACCTACCT

AGTGACCTACCT

待擴(kuò)增的DNA片斷PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP陽性信號(hào)無信號(hào)酶抗生素蛋白由于堿基錯(cuò)配不能形成磷酸二酯鍵檢測(cè)單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性寡核苷酸連接測(cè)定待擴(kuò)增的DNA片斷PPBBDD地高辛配基生物58LCR：ligasechainreaction，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。樣品DNA、探針(4)94度變性LCR：ligasechainreaction，連接酶鏈59DNA聚合酶DNA聚合酶60

常用的DNA聚合酶：

大腸桿菌DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片斷酶、T4DNA聚合酶、

T7DNA聚合酶、

反轉(zhuǎn)錄酶等。常用的DNA聚合酶：61共同點(diǎn)：

把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。共同點(diǎn)：62

大腸桿菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ｉ（PolＩ）、DNA聚合酶（Pol）、DNA聚合酶（Pol）、

PolＩ和Pol的主要功能參與DNA的合成；Pol的功能同DNA的復(fù)制有關(guān)；PolＩ同DNA分子克隆的關(guān)系最為密切。大腸桿菌DNA聚合酶63大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ：

1957年，美國的生物學(xué)家A.Kornberg首次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為1091000dal。

DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成兩個(gè)片斷，一個(gè)具有全部的3’5’的外切酶活性和5’3’的聚合酶活性，另一個(gè)具有全部5’3’的外切酶活性。大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ：64

DNA聚合酶Ｉ的酶活性：

1.5’3’的聚合酶活性；2.5’3’的外切酶活性；3.3’5’的外切酶活性（較低）。DNA聚合酶Ｉ的酶活性：65

DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件：1、底物：四種脫氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；2、Mg＋＋離子；

3、帶有3’-OH游離基團(tuán)的引物鏈；4、DNA模板：?jiǎn)捂?，雙鏈（糖-磷酸主鍵上有一個(gè)或多個(gè)斷裂）。

66基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件67

DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性

1、5’3’的外切酶活性，所切割的DNA鏈必須是位于雙螺旋的區(qū)段上；2、切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距5’末端數(shù)個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的一個(gè)鍵上發(fā)生；3、DNA的合成可以增強(qiáng)5’3’的核酸外切酶活性；4、5’3’核酸外切酶的活性位點(diǎn)同聚合作用的活性位點(diǎn)以及3’5’的水解作用位點(diǎn)是分開的。DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性68

DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性

能催化DNA鏈發(fā)生水解作用，從DNA鏈3’-OH末端開始向5’的方向水解DNA，并釋放出單核苷酸分子。

對(duì)酶活的影響：

反應(yīng)物中缺乏dNTPs時(shí)，大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性，將會(huì)發(fā)揮作用。但對(duì)于底物是雙鏈的DNA，在具有dNTPs時(shí)，這種降解活性將會(huì)被5’3’的聚合酶活性所抑制。

DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性69

70

DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：

通過DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。

DNA缺口轉(zhuǎn)移（nicktranslation）在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。當(dāng)外切酶活性從缺口的5’一側(cè)移去一個(gè)5’核苷酸之后，聚合酶作用就會(huì)在缺口的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之間形成一個(gè)鍵，隨著5’一側(cè)的核苷酸不斷移去，3’一側(cè)的核苷酸又按序列增補(bǔ)，缺口便沿著DNA分子合成的方向移動(dòng)。

DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：71

DNA雜交探針的制備

典型的反應(yīng)體系是。在25μl總體積中含有1μg純化的特定DNA片斷，并加入適量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未標(biāo)記的dNTPs。

