液相色譜的分離機(jī)理及色譜柱課件

液相色譜的分離機(jī)理及色譜柱液相色譜的分離機(jī)理及色譜柱1選HPLC參數(shù)時(shí)的基本考慮溶解度-選擇流動(dòng)相的條件分子量-在樣品預(yù)處理或GPC分析時(shí)有用樣品的基質(zhì)-考慮如何前處理在基質(zhì)中樣品的含量檢測(cè)特性-有否紫外吸收?熒光?找出樣品中不同組份之間的差異摸索條件的重要線索選HPLC參數(shù)時(shí)的基本考慮溶解度-選擇流動(dòng)相的條件2極性問(wèn)題極性問(wèn)題3液相色譜的分離機(jī)理正相反相體積排除離子交換其他不同的分離模式是不同的機(jī)理液相色譜的分離機(jī)理正相4吸附色譜的分離機(jī)理隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小在色譜柱上的保留由長(zhǎng)到短吸附色譜的分離機(jī)理隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小5吸附色譜概述分離基于樣品的極性差異。洗脫次序∶一般為正相，即：極性低的先被洗脫常用的流動(dòng)相∶非極性有機(jī)溶劑，如己烷乙酸等為添加劑常用固定相∶硅膠、氧化鋁等。吸附色譜概述分離基于樣品的極性差異。6分配色譜的分離機(jī)理分配色譜的分離機(jī)理7分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用的流動(dòng)相：有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水應(yīng)用添加劑，成為離子對(duì)、離子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)反相色譜固定相多為鍵合相?分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離8鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點(diǎn)∶固定相穩(wěn)定，不易流失應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑消除硅羥基的不良影響缺點(diǎn)∶pH值不能小于3同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺9體積排除色譜的分離機(jī)理體積排除色譜的分離機(jī)理10凝膠色譜概述凝膠滲透（GPC）、凝膠過(guò)濾（GFC）分離基于分子在溶液中的體積大小洗脫次序：大分子先被洗脫流動(dòng)相不參與分離，只起溶劑作用分離效率低色譜行為容易預(yù)測(cè)凝膠色譜概述凝膠滲透（GPC）、凝膠過(guò)濾（GFC）11GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分離GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分離12液相色譜柱及分離機(jī)理的關(guān)系從色譜方法上分正相/反相離子交換分子體積排除親合從柱子類型上分分配/吸附離子交換凝膠親合液相色譜柱及分離機(jī)理的關(guān)系從色譜方法上分從柱子類型上分13液相色譜的方法開(kāi)發(fā)（二）梯度方法液相色譜的方法開(kāi)發(fā)（二）梯度方法14梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)單位時(shí)間的分離能力增加檢測(cè)靈敏度提高缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測(cè)方式柱需再生定量分析的重復(fù)性較低梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)15如不用梯度：分離不理想如不用梯度：分離不理想16梯度條件的優(yōu)化梯度條件的優(yōu)化17檢測(cè)器檢測(cè)器18對(duì)檢測(cè)器的要求高靈敏度可重現(xiàn)的設(shè)置合適的帶寬快速或可變的時(shí)間常數(shù)寬的線性響應(yīng)容易使用及保養(yǎng)自我診斷功能對(duì)檢測(cè)器的要求高靈敏度19檢測(cè)器的種類檢測(cè)器的種類20衡量檢測(cè)器的指標(biāo)靈敏度∶S=△R/△Q△R是檢測(cè)器響應(yīng)值的增量△Q是樣品量的增量噪音∶沒(méi)有樣品時(shí)檢測(cè)器的最大輸出信號(hào)漂移∶檢測(cè)器在一段時(shí)間內(nèi)響應(yīng)值的變化線性動(dòng)態(tài)范圍∶最大線性相應(yīng)與最小檢出限之比最小檢測(cè)限∶樣品產(chǎn)生兩或三倍于噪音信號(hào)時(shí)的濃度信噪比∶S/N注意∶最小檢測(cè)限不是一個(gè)單純的檢測(cè)器指標(biāo)。它實(shí)際上是評(píng)價(jià)整個(gè)色譜系統(tǒng)的指標(biāo)，包括了色譜系統(tǒng)、分離機(jī)理、色譜柱在內(nèi)的綜合性指標(biāo)，信噪比亦如此衡量檢測(cè)器的指標(biāo)靈敏度∶S=△R/△Q21紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器基于樣品池(S)中的樣品對(duì)光產(chǎn)生吸收，有信號(hào)差如是可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，還有分光系統(tǒng)(光珊)紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器基于樣品池(S)中的樣品對(duì)光產(chǎn)生吸收，有信22Beer'sLaw-BEER定律光能量∶P0=透過(guò)溶劑的光能量P=透過(guò)樣品的光能量光通量(透過(guò)率%)∶T=P/P0吸光度∶A=-log(T)=log(P0/P)吸光度=單位吸光度×流動(dòng)池長(zhǎng)度×溶液濃度即∶A=abcBeer'sLaw-BEER定律光能量∶23同紫外檢測(cè)器靈敏度有關(guān)的因素信號(hào)強(qiáng)度(S)從BEER定律可看出樣品的種類樣品濃度及進(jìn)樣的體積檢測(cè)池的長(zhǎng)度所使用的波長(zhǎng)，檢測(cè)器的

