基因工程載體人工染色體載體課件

第三節(jié)其他載體2012.09第三節(jié)其他載體2012.091其他載體一、人工染色體二、植物基因工程載體三、動(dòng)物基因工程載體其他載體一、人工染色體2一、人工染色體一、人工染色體3人基因組十分龐大，約含4×109bp，建立和篩選人的基因組文庫(kù)，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）載體應(yīng)運(yùn)而生。YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(diǎn)(centromere)及復(fù)制起點(diǎn)等功能序列，可插入長(zhǎng)度達(dá)200-500kb的外源DNA，導(dǎo)入酵母細(xì)胞可以隨細(xì)胞分裂周期復(fù)制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計(jì)劃的重要人基因組十分龐大，約含4×109bp，建立和41、酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC)1、酵母人工染色體（yeastartificialchr5酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）◆酵母人工染色體是另一類酵母穿梭載體。具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因?！鬥AC可以接受100-1000kb的外源DNA片段，這一特點(diǎn)使YAC成為人類基因組計(jì)劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進(jìn)了發(fā)展人類人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。酵母人工染色體（yeastartificialchro6正常酵母人工染色體含有：*四膜蟲端粒（tel)*酵母自主復(fù)制序列（ARS)*酵母著絲點(diǎn)(CEN)*酵母的選擇標(biāo)記(TRP1、URA1)YAC載體正常酵母人工染色體含有：YAC載體7

thecapacitytoclonelargeexogenousDNAfragments(upto2Mb)hasmadeYACsavitaltoolinphysicalmapping

Thefunctionalelementsofayeastchromosome

thecapacitytoclonelargee8（1）著絲粒區(qū)（CEN）A

AGTCACGTG

TTGTTTCTGNTTTCCGAAAYAC的組成結(jié)構(gòu)酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列:78-86bpIIIIII由三個(gè)區(qū)組成（1）著絲粒區(qū)（CEN）AA9酵母端粒保守序列是(G4T2)n

重復(fù)序列。（3）復(fù)制起點(diǎn)（ORI）約100bp的自主復(fù)制序列（ARS）。（2）端粒（TEL）（真核生物中只有酵母菌有ARS）兩個(gè)端粒序列Tel。酵母端粒保守序列是(G4T2)n重復(fù)序列。（3）復(fù)制起點(diǎn)（10位于SUP4

基因內(nèi)部。（4）克隆位點(diǎn)插入失活選擇：SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色；不失活的菌落是白色。14位于SUP4基因內(nèi)部。（4）克隆位點(diǎn)插入失活選擇：SUP11基因工程載體人工染色體載體課件12基因工程載體人工染色體載體課件132、細(xì)菌人工染色體（Bacterialartificialchromosome,BAC）2、細(xì)菌人工染色體（Bacterialartificial14細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC）

◆

BAC載體是基于細(xì)菌的性因子(F因子)質(zhì)粒的一些特點(diǎn)構(gòu)建的。F因子在細(xì)菌接合時(shí)轉(zhuǎn)移1Mb的細(xì)菌染色體片段。將F因子經(jīng)基因工程改良構(gòu)成的BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。◆帶有外源片段的BAC載體在細(xì)菌細(xì)胞中通常僅單個(gè)拷貝，這一特點(diǎn)有利于保持DNA大分子，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不發(fā)生重組。BAC載體本身分子量小，具有氯霉素抗性選擇基因及多克隆位點(diǎn)。細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialc15Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNA.CMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistance.oriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumber.cosNisthecossitefromlphage.HindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinserted.Thetwopromotersarefortranscribingtheinsertedfragment.TheNotIsitesareusedforcuttingouttheinsertedfragment.Structureofabacterialartif163、PAC載體3、PAC載體17二、植物載體二、植物載體18PlantcloningvectorsTi質(zhì)粒:侵染廣泛的雙子葉植物T-DNA或T-區(qū)(T-region)：約20kb，包含專化冠癭堿生化合成和冠癭瘤生長(zhǎng)的基因，隨機(jī)地整合到植物染色體上。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：兩端具有25個(gè)堿基對(duì)的順向重復(fù)序列，但重復(fù)不是完全的。25個(gè)堿基對(duì)的序列稱為T-DNA的邊界序列(T-DNAbordersequence)。去除右邊界序列，將使T-DNA失去轉(zhuǎn)移和整合的功能；左邊界的缺失，對(duì)致瘤性無(wú)明顯影響。毒性區(qū)域即vir(virulence)區(qū)域:引起T-DNA轉(zhuǎn)移的區(qū)域。長(zhǎng)度約35kb，和T-DNA處于不同位置PlantcloningvectorsTi質(zhì)粒:侵染廣泛19植物Ti質(zhì)粒載體植物Ti質(zhì)粒載體20基因工程載體人工染色體載體課件21基因工程載體人工染色體載體課件22（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）