DnaseＩ：造成DNA分子的斷裂或缺口；

PolＩ

：進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移，使反應(yīng)混合物中的32p標(biāo)記的核苷酸取代原有的未標(biāo)記的核苷酸，最終從頭到尾都被標(biāo)記。DNA雜交探針的制備72

dNTP對(duì)PolＩ酶活性的影響

在低濃度dNTPs的條件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs濃度時(shí)，PolＩ則能夠更有效的合成DNA。低濃度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高濃度的dNTPs（20μmol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs參入DNA鏈（DnaseＩ數(shù)量）。

dNTP對(duì)PolＩ酶活性的影響73

Klenow片斷與DNA末端標(biāo)記

1、Klenow片斷：是由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來的分子量為761000dal的大片斷分子。仍具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性，失去了全酶的5’3’外切酶活性。

Klenow片斷與DNA末端標(biāo)記74Klenow片斷的主要用途：

1、修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3’隱蔽末端；2、標(biāo)記DNA片斷的末端；3、cDNA克隆的第二鏈cDNA的合成；4、DNA序列的測(cè)定。Klenow片斷的主要用途：75

DNA片斷末端標(biāo)記：

具有3’隱蔽末端的帶標(biāo)記得的DNA片斷5’GATCT…3’3’A…5’在反應(yīng)物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP,一道溫育后生成：5’GATCT…3’3’32pGA…5’或是同時(shí)加入α-32p-dATP＋dGTP5’GATCT…3’3’32pAGA…5’DNA片斷末端標(biāo)記：76

DNA片斷末端標(biāo)記可以作為用凝膠電泳法測(cè)定分子大小的標(biāo)記樣品。因?yàn)楸粯?biāo)記的DNA片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無關(guān)。所以在限制酶消化過程產(chǎn)生的大小DNA片斷都得到了同等程度的標(biāo)記。不能夠有效的標(biāo)記帶有5’突出末端的DNA分子。DNA片斷末端標(biāo)記可以作為用凝77

T4DNA聚合酶和取代合成法標(biāo)記DNA片斷

1、從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的DNA聚合酶。具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性。2、在沒有脫氧核苷三磷酸存在的情況下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的獨(dú)特功能。作用于雙鏈DNA片斷，并按3’5’的方向從3’-OH末端開始降解DNA。如果反應(yīng)物中存在一種dNTP時(shí)，它的水解作用進(jìn)行到暴露出同反應(yīng)物中唯一的dNTP互補(bǔ)的核苷酸時(shí)就會(huì)停止。3、在反應(yīng)過程中，通過T4DNA聚合作用，反應(yīng)物中的α-32p-dNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的DNA片斷上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。

T4DNA聚合酶和78

合成取代法優(yōu)于缺口轉(zhuǎn)移法：

1、不會(huì)出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而缺口轉(zhuǎn)移制備的探針會(huì)出現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)；2、應(yīng)用適宜的核酸內(nèi)切限制酶切割，便可很容易的變成特定序列的探針。合成取代法優(yōu)于缺口轉(zhuǎn)移法：79具EcoR1位點(diǎn)的DNA分子對(duì)DNA分子3‘端有控制的降解合成作用產(chǎn)生選擇性標(biāo)記T4DNA聚合酶的取代合成法標(biāo)記DNA斷末端及制備鏈的特異探針具EcoR1位點(diǎn)的DNA分子對(duì)DNA分子3‘端有控制的降解合80

反轉(zhuǎn)錄酶：具有反轉(zhuǎn)錄酶活性和RNaseH活性。主要作用是以mRNA為模板合成cDNA；用來對(duì)5’突出末端的DNA片斷作末端標(biāo)記。反轉(zhuǎn)錄酶：81基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件82基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件83

合成cDNA的主要步驟：

1、應(yīng)用poly(A)mRNA為模板，以12~18個(gè)堿基長(zhǎng)的oligo(dT)片斷作為引物，加入反轉(zhuǎn)錄酶，合成出cDNA第一鏈;2、用堿水解法除去mRNA模板，單鏈cDNA能自我折疊形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)，作第二鏈的引物，用反轉(zhuǎn)錄酶或Klenow聚合酶催化第二鏈cDNA的合成；3、用SＩ核酸內(nèi)切酶消化除去單鏈區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4、通過同聚物或合成的銜接物，使DNA分子克隆到適當(dāng)?shù)妮d體分子上。合成cDNA的主要步驟：84T7DNA聚合酶：