時(shí)間常數(shù)噪音(N)流動(dòng)相所使用的波長(zhǎng)，燈的能量檢測(cè)器的時(shí)間常數(shù)非檢測(cè)器因素-電噪音，泵脈動(dòng)等同紫外檢測(cè)器靈敏度有關(guān)的因素信號(hào)強(qiáng)度(S)24紫外檢測(cè)器的溶劑影響不同種類溶劑有其截止波長(zhǎng)溶劑的質(zhì)量好壞對(duì)其截止波長(zhǎng)有影響為何溶劑質(zhì)量不好?含紫外吸收的雜質(zhì)溶解在其中的氧氣緩沖液溶質(zhì)的紫外吸收紫外檢測(cè)器的溶劑影響不同種類溶劑有其截止波長(zhǎng)25示差折光檢測(cè)器DifferentialRefractiveIndexDetector示差折光檢測(cè)器DifferentialRefractive26示差檢測(cè)器的注意事項(xiàng)不能做梯度實(shí)驗(yàn)最大的池耐壓是100psi流速范圍是0.3-10ml/min.示差檢測(cè)器的注意事項(xiàng)不能做梯度實(shí)驗(yàn)27液相色譜的定性及定量技術(shù)液相色譜的定性及定量技術(shù)28色譜峰定性鑒別每個(gè)色譜峰通過(guò)比較保留值(通常是保留時(shí)間)的方法，找到各色譜峰所對(duì)應(yīng)的組份大多數(shù)情況下用比較保留時(shí)間來(lái)定性 即所謂：保留時(shí)間相同，可能是同樣的組份保留時(shí)間不同，肯定不是同樣的組份色譜峰定性鑒別每個(gè)色譜峰29用保留時(shí)間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測(cè)組份的位置用保留時(shí)間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測(cè)組份的位置30進(jìn)一步的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)加入同時(shí)用其他方法其他色譜方法（改變機(jī)理，如：用不同的色譜柱）其他檢測(cè)器PDA，光譜圖比較、譜庫(kù)檢索MS，質(zhì)譜圖解析、譜庫(kù)檢索其他儀器方法進(jìn)一步的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)加入31定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類型，主要成分/痕量成分使分析條件的分離度（R）大于：1.5色譜峰的定性，峰一致性測(cè)定檢測(cè)限及定量限：確定靈敏度及線性范圍用標(biāo)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢查方法的準(zhǔn)確度及精確度用標(biāo)樣定期檢查方法定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類型，主要成分/痕量成分32痕量分析如信/噪比不夠，定量的精確度會(huì)受影響，因此要：分析前濃縮樣品選擇高靈敏度檢測(cè)器用衍生法使色譜體系最優(yōu)化使用短的微徑柱（減少樣品的稀釋）使用高效色譜柱使k'值盡可能小增加進(jìn)樣體積和濃度使用低流速（N增加）采用梯度淋洗痕量分析如信/噪比不夠，定量的精確度會(huì)受影響，因此要：33常用的定量方法峰面積百分比法由于檢測(cè)技術(shù)的影響，在液相色譜中不常用外標(biāo)法在液相色譜中用的最多內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確，但是麻煩在標(biāo)準(zhǔn)方法中用的最多常用的定量方法峰面積百分比法34外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣35外標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線36外標(biāo)法定量（三）計(jì)算公式特點(diǎn)無(wú)需各組份都被檢出、洗脫需要標(biāo)樣標(biāo)樣及樣品測(cè)定的條件要一致進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確外標(biāo)法定量（三）計(jì)算公式37內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣38內(nèi)標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線39內(nèi)標(biāo)法定量（三）計(jì)算公式：特點(diǎn)：無(wú)需各組份都被檢出、洗脫需要標(biāo)樣，需要內(nèi)標(biāo)樣結(jié)果與進(jìn)樣體積無(wú)關(guān)內(nèi)標(biāo)法定量（三）計(jì)算公式：40內(nèi)標(biāo)法定量（四）對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測(cè)組分相似(同系物、異構(gòu)體)在樣品中不存在不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)保留值與待測(cè)組分接近濃度（響應(yīng)值）與待測(cè)組分相當(dāng)其色譜峰與其他色譜峰分離好內(nèi)標(biāo)法定量（四）對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求41峰面積百分比法定量公式：特點(diǎn)：各組分要全部流出、全部被檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)器的響應(yīng)值一樣簡(jiǎn)單，液相色譜目前很難做到這點(diǎn)與進(jìn)樣量無(wú)關(guān)不需標(biāo)樣簡(jiǎn)單峰面積百分比法定量公式：42可接收的檢測(cè)范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，高或低于這些點(diǎn)都可能引起計(jì)算錯(cuò)誤可接收的檢測(cè)范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，43定量校正曲線曲線A：因在零濃度時(shí)仍有色譜峰，