T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上導(dǎo)入植物細(xì)胞的一段DNA。

T-DNA兩端各有一段25bp的重復(fù)序列(LB,RB)。T-DNA攜帶的致瘤基因是一些與激素合成有關(guān)的基因，由于激素合成基因使細(xì)胞處于不停的分裂狀態(tài)，形成冠癭瘤，不能進(jìn)行細(xì)胞分化。Ti質(zhì)粒改造后才能應(yīng)用于植物的基因工程。保留T-DNA兩端的末端序列，然后用外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不具有成瘤能力。（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregi23T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將細(xì)菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到這個(gè)區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組。Vir區(qū)的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制T-DNA轉(zhuǎn)移。T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失24（2）Vir區(qū)（virolenceregion）Vir區(qū)段上的基因與T-DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的遺傳過(guò)程有關(guān)，區(qū)段上的基因能夠使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。Vir區(qū)段總長(zhǎng)度大約35kb，由7個(gè)互補(bǔ)群組成，分別命名為VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。（3）Con區(qū)(regionsencodingconjugations)

該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。

（4）Ori區(qū)(originofreplication)

該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。（2）Vir區(qū)（virolenceregion）25Ti質(zhì)粒分子受到信號(hào)分子的激活作用之后，virD基因編碼的一種核酸內(nèi)切酶，先在T-DNA的RB序列中的第3和第4堿基之間切開一個(gè)單鏈缺口，隨后在T-DNA同一條鏈的LB序列中切出第二個(gè)單鏈缺口。T-DNA便以單鏈形式釋放出來(lái)，并在RB序列的引導(dǎo)下定向地轉(zhuǎn)移到寄主植物細(xì)胞。在有關(guān)的植物細(xì)胞酶體系的催化作用下，合成互補(bǔ)鏈形成雙鏈形式的T-DNA分子。在一系列酶的參與下整合進(jìn)植物基因組。這種整合是一種非正常重組。T-DNA轉(zhuǎn)移的機(jī)制Ti質(zhì)粒分子受到信號(hào)分子的激活作用之后，virD基因編碼的一262、Ti質(zhì)粒載體DisarmedTivectors（非致瘤載體）Cointegratevectors（共整合載體）Binaryvectors（雙元載體）2、Ti質(zhì)粒載體271）DisarmedTivectors去除T-DNA中的腫瘤基因在T-DNA中插入用于轉(zhuǎn)化植株篩選的遺傳標(biāo)記基因1）DisarmedTivectors去除T-DNA中28IntermediatevectorsAsmallportionofT-DNAwassubclonedinaconventionalE.coliplasmidvector(i.e.pBR322)foreasymanipulation,producingintermediatevectorsIntermediatevectorsareincapableofreplicationinA.tumefaciensandalsolackconjugationfunctions.Transferofthemwasachievedusingatriparentalmating.IntermediatevectorsAsmallpo29TriparentalmatingAnE.colistrainAcarryingahelperplasmidabletomobilizetheintermediatevectorintransTheE.colistrainBcarryingtherecombinantintermediatevectorA.tumefacienscarryingthedisarmedTiplasmidTriparentalmatingAnE.colist30基因工程載體人工染色體載體課件313.BinaryvectorT-DNAdoesnotneedtobephysicallyattachedtotherestoftheTiplasmidUseseparateplasmidstosupplythedisarmedT-DNAandthevirulencefunctions3.BinaryvectorT-DNAdoesnot32ThesmallplasmidcanbeusedtoinsertedforeigngeneWhenthetwoplasmidspresenttogetherinthesameA.tumefacienscell,theT-DNAcarriedbypBI121istransferredtotheplantchromosomalDNAbyproteinscodedbygenescarriedbypAL4404Thesmallplasmidcanbeuse33Ti質(zhì)粒及其衍生載體Ti質(zhì)粒是約200-500kb的環(huán)狀DNA分子，很難直接使用，故需對(duì)其加以改造，構(gòu)建出Ti質(zhì)粒的衍生載體系統(tǒng)，廣泛用作植物基因工程中的載體：（1）雙元載體(binaryvectors）如pBin19載體，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作為細(xì)菌選擇標(biāo)記，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作為植物的選擇標(biāo)記，pUC19的多克隆位點(diǎn)及α-互補(bǔ)顯色標(biāo)記（2）共整合載體(integratedvectors)Ti質(zhì)粒及其衍生載體Ti質(zhì)粒是約200-500kb的環(huán)狀DN34（1）雙元載體系統(tǒng)（binaryvector）具有兩個(gè)質(zhì)?！┧筚|(zhì)粒和Ti質(zhì)粒。（2）共整合載體（integratedvector）共整合載體系統(tǒng)包括在T-DNA上的激素合成區(qū)經(jīng)過(guò)突變后的Ti質(zhì)粒和中間載體兩部分。Ti質(zhì)粒的衍生載體（1）雙元載體系統(tǒng)（binaryvector）Ti質(zhì)粒的衍35發(fā)根農(nóng)桿菌存在另一種質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒也可完成外源基因向植物的轉(zhuǎn)移工作。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植物細(xì)胞產(chǎn)生許多不定根，這種不定根生長(zhǎng)迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根，也稱為發(fā)狀根，分別簡(jiǎn)稱為毛根或發(fā)根，Ri質(zhì)粒為根誘導(dǎo)質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)很相似，可以分為T區(qū)、vir區(qū)、ori區(qū)和其它區(qū)域等幾個(gè)部分。Ri質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌存在另一種質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒36T區(qū)與Ti質(zhì)粒的T-DNA十分相似：①T區(qū)的左右邊界序列。左右邊界上含有25bp的重復(fù)序列。②TL-DNA區(qū)。該區(qū)中含有與毛狀根形成有關(guān)的rolA、B、C、D基因群。③TR-DNA區(qū)。該區(qū)中含有與農(nóng)桿堿合成有關(guān)的基因（ags）和生長(zhǎng)素合成有關(guān)的基因（tms1、