1978年，S.Tabor從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細(xì)胞中純化出來的一種核酸酶。

具有5’3’的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的3’5’核酸外切酶活性。T7DNA聚合酶：85

T7DNA聚合酶的用途：1、用于對(duì)大分子量模板的延伸合成；

（不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，聚合能力較強(qiáng)可延伸合成數(shù)千個(gè)核苷酸）

2、通過延伸或取代合成法標(biāo)記DNA3’末端3、將雙鏈DNA的5’或3’突出末端轉(zhuǎn)變成平末端的結(jié)構(gòu)。T7DNA聚合酶的用途：86

修飾的T7DNA聚合酶對(duì)天然的T7DNA聚合酶進(jìn)行修飾，使之完全失去3’5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。修飾的T7DNA聚合酶87

用途：1、作為一種DNA序列分析的工具酶：

加工性能高；無3’5’的外切酶活性；具有催化脫氧核糖類似物聚合的能力。

2、制備探針；可催化較低水平的dNTP（<0.1μmol/L）參入。

3、有效的填補(bǔ)和標(biāo)記具有5’突出末端的DNA片斷的3’-末端。

聚合作用高；失去了3’5’的外切酶活性用途：88基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)89限制性核酸內(nèi)切酶ＤＮＡ連接酶DNA聚合酶限制性核酸內(nèi)切酶90限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）這類酶又簡(jiǎn)稱為限制性內(nèi)切酶或限制酶。是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶91寄主控制的限制（restriction）與修飾(modification)現(xiàn)象：人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。寄主控制的限制（restriction）92基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件93R/M體系：寄主是由兩種酶活性配合完成的一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶R/M體系：94

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶95

R/M體系的作用：保護(hù)自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解R/M體系的作用：96限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。由于R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，97Ⅰ型酶：

1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分離出的核酸內(nèi)切酶。分子量較大，反應(yīng)需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類酶有特異的識(shí)別位點(diǎn)但沒有特異的切割位點(diǎn)，而且切割是隨機(jī)的，所以在基因工程中應(yīng)用不大。Ⅰ型酶：98Ⅱ型酶

1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分離出來的限制酶。分子量較?。?05Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應(yīng)只需Mg++的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)上。許多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重組。

Ⅱ型酶99Ⅲ型酶

這類酶可識(shí)別特定堿基順序，并在這一順序的3’端24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點(diǎn)也是沒有特異性的。Ⅲ型酶100Ⅱ型酶的基本特性

1.在DNA雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。2.兩個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的3.因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片斷，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。Ⅱ型酶的基本特性101核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式

粘性末端：兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是圍繞著一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)中心，這樣形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片斷。具有3’-OH（Pst1），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。Pst1EcoR15’CTGCAG3’5’GAATTC3’3’GACGTC5’3’CTTAAG5’

核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式102平末端兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷。不易重新環(huán)化。

平末端103基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件104同裂酶（isoschizomers)

指來源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對(duì)同裂酶(CCGG)，當(dāng)靶序列中一個(gè)5-甲基胞嘧啶時(shí)HpaⅡ不能進(jìn)行切割，而MspⅠ可以。同裂酶（isoschizomers)105同尾酶（isocaudamer）

指來源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。雜種位點(diǎn)（hybridsite）：由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)。

一般不能被原來的任何一種同尾酶識(shí)別。

BamHⅠGGATCCBclⅠTGATC

ACCTAGGACTAGT

同尾酶（isocaudamer）106

雜種位點(diǎn)（hybridsite）由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)。一般不能被原來的任何一種同尾酶識(shí)別。