可能有雜質(zhì)未分開(kāi)曲線B：在此濃度內(nèi)，檢測(cè)器的響應(yīng)

值是非線性的曲線C：可接受的理想狀態(tài)，實(shí)際情

況應(yīng)是∶其延長(zhǎng)線到零點(diǎn)曲線D：表明有樣品的損失，可能是色譜柱的非特征吸附，也可能是樣品制備時(shí)的損失定量校正曲線曲線A：44高效液相色譜儀的使用、保養(yǎng)

及注意事項(xiàng)高效液相色譜儀的使用、保養(yǎng)

及注意事45色譜柱的使用及保養(yǎng)流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換特別是GPC柱流速(壓力)的變化幅度溫度的變化幅度專用色譜柱∶樣品及溶劑的要求色譜柱的使用及保養(yǎng)流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換46色譜柱的清洗對(duì)所做的樣品要有充分的了解用對(duì)該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動(dòng)相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗色譜柱的清洗對(duì)所做的樣品要有充分的了解47色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、鹽合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機(jī)械震動(dòng)防止細(xì)菌生長(zhǎng)注意存放的溫度色譜柱的存放存放前的處理48在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)除去樣品及流動(dòng)相中的顆粒給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù)防止分析柱被化學(xué)污染裝置在線過(guò)濾器自裝填料保護(hù)柱預(yù)裝保護(hù)柱在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)49在線過(guò)濾器防止顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點(diǎn)：基本不影響柱效保護(hù)柱可避免化學(xué)污染。在線過(guò)濾器50色譜泵的保養(yǎng)流動(dòng)相要過(guò)濾常用緩沖液時(shí)，停泵前要用水沖洗，并用水沖洗柱塞桿清洗孔擰緊排液閥時(shí)，不要太用力，以不滲液為準(zhǔn)更換流動(dòng)相時(shí)，要保證兩種溶劑的互溶性如不互溶，要用一種中間溶劑過(guò)渡，要防止沉淀進(jìn)液處的砂芯過(guò)濾頭要經(jīng)常清洗；避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染；色譜泵的保養(yǎng)流動(dòng)相要過(guò)濾51紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時(shí)，打開(kāi)檢測(cè)器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測(cè)器。紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時(shí)，打開(kāi)檢測(cè)器；在分析52流動(dòng)相方面