tms2）。ags基因在轉(zhuǎn)化的初期起著重要的作用，是不定根產(chǎn)生的關(guān)鍵Ri質(zhì)粒T區(qū)與Ti質(zhì)粒的T-DNA十分相似：Ri質(zhì)粒37基因工程載體人工染色體載體課件38基因工程載體人工染色體載體課件39CaMV克隆載體含1個(gè)約8kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子；用于十字花科和少數(shù)非十字花科的植物基因轉(zhuǎn)移；其感染對(duì)植物有害，不能直接做載體；CaMV的DNA在植物細(xì)胞中能高水平轉(zhuǎn)錄35SRNA，其啟動(dòng)子是一強(qiáng)啟動(dòng)子。構(gòu)建的含35S啟動(dòng)子的系列克隆載體可在植物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)基因。CaMV克隆載體含1個(gè)約8kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子；40基因工程載體人工染色體載體課件41三、動(dòng)物載體三、動(dòng)物載體42質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動(dòng)物的病毒可改造用作動(dòng)物細(xì)胞的載體。由于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時(shí)一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來(lái)序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。目前病毒載體常用者有改造來(lái)自猴腎病毒SV40（SimianVirus40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或試驗(yàn)其功能、或作基因治療等。

質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核D43猴病毒40（SV40）的基因組常用來(lái)作為克隆載體，把外源DNA轉(zhuǎn)入哺乳類細(xì)胞。猴病毒40是球形動(dòng)物病毒，直徑40nm，呈20面體，有一個(gè)共價(jià)閉環(huán)的雙鏈DNA基因組，全長(zhǎng)5244bp。它在猴腎中增殖。被SV40感染的細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)SV40的T抗原。早已證明完整的小鼠染色體β珠蛋白基因（包括所有的間插順序和兩側(cè)順序）整合在SV40中后，在被感染的猴腎細(xì)胞中都能正確地轉(zhuǎn)錄和翻譯。表明猴腎細(xì)胞的拼接系統(tǒng)能有效地處理小鼠β珠蛋白的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本。猴病毒40（SV40）的基因組常用來(lái)作為克隆載體，44Cloningvectorsofanimalcell動(dòng)物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物5243bp共價(jià)閉合環(huán)狀分子感染率高，幾乎100％寄主細(xì)胞能被感染能提供完整的真核基因轉(zhuǎn)錄所需的成分侵染性具有寄主特異性改建：野生型最多只能包裝其基因組長(zhǎng)度的1.05倍的DNA分子其他：痘苗病毒DNA作載體，表達(dá)乙肝表面抗原用家蠶的核多角體病毒表達(dá)人α-干擾素Cloningvectorsofanimalcell45SV40作為克隆載體有其局限性：①SV40基因組的晚期功能區(qū)的裂解性，不利于外源DNA的重組和表達(dá)；②早期功能區(qū)與病毒的致癌性有關(guān)，使用時(shí)有顧慮；③重組DNA片段的大小受體限制。SV40作為克隆載體有其局限性：46逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，它有三個(gè)基因：gag-編碼病毒的核心蛋白；pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env-編碼病毒的被膜糖蛋白。有的逆轉(zhuǎn)錄病毒還帶有癌基因（vonc），即有的逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用。