BamHⅠGGATCCBclⅠTGATC

ACCTAGGACTAGT雜種位點(diǎn)：GATC

C（BamHⅠ）

CTAGT（BclⅠ）

雜種位點(diǎn)（hybridsite）由一對(duì)同107

限制片斷的末端連接作用分子間的連接：不同的DNA片斷通過互補(bǔ)的粘性末端之間的堿基配對(duì)而彼此連接起來。分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個(gè)互補(bǔ)末端之間的堿基配對(duì)而形成的環(huán)形分子。限制片斷的末端連接作用108基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件109限制酶的特性a.限制酶識(shí)別靶序列同DNA的來源無關(guān)；b.限制酶識(shí)別靶序列是唯一的（對(duì)某種限制酶只具一個(gè)限制位點(diǎn)的質(zhì)粒）。限制酶的特性110限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：第一個(gè)字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個(gè)字母。第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個(gè)字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號(hào)。羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào)。例：EcoRI:來自于EscheriacoliRY13的第一個(gè)限制酶。限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：111影響核酸內(nèi)切酶活性的因素：1.DNA的純度：

DNase的污染(Mg++)

a.增加核酸內(nèi)切限制酶的用量，

b.擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體系（稀釋），

c.延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。

加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當(dāng)?shù)臏囟?。影響核酸?nèi)切酶活性的因素：1122.DNA的甲基化程度3.酶切消化反應(yīng)的溫度：大多數(shù)酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度37度。4.DNA的分子結(jié)構(gòu)：某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)?；虿《綝NA所需要的酶量要比消化線性的DNA高29倍。2.DNA的甲基化程度113

核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液1.氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀：

不正確的NaCl或Mg++濃度，會(huì)降低限制酶的活性，還可能導(dǎo)致識(shí)別序列的改變。

2.Tris-HCl：

維持最適的pH值（pH＝7.4）。

3.β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）：

維持酶的穩(wěn)定性。

4.牛血清蛋白（BSA）：維持酶的穩(wěn)定性。核酸內(nèi)切限制酶標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液114核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的消化作用1.核酸內(nèi)切限制酶以同型二聚體形式與靶序列發(fā)生作用。2.核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的局部消化完全的酶切消化：識(shí)別序列n個(gè)堿基的核酸內(nèi)切限制酶，對(duì)DNA的切割能達(dá)到每隔4n切割一次的水平。局部酶切消化：不讓核酸內(nèi)切限制酶對(duì)大量的DNA消化完全，就可以獲得平均分子量大小有所增加的限制片斷產(chǎn)物，進(jìn)行不完全的限制酶消化反應(yīng)。a.縮短酶切的消化反應(yīng)的保溫時(shí)間b.降低反應(yīng)的溫度（37--4）結(jié)束酶的活性。核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA的消化作用1153.核酸內(nèi)切限制酶對(duì)真核生物基因組的消化作用小分子量的片斷-----少（電泳-容易分離目的片斷）大分子量的片斷-----多（基因文庫）

3.核酸內(nèi)切限制酶對(duì)真核生物基因組的消化作用116ＤＮＡ連接酶（DNAligase）與分子的體外連接ＤＮＡ連接酶（DNAligase）與分子的體外連接117末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它是從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量的堿性蛋白質(zhì)，在二甲胂酸緩沖液中，能催化5’脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5’－3’方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3’-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ片段為引物，在3’-OH端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的單鏈DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的雙鏈DNA末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）118基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件119用途：1.催化[α-32P]-3’-脫氧核苷酸標(biāo)記DNA片斷的3’末端?？捎糜跍y(cè)序的終止，一位不含游離的3’-OH末端。2.催化非放射性的標(biāo)記物摻入到DNA片斷的3’-末端：生物素等，摻入后可產(chǎn)生熒光染料或抗生物素蛋白結(jié)合物的接受位點(diǎn)。3.用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。用途：120堿性磷酸酶：來自于大腸桿菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），該酶用于脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成為5’-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5’端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊釪NA片段自身連接（或環(huán)化）時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。堿性磷酸酶：121S1核酸酶：來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末端水解成平末端及cDNA發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的處理。反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）這類酶來自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。S1核酸酶：122體外連接的三種方式：

1.用ＤＮＡ連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片斷

2.用Ｔ４ＤＮＡ連接酶將平末端的DNA片斷連接；或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片斷加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ連接酶連接。3.先在DNA片斷末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ連接酶連接