除去微粒純度的要求超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的比例流動(dòng)相方面

除去微粒53對(duì)流動(dòng)相的要求:除色譜柱對(duì)流動(dòng)相對(duì)的要求外，還有∶與檢測(cè)器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細(xì)菌的生長(zhǎng)流動(dòng)相及樣品的預(yù)處理

對(duì)流動(dòng)相的要求:除色譜柱對(duì)流動(dòng)相對(duì)的要求外，還有∶流動(dòng)相及樣54流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測(cè)的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相脫氣的目的55流動(dòng)相脫氣的方法加熱簡(jiǎn)單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動(dòng)相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲波簡(jiǎn)單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度脫氣機(jī)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度流動(dòng)相脫氣的方法加熱56樣品方面除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流動(dòng)相中的溶解度如樣品的溶劑不是流動(dòng)相，一定要用流動(dòng)相試溶解度，防止其在流動(dòng)相中析出了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用樣品方面除去微粒及雜質(zhì)57樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測(cè)的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于色譜柱及儀器的保護(hù)樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的58樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時(shí)間的比例樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離的時(shí)間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素

是決定性的步驟樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時(shí)間的比例59樣品預(yù)處理常用的方法高速離心過(guò)濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-固萃取/液-液萃取Sep-Pak樣品處理小柱其他樣品預(yù)處理常用的方法高速離心60去除微粒過(guò)濾過(guò)濾膜/過(guò)濾裝置有機(jī)(0.5m)/無(wú)機(jī)(0.45m)膜片可更換一次性使用的膜“Cartridge”使用方便簡(jiǎn)單，交叉污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000g去除微粒過(guò)濾61進(jìn)樣的注意事項(xiàng)手柄處于Load和Inject之間時(shí)，由于暫時(shí)堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位，過(guò)高的壓力在柱頭上引起損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動(dòng)閥，不能停留在中途。在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。進(jìn)樣的注意事項(xiàng)手柄處于Load和Inject之間時(shí)，由于暫時(shí)62HPLC用水可以通過(guò)以下幾個(gè)方面來(lái)得到：1專門(mén)的純水機(jī)或超純水機(jī)；2去離子水重蒸；3二次或三次重蒸水；4采用類似家用的純水機(jī)；5市場(chǎng)上瓶裝的純凈水或蒸餾水；6其它途徑；HPLC用水可以通過(guò)以下幾個(gè)方面來(lái)得到：1專門(mén)的純水機(jī)或超63常用緩沖液及其pH值常用緩沖液及其pH值64洗針溶劑的注意事項(xiàng)洗針溶劑根據(jù)流動(dòng)相的不同應(yīng)有不同：洗針溶劑的注意事項(xiàng)洗針溶劑根據(jù)流動(dòng)相的不同應(yīng)有不同65液相色譜的分離機(jī)理及色譜柱液相色譜的分離機(jī)理及色譜柱66選HPLC參數(shù)時(shí)的基本考慮溶解度-選擇流動(dòng)相的條件分子量-在樣品預(yù)處理或GPC分析時(shí)有用樣品的基質(zhì)-考慮如何前處理在基質(zhì)中樣品的含量檢測(cè)特性-有否紫外吸收?熒光?