近年來(lái)，已設(shè)計(jì)構(gòu)建成一些缺陷型病毒（defectivevirus）使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為有用的基因載體，成功地把抗藥性基因轉(zhuǎn)入了人體造血前體細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，它有三個(gè)基因：gag-編碼病毒47反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒是一類含RNA的病毒，進(jìn)入受體細(xì)胞后，RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA，通過(guò)兩端由數(shù)百bp組成的長(zhǎng)末端重復(fù)序列，整合到染色體上，成為原病毒。只要將外源目的基因組入原病毒DNA的合適克隆位點(diǎn)，就能在感染的動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒是一類含RNA的病毒，進(jìn)入受體細(xì)48Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，因此不能合成自身的外殼，但它有識(shí)別外殼蛋白進(jìn)行包裝的信號(hào)（一段尚未鑒定的DNA順序）。用這種缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒去感染某種細(xì)胞株，這種細(xì)胞株包含有輔助病毒（helpervirus）。輔助病毒能合成蛋白外殼，但缺失了識(shí)別蛋白外殼進(jìn)行包裝的信號(hào)，因此它不能包裝成病毒顆粒。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞株后，逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進(jìn)入輔助病毒的外殼蛋白，成為病毒顆粒。這時(shí)把受感染的細(xì)胞同骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)，包裝在輔助病毒外殼蛋白中的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA，進(jìn)入骨髓細(xì)胞，病毒DNA插入宿主細(xì)胞基因組，基因的活性得到表達(dá)。這時(shí)，由于骨髓細(xì)胞里面沒(méi)有輔助病毒，所以整合進(jìn)宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒，不再有外殼蛋白可供包裝，因此也就無(wú)法增殖，而只能被“陷”在宿主基因組中，通過(guò)細(xì)胞分裂而傳給下一代子細(xì)胞。Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，49分子克隆載體的選擇選擇克隆載體的幾個(gè)重要參數(shù)（1）實(shí)驗(yàn)對(duì)象（2）實(shí)驗(yàn)性質(zhì)（3）載體容量（4）合適克隆位點(diǎn)（5）載體的穩(wěn)定性（6）載體DNA制備的難易（7）外源基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點(diǎn)等分子克隆載體的選擇選擇克隆載體的幾個(gè)重要參數(shù)50實(shí)驗(yàn)對(duì)象（1）供體：遺傳背景與DNA特點(diǎn)等，其中包括染色體DNA大小，基因大小與結(jié)構(gòu)，堿基組成，目的基因的產(chǎn)物特點(diǎn)以及遺傳物質(zhì)的傳遞方式等。（2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質(zhì)的傳遞方式(包括人為的方法)，DNA限制修飾系統(tǒng)，DNA重組基因特點(diǎn)，基因產(chǎn)物修飾系統(tǒng)，即轉(zhuǎn)錄與翻譯后修飾系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)對(duì)象（1）供體：遺傳背景與DNA特點(diǎn)等，其中包括染色體D51實(shí)驗(yàn)對(duì)象如常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。如：

E.coliDH5、E.coliDH5α、E.coliDH5αF’

