基因診斷Genediagnosis課件

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第一節(jié)基因診斷重組DNA技術(shù)極大地豐富了我們對人類遺傳病分子病理學(xué)的知識，同時也提供了從DNA水平對遺傳病進(jìn)行基因診斷的手段?；蛟\斷：就是利用DNA重組技術(shù)從DNA水平檢測人類遺傳性疾病的基因缺陷，又稱DNA分析法。1第一節(jié)基因診斷2一、直接診斷

直接檢測致病基因本身的異常。通常使用基因本身或鄰近的DNA序列作為探針，或通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以檢測基因點(diǎn)突變、缺失、插入等異常及性質(zhì)。它主要適用于已知基因異常疾病的診斷。2一、直接診斷31、Gene缺失遺傳病的診斷1）α地貧的Gene診斷α基因不同程度的缺失引起不同類型的α地貧，α基因缺失1～4個。正常Gene組用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一個αGene時可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe31、Gene缺失遺傳病的診斷BamHIBamHIα2α14以αGene為探針，Southernblot方法檢測αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb4以αGene為探針，Southernblot方法檢測α52）DMD/BMD的缺失診斷（進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良或假肥大型）DMD是一種嚴(yán)重致死性疾?。╔R），臨床癥狀表現(xiàn)肌肉進(jìn)行性萎縮和乏力。BMD臨床癥狀與DMD相似，但癥狀較輕。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79個Exon，cDNA全長13974bp編碼3685Aa，分子量427kD。DMD/BMD70%左右為缺失型，基因很大，缺失可能發(fā)生在不同的部位。應(yīng)用多重PCR擴(kuò)增檢測，判斷缺失狀態(tài)。52）DMD/BMD的缺失診斷（進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良或假肥大型）6多重PCR擴(kuò)增后電泳檢測結(jié)果病例外顯子12345678Pm34350136476052bp5351136多重PCR擴(kuò)增后電泳檢測結(jié)果病例外顯子172、突變型遺傳病的基因診斷例如：鐮形細(xì)胞貧血的Gene診斷已知突變基因編碼β珠蛋白鏈的第6位密碼子

GAG——GTG

谷Aa——纈Aa72、突變型遺傳病的基因診斷例如：81）RFLP診斷

已知限制酶MstII

識別序列MstII1.15kb

CCTGAGG1.35kbx

probeCCTGTGG突變后不能識別，酶切位點(diǎn)消失，限制酶切片段長度發(fā)生變化。81）RFLP診斷

已知限制酶MstII9限制酶切片段電泳后，經(jīng)SouthernBlot檢測，結(jié)果：1.35kb1.15kb

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

正常鐮狀鐮狀貧血9限制酶切片段電泳后，經(jīng)SouthernBlot檢測，結(jié)果102）ASO探針診斷

已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡和苷酸探針，32P標(biāo)記，進(jìn)行SouthernBlot雜交/斑點(diǎn)雜交。

NormalβΑGeneProbe——與正常

βΑ雜交

MutationβSGeneProbe——與異常

βS雜交

102）ASO探針診斷已知突變Gene部位和性質(zhì)，11斑點(diǎn)雜交結(jié)果：

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

正常探針

突變探針11斑點(diǎn)雜交結(jié)果：

βΑ/βΑβΑ/βS12二、間接診斷

主要通過Gene和DNA多態(tài)的連鎖分析作出診斷。當(dāng)致病基因雖然已知，但其異常尚屬未知時，或疾病Gene本身尚屬未知時，可通過對受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，推斷受檢者是否獲得了帶有致病基因的染色體或DNA片段。連鎖分析是基于遺傳標(biāo)記與Gene連鎖，子代是否獲得遺傳標(biāo)記間接地判斷做出診斷。這些遺傳標(biāo)記是基因組中的DAN多態(tài)，如：RFLP，VNTR等。12二、間接診斷主要通過Gene和DNA131、Gene異常不明確的遺傳病的診斷例：成年型多囊腎病——APKD，AD，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明，但已證實(shí)APKDGene與α珠蛋白基因3`端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3`HVR）緊密連鎖，因此，可以通過RFLP連鎖分析進(jìn)行診斷。131、Gene異常不明確的遺傳病的診斷例：成年型多囊腎病—14

以3`HVR為probe與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的Gene組DNA雜交——SouthernBlot雜交

Gene組DNAprobe（3`HVR）PvuII酶切

DNA片段

雜交結(jié)果14以3`HVR為probe與PvuII酶切后的家系有關(guān)成15結(jié)果1212345

5．7kb3．4kb2．3kb

15結(jié)果116結(jié)果分析

患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,說明致病基因與3.4kb片段連鎖,并按孟德爾方式遺傳.II5不含3.4kb片段,產(chǎn)前診斷正常.16結(jié)果分析

17PCR—RFLP診斷

甲型血友病的基因診斷，已知甲型血友病XR，獲得家系成員基因組DNA。

PCR142bpBcLI

142bp99bp43bp

電泳結(jié)果分析？p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+17PCR—RFLP診斷p1p2142bp99bp43bpB18問:1/Ⅱ2、Ⅲ1診斷；2/Ⅲ1是男或是女發(fā)?。?/p>