體外連接的三種方式：123ＤＮＡ連接酶：能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團(tuán)（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。

只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。ＤＮＡ連接酶：124基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件125基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件126酶－－AMP（腺苷－磷酸）磷酸酰胺鍵DNA的腺苷酸復(fù)合物3’-OH對(duì)P原子作親核攻擊形成磷酸二酯鍵連接酶的作用機(jī)理此反應(yīng)是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發(fā)的需要花費(fèi)兩個(gè)高能磷酸鍵（賴氨酸殘基）酶－－AMP（腺苷－磷酸）D127

連接酶的來源1.DNA連接酶：大腸桿菌染色體編碼的2.T4DNA連接酶：大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的

DNA連接酶－－NAD+T4DNA連接酶－－ATP連接酶的來源128Ｔ４ＤＮＡ連接酶（DNAligase）該酶常從Ｔ４噬菌體的受感細(xì)胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是Ｔ４連接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個(gè)片段以共價(jià)鍵的形式結(jié)合起來。DNA連接酶對(duì)具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對(duì)平末端的DNA分子也可以進(jìn)行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。Ｔ４ＤＮＡ連接酶（DNAligase）129基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件130

影響連接酶作用的因素1.反應(yīng)溫度：連接缺口的溫度：37度

連接粘性末端的最佳溫度：4～15度2.Ｔ４ＤＮＡ連接酶的用量：

平末端DNA分子的連接反應(yīng)中，最適1～2個(gè)單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個(gè)單位。ATP的用量10μmol~1mmol/L之間

3.提高外源片斷與載體的濃度的比值，（10～20倍）影響連接酶作用的因素131

粘性末端DAN片斷的連接

由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連。對(duì)載體的5’末端進(jìn)行處理，用細(xì)菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團(tuán)，使載體不能自連。而外源片斷的5’-P能與載體的3’-OH進(jìn)行共價(jià)鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去5’-P的鏈不能進(jìn)行連接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

粘性末端DAN片斷的連接132基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件133

平末端DNA片斷的連接1.T4DNA連接酶

2.用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法平末端DNA片斷的連接134

同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A和B分別中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40個(gè)堿基同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A135

同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無法用原來的限制酶作特異性的切割，獲得插入片斷進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無136銜接物連接法

平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。

HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A銜接物連接法HpaII137

銜接物（linker）是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。雙銜接物：可以實(shí)現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時(shí)對(duì)克隆片斷的再刪除也比較方便。銜接物（linker）是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12138銜接物連接法銜接物連接法139雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過DNA聚合酶合成第二鏈加入SalI銜接物SI核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由Klenow補(bǔ)齊，加入第二銜接物EcolI雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過DNA聚合酶合成140在用DNA銜接物連接法時(shí)，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點(diǎn)，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的基因切斷。在用DNA銜接物連接法時(shí)，如果待克隆DNA的141DNA接頭（adapter）連接法：1978年，美國康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系的教授吳瑞博士發(fā)明的。它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。粘性末端容易通過堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對(duì)DNA接頭分子末端，進(jìn)行必要的修飾。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。DNA接頭（adapter）連接法：142基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件143DNA接頭連接法DNA接頭連接法144

熱穩(wěn)定的連接

從嗜熱高溫方線菌的菌株中分離出來的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。寡核苷酸連接測(cè)定（oligonucletideligationassay,OLA）

用兩個(gè)寡核苷酸探針，同已知序列的靶DNA雜交，探針在靶DNA分子的位置是相鄰的。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（lingasechainreaction,LCR）；也叫連接擴(kuò)增反應(yīng)（lingaseamplicationreaction）