1）

三者均有限制-修飾系統(tǒng)和重組基因缺陷，外源DNA可存活，且不發(fā)生重組2）

DH5α和DH5αF’都具有一個(gè)可供遺傳標(biāo)記lacZα檢測(cè)的遺傳背景3）

DH5αF’可供M13mp系列載體配套使用，M13病毒的感染需要F’的存在實(shí)驗(yàn)對(duì)象如常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因521．當(dāng)一DNA片段插入終止子探針型載體pBU10的HindⅢ克隆位點(diǎn)后，重組質(zhì)粒仍可轉(zhuǎn)化E.coli(CmlsTcs)為CmlrTcr，為什么?可設(shè)計(jì)什么實(shí)驗(yàn)證明其假設(shè)?2．當(dāng)一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出現(xiàn)兩類菌落，蘭色菌落和白色菌落。從白色菌落中分離純化的質(zhì)粒經(jīng)電泳檢查，均比原載體DNA分子大；但從蘭色菌落隨機(jī)分離的質(zhì)粒DNA卻有兩類，其中一類與載體大小相同，另一類卻與白色菌落中分離的質(zhì)粒大小相同。如何解釋這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果?可設(shè)計(jì)何種實(shí)驗(yàn)證明你的解釋是正確的?3．當(dāng)把一外源DNA插入一克隆載體后，重組DNA分子轉(zhuǎn)化E.coli細(xì)胞所獲得的重組子分子可根據(jù)其限制酶圖譜分為兩類，即這兩類轉(zhuǎn)化子中所含的重組DNA分子的限制酶圖譜不一樣，從這兩類轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離到的重組DNA分子可用限制酶回收插入的片段。而從這兩類轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液所分離到的DNA卻1．當(dāng)一DNA片段插入終止子探針型載體pBU10的HindⅢ53不能用限制酶回收該片段。當(dāng)把同類轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液所分離到的DNA進(jìn)行復(fù)性分析時(shí)，DNA分子間不會(huì)發(fā)生復(fù)性，但把從不同類轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液分離到的DNA進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在電鏡下可觀察到十分類似于8字形的結(jié)構(gòu)。如何解釋上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果?可利用圖示法解釋。4.由于分子克隆載體的大小決定外源DNA插入片段的大小，兩者呈反比關(guān)系，因而在建立載體時(shí)千方百計(jì)地減小載體分子量。對(duì)于穿梭載體，因?yàn)閺?fù)制起點(diǎn)和標(biāo)記基因具有生物特異性，所以載體上需要同時(shí)具有兩個(gè)以上的復(fù)制起點(diǎn)和標(biāo)記基因。已知不同生物的某些基因啟動(dòng)子可以在E.coli細(xì)胞中啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，問(wèn)可以采取一些什么方法減小穿梭載體的分子量?不能用限制酶回收該片段。當(dāng)把同類轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液所分離到的DN54質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類和特征（重點(diǎn)）質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pU55載體容量M13mp載體<4kb細(xì)菌質(zhì)粒載體<10kbλ載體<23kbcos質(zhì)粒載體<48kbP1載體<95kbpYAC載體∽1000kb

載體容量M13mp載體<4kb56演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！57第三節(jié)其他載體2012.09第三節(jié)其他載體2012.0958其他載體一、人工染色體二、植物基因工程載體三、動(dòng)物基因工程載體其他載體一、人工染色體59一、人工染色體一、人工染色體60人基因組十分龐大，約含4×109bp，建立和篩選人的基因組文庫(kù)，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）載體應(yīng)運(yùn)而生。YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(diǎn)(centromere)及復(fù)制起點(diǎn)等功能序列，可插入長(zhǎng)度達(dá)200-500kb的外源DNA，導(dǎo)入酵母細(xì)胞可以隨細(xì)胞分裂周期復(fù)制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計(jì)劃的重要人基因組十分龐大，約含4×109bp，建立和611、酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC)1、酵母人工染色體（yeastartificialchr62酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）◆酵母人工染色體是另一類酵母穿梭載體。具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。◆YAC可以接受100-1000kb的外源DNA片段，這一特點(diǎn)使YAC成為人類基因組計(jì)劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進(jìn)了發(fā)展人類人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。酵母人工染色體（yeastartificialchro63正常酵母人工染色體含有：*四膜蟲端粒（tel)*酵母自主復(fù)制序列（ARS)*酵母著絲點(diǎn)(CEN)*酵母的選擇標(biāo)記(TRP1、URA1)YAC載體正常酵母人工染色體含有：YAC載體64

thecapacitytoclonelargeexogenousDNAfragments(upto2Mb)hasmadeYACsavitaltoolinphysicalmapping

Thefunctionalelementsofayeastchromosome

thecapacitytoclonelargee65（1）著絲粒區(qū)（CEN）A

AGTCACGTG

TTGTTTCTGNTTTCCGAAAYAC的組成結(jié)構(gòu)酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列:78-86bpIIIIII由三個(gè)區(qū)組成（1）著絲粒區(qū)（CEN）AA66酵母端粒保守序列是(G4T2)n

重復(fù)序列。（3）復(fù)制起點(diǎn)（ORI）約100bp的自主復(fù)制序列（ARS）。（2）端粒（TEL）（真核生物中只有酵母菌有ARS）兩個(gè)端粒序列Tel。酵母端粒保守序列是(G4T2)n重復(fù)序列。（3）復(fù)制起點(diǎn)（67位于SUP4