找出樣品中不同組份之間的差異摸索條件的重要線索選HPLC參數(shù)時(shí)的基本考慮溶解度-選擇流動(dòng)相的條件67極性問(wèn)題極性問(wèn)題68液相色譜的分離機(jī)理正相反相體積排除離子交換其他不同的分離模式是不同的機(jī)理液相色譜的分離機(jī)理正相69吸附色譜的分離機(jī)理隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小在色譜柱上的保留由長(zhǎng)到短吸附色譜的分離機(jī)理隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小70吸附色譜概述分離基于樣品的極性差異。洗脫次序∶一般為正相，即：極性低的先被洗脫常用的流動(dòng)相∶非極性有機(jī)溶劑，如己烷乙酸等為添加劑常用固定相∶硅膠、氧化鋁等。吸附色譜概述分離基于樣品的極性差異。71分配色譜的分離機(jī)理分配色譜的分離機(jī)理72分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用的流動(dòng)相：有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水應(yīng)用添加劑，成為離子對(duì)、離子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)反相色譜固定相多為鍵合相?分配色譜概述反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離73鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點(diǎn)∶固定相穩(wěn)定，不易流失應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑消除硅羥基的不良影響缺點(diǎn)∶pH值不能小于3同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺74體積排除色譜的分離機(jī)理體積排除色譜的分離機(jī)理75凝膠色譜概述凝膠滲透（GPC）、凝膠過(guò)濾（GFC）分離基于分子在溶液中的體積大小洗脫次序：大分子先被洗脫流動(dòng)相不參與分離，只起溶劑作用分離效率低色譜行為容易預(yù)測(cè)凝膠色譜概述凝膠滲透（GPC）、凝膠過(guò)濾（GFC）76GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分離GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分離77液相色譜柱及分離機(jī)理的關(guān)系從色譜方法上分正相/反相離子交換分子體積排除親合從柱子類型上分分配/吸附離子交換凝膠親合液相色譜柱及分離機(jī)理的關(guān)系從色譜方法上分從柱子類型上分78液相色譜的方法開(kāi)發(fā)（二）梯度方法液相色譜的方法開(kāi)發(fā)（二）梯度方法79梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)單位時(shí)間的分離能力增加檢測(cè)靈敏度提高缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測(cè)方式柱需再生定量分析的重復(fù)性較低梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)80如不用梯度：分離不理想如不用梯度：分離不理想81梯度條件的優(yōu)化梯度條件的優(yōu)化82檢測(cè)器檢測(cè)器83對(duì)檢測(cè)器的要求高靈敏度可重現(xiàn)的設(shè)置合適的帶寬快速或可變的時(shí)間常數(shù)寬的線性響應(yīng)容易使用及保養(yǎng)自我診斷功能對(duì)檢測(cè)器的要求高靈敏度84檢測(cè)器的種類檢測(cè)器的種類85衡量檢測(cè)器的指標(biāo)靈敏度∶S=△R/△Q△R是檢測(cè)器響應(yīng)值的增量△Q是樣品量的增量噪音∶沒(méi)有樣品時(shí)檢測(cè)器的最大輸出信號(hào)漂移∶檢測(cè)器在一段時(shí)間內(nèi)響應(yīng)值的變化線性動(dòng)態(tài)范圍∶最大線性相應(yīng)與最小檢出限之比最小檢測(cè)限∶樣品產(chǎn)生兩或三倍于噪音信號(hào)時(shí)的濃度信噪比∶S/N注意∶最小檢測(cè)限不是一個(gè)單純的檢測(cè)器指標(biāo)。它實(shí)際上是評(píng)價(jià)整個(gè)色譜系統(tǒng)的指標(biāo)，包括了色譜系統(tǒng)、分離機(jī)理、色譜柱在內(nèi)的綜合性指標(biāo)，信噪比亦如此衡量檢測(cè)器的指標(biāo)靈敏度∶S=△R/△Q86紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器基于樣品池(S)中的樣品對(duì)光產(chǎn)生吸收，有信號(hào)差如是可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，還有分光系統(tǒng)(光珊)紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器基于樣品池(S)中的樣品對(duì)光產(chǎn)生吸收，有信87Beer'sLaw-BEER定律光能量∶P0=透過(guò)溶劑的光能量P=透過(guò)樣品的光能量光通量(透過(guò)率%)∶T=P/P0吸光度∶A=-log(T)=log(P0/P)吸光度=單位吸光度×流動(dòng)池長(zhǎng)度×溶液濃度即∶A=abcBeer'sLaw-BEER定律光能量∶88同紫外檢測(cè)器靈敏度有關(guān)的因素信號(hào)強(qiáng)度(S)從BEER定律可看出樣品的種類樣品濃度及進(jìn)樣的體積檢測(cè)池的長(zhǎng)度所使用的波長(zhǎng)，檢測(cè)器的