用寡核苷酸探針通過DNA連接酶的作用擴(kuò)增已知序列的靶DNA的方法。需要4種引物，

熱穩(wěn)定的連接145寡核苷酸連接測(cè)定

AGTGACCTTCACTGGA

AGTGACCTAGT

T

ACCT

TCACTGGATCACTGGA

AGTGACCTACCT

AGTGACCTACCT

待擴(kuò)增的DNA片斷PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP陽性信號(hào)無信號(hào)酶抗生素蛋白由于堿基錯(cuò)配不能形成磷酸二酯鍵檢測(cè)單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性寡核苷酸連接測(cè)定待擴(kuò)增的DNA片斷PPBBDD地高辛配基生物146LCR：ligasechainreaction，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。樣品DNA、探針(4)94度變性LCR：ligasechainreaction，連接酶鏈147DNA聚合酶DNA聚合酶148

常用的DNA聚合酶：

大腸桿菌DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片斷酶、T4DNA聚合酶、

T7DNA聚合酶、

反轉(zhuǎn)錄酶等。常用的DNA聚合酶：149共同點(diǎn)：

把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。共同點(diǎn)：150

大腸桿菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ｉ（PolＩ）、DNA聚合酶（Pol）、DNA聚合酶（Pol）、

PolＩ和Pol的主要功能參與DNA的合成；Pol的功能同DNA的復(fù)制有關(guān)；PolＩ同DNA分子克隆的關(guān)系最為密切。大腸桿菌DNA聚合酶151大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ：

1957年，美國的生物學(xué)家A.Kornberg首次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為1091000dal。

DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成兩個(gè)片斷，一個(gè)具有全部的3’5’的外切酶活性和5’3’的聚合酶活性，另一個(gè)具有全部5’3’的外切酶活性。大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ：152

DNA聚合酶Ｉ的酶活性：

1.5’3’的聚合酶活性；2.5’3’的外切酶活性；3.3’5’的外切酶活性（較低）。DNA聚合酶Ｉ的酶活性：153

DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件：1、底物：四種脫氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；2、Mg＋＋離子；

3、帶有3’-OH游離基團(tuán)的引物鏈；4、DNA模板：?jiǎn)捂?，雙鏈（糖-磷酸主鍵上有一個(gè)或多個(gè)斷裂）。

154基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件155

DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性

1、5’3’的外切酶活性，所切割的DNA鏈必須是位于雙螺旋的區(qū)段上；2、切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距5’末端數(shù)個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的一個(gè)鍵上發(fā)生；3、DNA的合成可以增強(qiáng)5’3’的核酸外切酶活性；4、5’3’核酸外切酶的活性位點(diǎn)同聚合作用的活性位點(diǎn)以及3’5’的水解作用位點(diǎn)是分開的。DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性156

DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性

能催化DNA鏈發(fā)生水解作用，從DNA鏈3’-OH末端開始向5’的方向水解DNA，并釋放出單核苷酸分子。

對(duì)酶活的影響：

反應(yīng)物中缺乏dNTPs時(shí)，大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性，將會(huì)發(fā)揮作用。但對(duì)于底物是雙鏈的DNA，在具有dNTPs時(shí)，這種降解活性將會(huì)被5’3’的聚合酶活性所抑制。

DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性157

158

DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：

通過DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。

DNA缺口轉(zhuǎn)移（nicktranslation）在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。當(dāng)外切酶活性從缺口的5’一側(cè)移去一個(gè)5’核苷酸之后，聚合酶作用就會(huì)在缺口的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之間形成一個(gè)鍵，隨著5’一側(cè)的核苷酸不斷移去，3’一側(cè)的核苷酸又按序列增補(bǔ)，缺口便沿著DNA分子合成的方向移動(dòng)。

DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：159

DNA雜交探針的制備

典型的反應(yīng)體系是。在25μl總體積中含有1μg純化的特定DNA片斷，并加入適量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未標(biāo)記的dNTPs。

DnaseＩ：造成DNA分子的斷裂或缺口；

PolＩ

：進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移，使反應(yīng)混合物中的32p標(biāo)記的核苷酸取代原有的未標(biāo)記的核苷酸，最終從頭到尾都被標(biāo)記。DNA雜交探針的制備160

dNTP對(duì)PolＩ酶活性的影響

在低濃度dNTPs的條件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs濃度時(shí)，PolＩ則能夠更有效的合成DNA。低濃度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高