基因內(nèi)部。（4）克隆位點(diǎn)插入失活選擇：SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色；不失活的菌落是白色。14位于SUP4基因內(nèi)部。（4）克隆位點(diǎn)插入失活選擇：SUP68基因工程載體人工染色體載體課件69基因工程載體人工染色體載體課件702、細(xì)菌人工染色體（Bacterialartificialchromosome,BAC）2、細(xì)菌人工染色體（Bacterialartificial71細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC）

◆

BAC載體是基于細(xì)菌的性因子(F因子)質(zhì)粒的一些特點(diǎn)構(gòu)建的。F因子在細(xì)菌接合時(shí)轉(zhuǎn)移1Mb的細(xì)菌染色體片段。將F因子經(jīng)基因工程改良構(gòu)成的BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。◆帶有外源片段的BAC載體在細(xì)菌細(xì)胞中通常僅單個(gè)拷貝，這一特點(diǎn)有利于保持DNA大分子，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不發(fā)生重組。BAC載體本身分子量小，具有氯霉素抗性選擇基因及多克隆位點(diǎn)。細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialc72Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNA.CMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistance.oriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumber.cosNisthecossitefromlphage.HindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinserted.Thetwopromotersarefortranscribingtheinsertedfragment.TheNotIsitesareusedforcuttingouttheinsertedfragment.Structureofabacterialartif733、PAC載體3、PAC載體74二、植物載體二、植物載體75PlantcloningvectorsTi質(zhì)粒:侵染廣泛的雙子葉植物T-DNA或T-區(qū)(T-region)：約20kb，包含專化冠癭堿生化合成和冠癭瘤生長(zhǎng)的基因，隨機(jī)地整合到植物染色體上。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：兩端具有25個(gè)堿基對(duì)的順向重復(fù)序列，但重復(fù)不是完全的。25個(gè)堿基對(duì)的序列稱為T-DNA的邊界序列(T-DNAbordersequence)。去除右邊界序列，將使T-DNA失去轉(zhuǎn)移和整合的功能；左邊界的缺失，對(duì)致瘤性無(wú)明顯影響。毒性區(qū)域即vir(virulence)區(qū)域:引起T-DNA轉(zhuǎn)移的區(qū)域。長(zhǎng)度約35kb，和T-DNA處于不同位置PlantcloningvectorsTi質(zhì)粒:侵染廣泛76植物Ti質(zhì)粒載體植物Ti質(zhì)粒載體77基因工程載體人工染色體載體課件78基因工程載體人工染色體載體課件79（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）

T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上導(dǎo)入植物細(xì)胞的一段DNA。

T-DNA兩端各有一段25bp的重復(fù)序列(LB,RB)。T-DNA攜帶的致瘤基因是一些與激素合成有關(guān)的基因，由于激素合成基因使細(xì)胞處于不停的分裂狀態(tài)，形成冠癭瘤，不能進(jìn)行細(xì)胞分化。Ti質(zhì)粒改造后才能應(yīng)用于植物的基因工程。保留T-DNA兩端的末端序列，然后用外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不具有成瘤能力。（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregi80T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將細(xì)菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到這個(gè)區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組。Vir區(qū)的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制T-DNA轉(zhuǎn)移。T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失81（2）Vir區(qū)（virolenceregion）Vir區(qū)段上的基因與T-DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的遺傳過(guò)程有關(guān)，區(qū)段上的基因能夠使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。Vir區(qū)段總長(zhǎng)度大約35kb，由7個(gè)互補(bǔ)群組成，分別命名為VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。（3）Con區(qū)(regionsencodingconjugations)

該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。

（4）Ori區(qū)(originofreplication)