時(shí)間常數(shù)噪音(N)流動(dòng)相所使用的波長(zhǎng)，燈的能量檢測(cè)器的時(shí)間常數(shù)非檢測(cè)器因素-電噪音，泵脈動(dòng)等同紫外檢測(cè)器靈敏度有關(guān)的因素信號(hào)強(qiáng)度(S)89紫外檢測(cè)器的溶劑影響不同種類溶劑有其截止波長(zhǎng)溶劑的質(zhì)量好壞對(duì)其截止波長(zhǎng)有影響為何溶劑質(zhì)量不好?含紫外吸收的雜質(zhì)溶解在其中的氧氣緩沖液溶質(zhì)的紫外吸收紫外檢測(cè)器的溶劑影響不同種類溶劑有其截止波長(zhǎng)90示差折光檢測(cè)器DifferentialRefractiveIndexDetector示差折光檢測(cè)器DifferentialRefractive91示差檢測(cè)器的注意事項(xiàng)不能做梯度實(shí)驗(yàn)最大的池耐壓是100psi流速范圍是0.3-10ml/min.示差檢測(cè)器的注意事項(xiàng)不能做梯度實(shí)驗(yàn)92液相色譜的定性及定量技術(shù)液相色譜的定性及定量技術(shù)93色譜峰定性鑒別每個(gè)色譜峰通過(guò)比較保留值(通常是保留時(shí)間)的方法，找到各色譜峰所對(duì)應(yīng)的組份大多數(shù)情況下用比較保留時(shí)間來(lái)定性 即所謂：保留時(shí)間相同，可能是同樣的組份保留時(shí)間不同，肯定不是同樣的組份色譜峰定性鑒別每個(gè)色譜峰94用保留時(shí)間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測(cè)組份的位置用保留時(shí)間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測(cè)組份的位置95進(jìn)一步的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)加入同時(shí)用其他方法其他色譜方法（改變機(jī)理，如：用不同的色譜柱）其他檢測(cè)器PDA，光譜圖比較、譜庫(kù)檢索MS，質(zhì)譜圖解析、譜庫(kù)檢索其他儀器方法進(jìn)一步的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)加入96定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類型，主要成分/痕量成分使分析條件的分離度（R）大于：1.5色譜峰的定性，峰一致性測(cè)定檢測(cè)限及定量限：確定靈敏度及線性范圍用標(biāo)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢查方法的準(zhǔn)確度及精確度用標(biāo)樣定期檢查方法定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類型，主要成分/痕量成分97痕量分析如信/噪比不夠，定量的精確度會(huì)受影響，因此要：分析前濃縮樣品選擇高靈敏度檢測(cè)器用衍生法使色譜體系最優(yōu)化使用短的微徑柱（減少樣品的稀釋）使用高效色譜柱使k'值盡可能小增加進(jìn)樣體積和濃度使用低流速（N增加）采用梯度淋洗痕量分析如信/噪比不夠，定量的精確度會(huì)受影響，因此要：98常用的定量方法峰面積百分比法由于檢測(cè)技術(shù)的影響，在液相色譜中不常用外標(biāo)法在液相色譜中用的最多內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確，但是麻煩在標(biāo)準(zhǔn)方法中用的最多常用的定量方法峰面積百分比法99外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣100外標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線101外標(biāo)法定量（三）計(jì)算公式特點(diǎn)無(wú)需各組份都被檢出、洗脫需要標(biāo)樣標(biāo)樣及樣品測(cè)定的條件要一致進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確外標(biāo)法定量（三）計(jì)算公式102內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣103內(nèi)標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線104內(nèi)標(biāo)法定量（三）計(jì)算公式：特點(diǎn)：無(wú)需各組份都被檢出、洗脫需要標(biāo)樣，需要內(nèi)標(biāo)樣結(jié)果與進(jìn)樣體積無(wú)關(guān)內(nèi)標(biāo)法定量（三）計(jì)算公式：105內(nèi)標(biāo)法定量（四）對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測(cè)組分相似(同系物、異構(gòu)體)在樣品中不存在不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)保留值與待測(cè)組分接近濃度（響應(yīng)值）與待測(cè)組分相當(dāng)其色譜峰與其他色譜峰分離好內(nèi)標(biāo)法定量（四）對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求106峰面積百分比法定量公式：特點(diǎn)：各組分要全部流出、全部被檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)器的響應(yīng)值一樣簡(jiǎn)單，液相色譜目前很難做到這點(diǎn)與進(jìn)樣量無(wú)關(guān)不需標(biāo)樣簡(jiǎn)單峰面積百分比法定量公式：107可接收的檢測(cè)范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，高或低于這些點(diǎn)都可能引起計(jì)算錯(cuò)誤可接收的檢測(cè)范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，108定量校正曲線曲線A：因在零濃度時(shí)仍有色譜峰，