142bp99bp12123ⅠⅡIII118問:1/Ⅱ2、Ⅲ1診斷；2/Ⅲ1是男或是女發(fā)?。?419結(jié)果分析1）先癥者II2具有99bp片段而發(fā)病，該片段來自母親。2）II2有142bp/99bp雜合子。142bp來自父親，為正常片段，99bp片段是來自母親而成為攜帶者。3）Ⅲ1為99bp片段如果是男性為患者（99bp片段來自母親）；女性為攜帶者（來自父母雙方）19結(jié)果分析1）先癥者II2具有99bp片段而發(fā)病，該片段來20基因診斷意義

現(xiàn)證病人的診斷：爭取有效、針對性治療。產(chǎn)前診斷：意義更為重要，預(yù)防遺傳病患兒的出生END20基因診斷意義

現(xiàn)證病人的診斷：爭取有效、針對性治療。EN21

第一節(jié)基因診斷重組DNA技術(shù)極大地豐富了我們對人類遺傳病分子病理學(xué)的知識，同時也提供了從DNA水平對遺傳病進(jìn)行基因診斷的手段?；蛟\斷：就是利用DNA重組技術(shù)從DNA水平檢測人類遺傳性疾病的基因缺陷，又稱DNA分析法。1第一節(jié)基因診斷22一、直接診斷

直接檢測致病基因本身的異常。通常使用基因本身或鄰近的DNA序列作為探針，或通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以檢測基因點(diǎn)突變、缺失、插入等異常及性質(zhì)。它主要適用于已知基因異常疾病的診斷。2一、直接診斷231、Gene缺失遺傳病的診斷1）α地貧的Gene診斷α基因不同程度的缺失引起不同類型的α地貧，α基因缺失1～4個。正常Gene組用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一個αGene時可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe31、Gene缺失遺傳病的診斷BamHIBamHIα2α124以αGene為探針，Southernblot方法檢測αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb4以αGene為探針，Southernblot方法檢測α252）DMD/BMD的缺失診斷（進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良或假肥大型）DMD是一種嚴(yán)重致死性疾?。╔R），臨床癥狀表現(xiàn)肌肉進(jìn)行性萎縮和乏力。BMD臨床癥狀與DMD相似，但癥狀較輕。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79個Exon，cDNA全長13974bp編碼3685Aa，分子量427kD。DMD/BMD70%左右為缺失型，基因很大，缺失可能發(fā)生在不同的部位。應(yīng)用多重PCR擴(kuò)增檢測，判斷缺失狀態(tài)。52）DMD/BMD的缺失診斷（進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良或假肥大型）26多重PCR擴(kuò)增后電泳檢測結(jié)果病例外顯子12345678Pm34350136476052bp5351136多重PCR擴(kuò)增后電泳檢測結(jié)果病例外顯子1272、突變型遺傳病的基因診斷例如：鐮形細(xì)胞貧血的Gene診斷已知突變基因編碼β珠蛋白鏈的第6位密碼子

GAG——GTG

谷Aa——纈Aa72、突變型遺傳病的基因診斷例如：281）RFLP診斷

已知限制酶MstII

識別序列MstII1.15kb

CCTGAGG1.35kbx

probeCCTGTGG突變后不能識別，酶切位點(diǎn)消失，限制酶切片段長度發(fā)生變化。81）RFLP診斷

已知限制酶MstII29限制酶切片段電泳后，經(jīng)SouthernBlot檢測，結(jié)果：1.35kb1.15kb

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

正常鐮狀鐮狀貧血9限制酶切片段電泳后，經(jīng)SouthernBlot檢測，結(jié)果302）ASO探針診斷

已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡和苷酸探針，32P標(biāo)記，進(jìn)行SouthernBlot雜交/斑點(diǎn)雜交。

NormalβΑGeneProbe——與正常

βΑ雜交

MutationβSGeneProbe——與異常

βS雜交

102）ASO探針診斷已知突變Gene部位和性質(zhì)，31斑點(diǎn)雜交結(jié)果：

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

正常探針

突變探針11斑點(diǎn)雜交結(jié)果：

βΑ/βΑβΑ/βS32二、間接診斷

主要通過Gene和DNA多態(tài)的連鎖分析作出診斷。當(dāng)致病基因雖然已知，但其異常尚屬未知時，或疾病Gene本身尚屬未知時，可通過對受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，推斷受檢者是否獲得了帶有致病基因的染色體或DNA片段。連鎖分析是基于遺傳標(biāo)記與Gene連鎖，子代是否獲得遺傳標(biāo)記間接地判斷做出診斷。這些遺傳標(biāo)記是基因組中的DAN多態(tài)，如：RFLP，VNTR等。12二、間接診斷主要通過Gene和DNA331、Gene異常不明確的遺傳病的診斷例：成年型多囊腎病——APKD，AD，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明，但已證實(shí)APKDGene與α珠蛋白基因3`端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3`HVR）緊密連鎖，因此，可以通過RFLP連鎖分析進(jìn)行診斷。131、Gene異常不明確的遺傳病的診斷例：成年型多囊腎病—34

以3`HVR為probe與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的Gene組DNA雜交——SouthernBlot雜交

Gene組DNAprobe（3`HVR）PvuII酶切

DNA片段

雜交結(jié)果14以3`HVR為probe與PvuII酶切后的家系有關(guān)成35結(jié)果1212345

5．7kb3．4kb2．3kb

15結(jié)果1