該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。（2）Vir區(qū)（virolenceregion）82Ti質(zhì)粒分子受到信號(hào)分子的激活作用之后，virD基因編碼的一種核酸內(nèi)切酶，先在T-DNA的RB序列中的第3和第4堿基之間切開一個(gè)單鏈缺口，隨后在T-DNA同一條鏈的LB序列中切出第二個(gè)單鏈缺口。T-DNA便以單鏈形式釋放出來(lái)，并在RB序列的引導(dǎo)下定向地轉(zhuǎn)移到寄主植物細(xì)胞。在有關(guān)的植物細(xì)胞酶體系的催化作用下，合成互補(bǔ)鏈形成雙鏈形式的T-DNA分子。在一系列酶的參與下整合進(jìn)植物基因組。這種整合是一種非正常重組。T-DNA轉(zhuǎn)移的機(jī)制Ti質(zhì)粒分子受到信號(hào)分子的激活作用之后，virD基因編碼的一832、Ti質(zhì)粒載體DisarmedTivectors（非致瘤載體）Cointegratevectors（共整合載體）Binaryvectors（雙元載體）2、Ti質(zhì)粒載體841）DisarmedTivectors去除T-DNA中的腫瘤基因在T-DNA中插入用于轉(zhuǎn)化植株篩選的遺傳標(biāo)記基因1）DisarmedTivectors去除T-DNA中85IntermediatevectorsAsmallportionofT-DNAwassubclonedinaconventionalE.coliplasmidvector(i.e.pBR322)foreasymanipulation,producingintermediatevectorsIntermediatevectorsareincapableofreplicationinA.tumefaciensandalsolackconjugationfunctions.Transferofthemwasachievedusingatriparentalmating.IntermediatevectorsAsmallpo86TriparentalmatingAnE.colistrainAcarryingahelperplasmidabletomobilizetheintermediatevectorintransTheE.colistrainBcarryingtherecombinantintermediatevectorA.tumefacienscarryingthedisarmedTiplasmidTriparentalmatingAnE.colist87基因工程載體人工染色體載體課件883.BinaryvectorT-DNAdoesnotneedtobephysicallyattachedtotherestoftheTiplasmidUseseparateplasmidstosupplythedisarmedT-DNAandthevirulencefunctions3.BinaryvectorT-DNAdoesnot89ThesmallplasmidcanbeusedtoinsertedforeigngeneWhenthetwoplasmidspresenttogetherinthesameA.tumefacienscell,theT-DNAcarriedbypBI121istransferredtotheplantchromosomalDNAbyproteinscodedbygenescarriedbypAL4404Thesmallplasmidcanbeuse90Ti質(zhì)粒及其衍生載體Ti質(zhì)粒是約200-500kb的環(huán)狀DNA分子，很難直接使用，故需對(duì)其加以改造，構(gòu)建出Ti質(zhì)粒的衍生載體系統(tǒng)，廣泛用作植物基因工程中的載體：（1）雙元載體(binaryvectors）如pBin19載體，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作為細(xì)菌選擇標(biāo)記，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作為植物的選擇標(biāo)記，pUC19的多克隆位點(diǎn)及α-互補(bǔ)顯色標(biāo)記（2）共整合載體(integratedvectors)Ti質(zhì)粒及其衍生載體Ti質(zhì)粒是約200-500kb的環(huán)狀DN91（1）雙元載體系統(tǒng)（binaryvector）具有兩個(gè)質(zhì)?！┧筚|(zhì)粒和Ti質(zhì)粒。（2）共整合載體（integratedvector）共整合載體系統(tǒng)包括在T-DNA上的激素合成區(qū)經(jīng)過(guò)突變后的Ti質(zhì)粒和中間載體兩部分。Ti質(zhì)粒的衍生載體（1）雙元載體系統(tǒng)（binaryvector）Ti質(zhì)粒的衍92發(fā)根農(nóng)桿菌存在另一種質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒也可完成外源基因向植物的轉(zhuǎn)移工作。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植物細(xì)胞產(chǎn)生許多不定根，這種不定根生長(zhǎng)迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根，也稱為發(fā)狀根，分別簡(jiǎn)稱為毛根或發(fā)根，Ri質(zhì)粒為根誘導(dǎo)質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)很相似，可以分為T區(qū)、vir區(qū)、ori區(qū)和其它區(qū)域等幾個(gè)部分。Ri質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌存在另一種質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒93T區(qū)與Ti質(zhì)粒的T-DNA十分相似：①T區(qū)的左右邊界序列。左右邊界上含有25bp的重復(fù)序列。②TL-DNA區(qū)。該區(qū)中含有與毛狀根形成有關(guān)的rolA、B、C、D基因群。③TR-DNA區(qū)。該區(qū)中含有與農(nóng)桿堿合成有關(guān)的基因（ags）和生長(zhǎng)素合成有關(guān)的基因（tms1、

tms2）。ags基因在轉(zhuǎn)化的初期起著重要的作用，是不定根產(chǎn)生的關(guān)鍵Ri質(zhì)粒T區(qū)與Ti質(zhì)粒的T-DNA十分相似：Ri質(zhì)粒94基因工程載體人工染色體載體課件95基因工程載體人工染色體載體課件96CaMV克隆載體含1個(gè)約8kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子；用于十字花科和少數(shù)非十字花科的植物基因轉(zhuǎn)移；其感染對(duì)植物有害，不能直接做載體；CaMV的DNA在植物細(xì)胞中能高水平轉(zhuǎn)錄35SRNA，其啟動(dòng)子是一強(qiáng)啟動(dòng)子。構(gòu)建的含35S啟動(dòng)子的系列克隆載體可在植物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)基因。CaMV克隆載體含1個(gè)約8kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子；97基因工程載體人工染色體載體課件98三、動(dòng)物載體三、動(dòng)物載體99質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動(dòng)物的病毒可改造用作動(dòng)物細(xì)胞的載體。由于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時(shí)一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來(lái)序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。目前病毒載體常用者有改造來(lái)自猴腎病毒SV40（SimianVirus40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或試驗(yàn)其功能、或作基因治療等。