可能有雜質(zhì)未分開(kāi)曲線B：在此濃度內(nèi)，檢測(cè)器的響應(yīng)

值是非線性的曲線C：可接受的理想狀態(tài)，實(shí)際情

況應(yīng)是∶其延長(zhǎng)線到零點(diǎn)曲線D：表明有樣品的損失，可能是色譜柱的非特征吸附，也可能是樣品制備時(shí)的損失定量校正曲線曲線A：109高效液相色譜儀的使用、保養(yǎng)

及注意事項(xiàng)高效液相色譜儀的使用、保養(yǎng)

及注意事110色譜柱的使用及保養(yǎng)流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換特別是GPC柱流速(壓力)的變化幅度溫度的變化幅度專用色譜柱∶樣品及溶劑的要求色譜柱的使用及保養(yǎng)流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換111色譜柱的清洗對(duì)所做的樣品要有充分的了解用對(duì)該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動(dòng)相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗色譜柱的清洗對(duì)所做的樣品要有充分的了解112色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、鹽合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機(jī)械震動(dòng)防止細(xì)菌生長(zhǎng)注意存放的溫度色譜柱的存放存放前的處理113在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)除去樣品及流動(dòng)相中的顆粒給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù)防止分析柱被化學(xué)污染裝置在線過(guò)濾器自裝填料保護(hù)柱預(yù)裝保護(hù)柱在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)114在線過(guò)濾器防止顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點(diǎn)：基本不影響柱效保護(hù)柱可避免化學(xué)污染。在線過(guò)濾器115色譜泵的保養(yǎng)流動(dòng)相要過(guò)濾常用緩沖液時(shí)，停泵前要用水沖洗，并用水沖洗柱塞桿清洗孔擰緊排液閥時(shí)，不要太用力，以不滲液為準(zhǔn)更換流動(dòng)相時(shí)，要保證兩種溶劑的互溶性如不互溶，要用一種中間溶劑過(guò)渡，要防止沉淀進(jìn)液處的砂芯過(guò)濾頭要經(jīng)常清洗；避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染；色譜泵的保養(yǎng)流動(dòng)相要過(guò)濾116紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時(shí)，打開(kāi)檢測(cè)器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測(cè)器。紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時(shí)，打開(kāi)檢測(cè)器；在分析117流動(dòng)相方面

除去微粒純度的要求超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的比例流動(dòng)相方面

除去微粒118對(duì)流動(dòng)相的要求:除色譜柱對(duì)流動(dòng)相對(duì)的要求外，還有∶與檢測(cè)器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細(xì)菌的生長(zhǎng)流動(dòng)相及樣品的預(yù)處理

對(duì)流動(dòng)相的要求:除色譜柱對(duì)流動(dòng)相對(duì)的要求外，還有∶流動(dòng)相及樣119流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小