質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核D100猴病毒40（SV40）的基因組常用來(lái)作為克隆載體，把外源DNA轉(zhuǎn)入哺乳類細(xì)胞。猴病毒40是球形動(dòng)物病毒，直徑40nm，呈20面體，有一個(gè)共價(jià)閉環(huán)的雙鏈DNA基因組，全長(zhǎng)5244bp。它在猴腎中增殖。被SV40感染的細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)SV40的T抗原。早已證明完整的小鼠染色體β珠蛋白基因（包括所有的間插順序和兩側(cè)順序）整合在SV40中后，在被感染的猴腎細(xì)胞中都能正確地轉(zhuǎn)錄和翻譯。表明猴腎細(xì)胞的拼接系統(tǒng)能有效地處理小鼠β珠蛋白的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本。猴病毒40（SV40）的基因組常用來(lái)作為克隆載體，101Cloningvectorsofanimalcell動(dòng)物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物5243bp共價(jià)閉合環(huán)狀分子感染率高，幾乎100％寄主細(xì)胞能被感染能提供完整的真核基因轉(zhuǎn)錄所需的成分侵染性具有寄主特異性改建：野生型最多只能包裝其基因組長(zhǎng)度的1.05倍的DNA分子其他：痘苗病毒DNA作載體，表達(dá)乙肝表面抗原用家蠶的核多角體病毒表達(dá)人α-干擾素Cloningvectorsofanimalcell102SV40作為克隆載體有其局限性：①SV40基因組的晚期功能區(qū)的裂解性，不利于外源DNA的重組和表達(dá)；②早期功能區(qū)與病毒的致癌性有關(guān)，使用時(shí)有顧慮；③重組DNA片段的大小受體限制。SV40作為克隆載體有其局限性：103逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，它有三個(gè)基因：gag-編碼病毒的核心蛋白；pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env-編碼病毒的被膜糖蛋白。有的逆轉(zhuǎn)錄病毒還帶有癌基因（vonc），即有的逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用。近年來(lái)，已設(shè)計(jì)構(gòu)建成一些缺陷型病毒（defectivevirus）使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為有用的基因載體，成功地把抗藥性基因轉(zhuǎn)入了人體造血前體細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，它有三個(gè)基因：gag-編碼病毒104反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒是一類含RNA的病毒，進(jìn)入受體細(xì)胞后，RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA，通過(guò)兩端由數(shù)百bp組成的長(zhǎng)末端重復(fù)序列，整合到染色體上，成為原病毒。只要將外源目的基因組入原病毒DNA的合適克隆位點(diǎn)，就能在感染的動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒是一類含RNA的病毒，進(jìn)入受體細(xì)105Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，因此不能合成自身的外殼，但它有識(shí)別外殼蛋白進(jìn)行包裝的信號(hào)（一段尚未鑒定的DNA順序）。用這種缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒去感染某種細(xì)胞株，這種細(xì)胞株包含有輔助病毒（helpervirus）。輔助病毒能合成蛋白外殼，但缺失了識(shí)別蛋白外殼進(jìn)行包裝的信號(hào)，因此它不能包裝成病毒顆粒。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞株后，逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進(jìn)入輔助病毒的外殼蛋白，成為病毒顆粒。這時(shí)把受感染的細(xì)胞同骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)，包裝在輔助病毒外殼蛋白中的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA，進(jìn)入骨髓細(xì)胞，病毒DNA插入宿主細(xì)胞基因組，基因的活性得到表達(dá)。這時(shí)，由于骨髓細(xì)胞里面沒(méi)有輔助病毒，所以整合進(jìn)宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒，不再有外殼蛋白可供包裝，因此也就無(wú)法增殖，而只能被“陷”在宿主基因組中，通過(guò)細(xì)胞分裂而傳給下一代子細(xì)胞。Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，106分子克隆載體的選擇選擇克隆載體的幾個(gè)重要參數(shù)（1）實(shí)驗(yàn)對(duì)象（2）實(shí)驗(yàn)性質(zhì)（3）載體容量（4）合適克隆位點(diǎn)（5）載體的穩(wěn)定性（6）載體DNA制備的難易（7）外源基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特